黃果茄中綠原酸超聲輔助提取工藝優化及抗氧化活性

郭蒙　郭純　蔣青　高林曉

關鍵詞：黃果茄；綠原酸；超聲波輔助提取工藝；工藝優化；抗氧化活性

中圖分類號：R284 文獻標識碼：A

黃果茄系茄科茄屬直立草本植物，在我國星散分布于貴州、四川、臺灣等地，而國外也可見于其他熱帶亞洲、大洋洲以及非洲等地[1]。一直以來，中外科研人員對黃果茄的研究非常重視，近年的研究主要集中在成分、藥理等方面，展現出一定的經濟開發價值。XU 等[2]從黃果茄果中分離出2 個具有16，17-仲膽甾烷骨架的甾體皂苷，而刁克鵬等[3]從其果中分離出黃酮（6 個）、酰胺（4 個）、香豆素（2 個）等12 個單體，其中5-羥基-8-甲氧基-6，7-亞甲二氧基黃酮為未見報道的化合物。CHAUDHARY 等[4]用高效薄層色譜法（high-performance lamina liquid chromatography，HPTLC）分別對黃果茄根、莖、果中的茄定堿和薯蕷皂苷元同時進行定量分析，以幫助草藥的質量控制。李學玲等[5]研究發現，用氣質聯用分析鑒定出黃果茄果的揮發性物質22 種，其中醛酮類、脂類為主要成分，分別為51.03%、32.70%，而在最優化條件下，總黃酮提取率可達4.35%，并對清除DPPH·、·OH 均展現出較好的效果[6]，此外，SHIVNATH 等[7]發現黃果茄果醇提取物可通過促進軟骨細胞生存和增殖來改善骨關節炎。USMAN 等[8]研究發現咖啡酸、咖啡酸甲酯、東莨菪堿、七葉苷等次生代謝物具有抗糖尿病、抗衰老等性能。GUPTA 等[9]發現，黃果茄果中分離出的槲皮素能夠提供更好的肝臟防御作用，從而可預防肝毒性。NATARAJAN 等[10]報道，黃果茄的甲醇提取物能夠治療微生物傷口感染，并有成為抗菌劑的潛力，尤其對科氏葡萄球菌菌株更有效。CHOUDHARY 等[11]和REDDY 等[12]分別發現黃果茄全株的水和脂提物具有免疫抑制、抗癌等的特性。ZAMAN 等[13]利用黃果茄果樣品顆粒作為吸附劑直接從水溶液中去除亞甲藍，吸附能力可達到0.051 mmol/g。此外，李學玲等[14]用水提法優化了黃果茄果中綠原酸的提取工藝，提取率為0.28%。

綠原酸廣泛存在于雙子葉植物中藥材或食物中[15]，具有抗氧化、抗菌等藥理作用[16-17]，目前仍需要拓寬綠原酸的新來源[18-19]。綠原酸的化學提取主要有水提、醇提、酶提等方法，尤其超聲輔助醇提法的綠原酸具有更加穩定、收率高和溶劑易回收等特性[20]，本研究擬用超聲輔助醇提取黃果茄中綠原酸。此外，高效的單因素實驗僅能得出較粗略的參數范圍，而正交試驗設計并不能明確回歸方程，因此，通過響應面法建模，以期得到更加準確的工藝條件[21]，為其今后的工業開發提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 材料與試劑 成熟的黃果茄果實采自貴州都勻。

綠原酸標準品（純度≥98%），維生素C 標準品（Vc，純度≥98%，合肥博美生物科技公司），1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH，純度≥98%），2，2-連氮基-雙-（3-乙基苯并二氫噻唑啉-6-磺酸）（ABTS，純度≥99%，合肥巴斯夫生物科技有限公司），過硫酸鉀（分析純，北京化工廠有限責任公司）；無水乙醇（分析純，成都金山化學試劑有限公司）。

1.1.2 儀器與設備 T6 新世紀紫外可見分光光度計購于北京普析通用儀器有限公司；AR224CN電子天平購于奧豪斯儀器公司；KH2200DE 數控超聲波清洗器購于昆山禾創超聲儀器公司；80-1電動離心機購于金壇市城東新瑞儀器廠。

1.2 方法

1.2.1 綠原酸標準曲線制作 稱取綠原酸標準品0.0010 g，適量乙醇溶解后，轉移至100 mL 容量瓶定容，得到濃度為0.1 mg/mL 溶液。準確移取0.20、0.50、1.00、1.50、2.00、2.50、3.00 mL 的標準溶液分別于7 個容量瓶（10 mL）中，純乙醇定容，靜置15 min。純乙醇作空白對照，在波長為328 nm 下分別測吸光度A 值[19， 22]。以綠原酸樣品濃度C 與吸光度A 繪制標準曲線圖，得到二者關系：A=48.1297C–0.0107（R²=0.9941）。

1.2.2 黃果茄果綠原酸提取流程 常規流程如下：樣品→自然晾曬→烘箱烘干→粉碎、過篩→超聲乙醇提取→離心→綠原酸醇提液。

將干燥的黃果茄果粉碎成末，過孔徑40 目篩，得樣品粉末。稱0.25 g 粉末置于具塞比色管中，后以擬定工藝參數提取（定100 W 超聲功率），自然冷卻至室溫，離心，取上清液，即為樣品醇提液。

1.2.3 黃果茄果綠原酸的測定 取超聲后的樣品醇提液0.5 mL，用純乙醇定容至10 mL，靜置15 min，在波長為328 nm 下測吸光度，代入上述回歸方程，進一步計算，即可得到綠原酸提取率。

1.2.4 單因素實驗設計 單因素實驗工藝參數設計見表1。

1.2.5 Box-Behnken 響應面實驗設計 據上述實驗結果，設計Box-Behnken 響應面實驗，見表2。

1.2.6 DPPH 自由基清除能力 最佳工藝條件下黃果茄果醇提物和Vc 用無水乙醇配制成不同濃度的待測液，并用無水乙醇配制0.20 mmol/LDPPH 溶液[23]。取2 mL DPPH 溶液與2 mL 無水乙醇或不同濃度的2 mL 待測液避光混合，37 ℃水浴保持30 min，517 nm 處測吸光度，分別記為A₁和A₂。DPPH 清除率計算公式：

DPPH 清除率=（A₁– A₂）/A2×100%

1.3 數據處理

所有試驗均重復2 次，試驗數據以平均值±標準差表示。采用Design expert V8 軟件進行響應面設計和分析，采用Excel 軟件進行數據統計分析。

2 結果與分析

2.1 單因素實驗

2.1.1 乙醇濃度對黃果茄綠原酸得率的影響 圖1 結果表明，乙醇濃度低于35%時，提取的綠原酸量增加幅度相對較小，最終穩定在1.79%左右。這表明，水含量較多時不利于目標產物綠原酸的提取。隨著乙醇濃度逐漸增加到65%，綠原酸提取率迅速增加到最大值3.50%。因此，后續實驗將擬定乙醇濃度在65%。但是，乙醇濃度繼續增加，反而會抑制綠原酸提取，原因可能是溶劑的低極性會致使強親脂性等物質的溶出減少[25]。

2.1.2 液料比對黃果茄綠原酸得率的影響 圖2結果顯示，綠原酸提取率隨著液料比的增加呈逐漸增大的趨勢，并在50 mL/g 附近得到最佳值（約4.57%），與液料比為10 mL/g 時的綠原酸提取率相比，提取率值增加了約2 倍。而在液料比60 mL/g附近的目標物提取率略微降低，其原因可能是液料比過大導致黃果茄醇提取物增加了一些難溶物，為了后續實驗節省成本等原因，后續實驗選取液料比的最適宜值為50 mL/g[18]。

2.1.3 超聲時間對黃果茄綠原酸得率的影響 由圖3 可知，提取時間較短或較長均不利于黃果茄綠原酸的提取，最適合的時間值為60 min。提取時間較短時，綠原酸顯然不能夠充分溶出，而提取時間較長時，樣品中可能會溶出更多的非目標物，影響到目標物的穩定。最終選定最佳時間為60 min[20]。

2.1.4 超聲溫度對黃果茄綠原酸得率的影響 由圖4 可知，較低的超聲溫度不能夠保證足夠多的黃果茄綠原酸克服其周圍的環境阻力而溶出[26]，從而導致綠原酸提取率相對較低，而較高的溫度也會抑制綠原酸提取。溫度適當時，傳質擴散系數的增加會明顯增加提取效率，在40 ℃時可以得到最優化的提取率值。

2.2 響應面分析實驗

以黃果茄綠原酸的提取率為評價指標，Box-Behnken 實驗結果及分析見表3、表4，而由Design Expert V11 可以得到二次多元回歸方程：Y=–225.05+4.93α+1.15β+0.75γ+0.94δ–3.75×10^–3αβ+2.50×10^–4αγ+1.30×10^–3αδ–5.08×10^–3βγ–1.75×10^–4βδ–5.25×10^–4γδ–0.04α²–5.56×10^–3β²–4.09×10^–3γ²–0.01δ2，R²為0.9967。

由表4 可知，F 值為303.35，P<0.0001，說明本實驗模型達到了極顯著水平；失擬項P 為0.1115>0.05，說明此項不顯著。因此，選擇實驗模型成功，其預測性好、誤差較小，可進行進一步的操作。一次項β、δ 和二次項α²、β²、γ²、δ²及交互項αβ、βγ 等8 項對響應值影響極顯著，而其他項均不顯著。由比較F 值可知，響應增加的順序為：乙醇濃度<超聲時間<超聲溫度<液料比。

黃果茄中綠原酸提取率的響應面和交互作用見圖5。交互項αβ、βδ 等2 項呈現出橢圓形，響應面坡度較陡，交互作用大，但其他4 項的響應面圖坡度較緩，交互作用不顯著。

2.3 優化與驗證試驗

通過響應面方程得到最佳工藝參數（64.7%乙醇濃度、55.8 mL/g 液料比、56.0 ℃超聲40.5 min）下目標產物的提取率為6.81%。考慮到實際工業生產的可操作性，將最優化條件適當調整為65%乙醇、60 mL/g 液料比、55 ℃下超聲40 min，則黃果茄綠原酸得率的3 次平均值為6.83%。此值與理論值非常接近，表明選擇的響應面條件穩定可行。

2.4 提取物體外抗氧化能力

2.4.1 DPPH 自由基清除能力 如圖6 所示，與Vc 溶液的DPPH 清除率不同，提取液的DPPH 清除率在10～60 mg/L 范圍內隨著濃度增加而增大，呈現出明顯的線性關系，且二者的IC₅₀值分別為18.4、55.7 mg/L。提取液中綠原酸等的酚羥基可提供質子，因此對清除DPPH 有一定的效果。

2.4.2 ABTS 自由基清除能力 如圖7 所示，在5～30 mg/L 測試范圍內，提取液的ABTS 清除率與其濃度線性相關性強，在提取液為30 mg/L 時，提取液的ABTS 清除率達到最大值，為65.5%。Vc 溶液和提取液的IC50 值分別為6.5、20.1 mg/L，因此Vc 溶液的清除率在測試范圍內更好一些。

3 討論

植物內次生代謝產物的綠原酸主要來源于金銀花花蕾、杜仲葉、咖啡豆等，其提取物不僅可用于日用化工和醫藥等行業[27]，還可作為新型飼料添加劑用于畜禽生產[28]。用水、乙醇或二者混合物等作為溶劑可以促進植物中綠原酸的提取，尤其添加醇水混合物提取物中的綠原酸與其天然狀態更接近，但僅添加水作溶劑，其高沸點會致使提取物雜質較多，不利于后續的純化[15]。超聲、微波和二者協同輔助作用均有利于目標物的提取，但考慮到微波參與時，高介電常數的水更有利于微波吸收，而超聲輔助能夠顯著地克服萃取時間較長、回收率較低等缺點[29]。此外，蒲公英葉和野菊花等作為綠原酸的新來源，提取率分別為3.92%和2.86%，尤其梔果中綠原酸提取率可高達5.68%[19， 30]。因此，本研究將超聲輔助醇提法應用到黃果茄果中綠原酸的提取中，單因素實驗確定液料比等因素對提取率的影響，還用響應面法建立二次回歸模型，得到最佳工藝條件，后修正的條件為65%乙醇濃度、60 mL/g 液料比、55 ℃下超聲40 min，綠原酸產率可達到6.83%。

在亞健康狀況下，人體細胞代謝產生的自由基極可能會導致身體機能下降。植物粗提物中成分較為復雜，為了初步判斷其組分或類型等對自由基清除能力的影響，本研究選用了DPPH 和ABTS 等2 種抗氧化體系來進一步評價黃果茄果醇提物的抗氧化性能[31]。黃果茄果醇提物顯然具有較好的抗氧化活性，其最佳工藝條件下提取液的DPPH 和ABTS 自由基清除能力的IC₅₀分別為55.7、20.1 mg/L。該實驗可為探索黃果茄中綠原酸的藥理作用等應用提供依據，還可為實現黃果茄中綠原酸作為藥用、保健品、畜禽生產等提供借鑒。