烘烤期煙葉霉爛病生防菌株的篩選與應用

尚海麗,楊發祥,,華小兵,郭山虎,趙崇鈞,盤文政,*,李 誠,趙學通,張 琪,肖勇飛,朱永立,張志紅,李榮海

(1.云南省微生物發酵工程研究中心有限公司,云南 昆明 650217;2.云南云葉化肥股份有限公司,云南 昆明 650217;3.湖南中煙工業有限責任公司,湖南 長沙 410014)

0 引言

【研究意義】煙葉烘烤過程中常發生烤青煙、蒸片煙、黑糟煙、掛灰煙及煙葉霉爛等“烤壞煙”,對煙葉生產和煙農造成重大損失[1-3]。其中,煙葉霉爛是由于煙葉烘烤過程中變黃期溫度過低、相對濕度過高,煙葉受病原微生物侵染引起的潛在病害,極大降低煙葉的使用價值[4-5]。因此,開展霉爛病研究,開發有效的防治措施,對減少煙農損失、提高煙葉質量具有重要的現實意義。【前人研究進展】長期以來,由病原物引起的煙葉霉爛病及其造成的損失未引起人們足夠的重視,常常被認為是“烘烤不當”所造成的[5]。目前,關于烘烤期間煙葉霉爛病防治措施的研究主要集中在優化烘烤工藝、噴施藥劑和熏蒸滅菌等方面。針對變黃期低溫高濕的狀況,丁海龍[6]研究提出稀裝煙、提前排濕及穩轉火等技術措施以控制煙葉霉爛病;黃寧等[7]探索出點火后快速升溫、縮短變黃期及降低濕度等技術措施避免煙葉的霉變;蘇家恩等[8]對比不同抗微生物制劑對烤后煙葉霉爛病的防控效果表明,天然抗微生物制劑防控效果優于化學合成抗微生物制劑,天然抗微生物制劑中0.2%納他霉素防控效果最好,達87.99%。王永棟等[9]提出,在嚴格控制裝煙密度的前提條件下,烤前、烤中采用二氧化氯熏蒸消毒,對霉爛病的總體防治效果達62.62%～69.57%。已有研究指出,在煙葉上添加優勢微生物,對煙葉中的霉菌有明顯抑制作用,可用于倉儲過程中煙葉霉變的防治[10]。經過近幾年的持續研究,逐步明確各省主要煙區烘烤期煙葉霉爛的主要病原菌是米根霉(Rhizopusoryzae)[11-13]。【研究切入點】上述技術措施防控煙葉霉爛病均有一定的局限性,通過快速升溫降低濕度控制霉爛病發生的方法,需解決變黃期縮短與烤后煙葉質量之間的矛盾;化學藥劑消毒存在安全風險;采用二氧化氯熏蒸消毒,在鮮煙葉帶菌的情況下防效不理想。生防菌具有繁殖快速、安全無毒、抑菌殺菌等特點,因此,篩選出烘烤過程中對煙葉霉爛病具有較好防控效果的生防菌,有利于科學防控煙葉霉爛病及保障煙葉質量安全。【擬解決的關鍵問題】根據以菌治菌的原理,采用共培養的方法篩選對米根霉具有明顯抑制作用的生防菌株,并結合室內和田間應用研究其防治效果,以期探明烘烤期煙葉霉爛病生防功能菌株的種類及其防治效果,為高效、安全防治煙葉霉爛病,降低烘烤損失,增加煙農收入,提高煙葉安全性提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試生防菌 15株生防菌均為耐熱芽孢桿菌,保存于云南省微生物發酵工程研究中心有限公司菌種庫。

1.1.2 供試病原菌 煙葉霉爛病病原菌米根霉,課題組前期從云南省楚雄州武定縣白路鎮發生霉爛病的煙葉中分離、純化獲得,保存于云南省微生物發酵工程研究中心有限公司菌種庫。

1.1.3 供試健康煙葉 煙葉樣品(含葉柄)采自云南省楚雄州武定縣白路鎮平地村,烤煙品種為云煙87。

1.2 方法

1.2.1 生防菌篩選 用無菌挑針挑取供試生防菌菌株,劃線接種于新鮮LB平板內,置于37℃恒溫培養箱內黑暗培養3 d。制備濃度為105cfu/mL的米根霉孢子懸浮液,并取100 μL孢子液涂布于PSA平板,置于32℃培養箱內黑暗培養5 h;然后取出平板,用無菌挑針分別挑取活化的15株生防菌單菌落分別接種于PSA平板上,置于32℃培養箱內黑暗培養;2 d后觀察平板內細菌的生長情況及是否出現抑菌圈。每個處理3次重復。

1.2.2 生物防治

1) 室內。用自來水和無菌水依次沖洗田間采集的煙柄3次,并在70%酒精中浸泡30 s后用無菌水沖洗3遍,放在超凈工作臺內自然風干(下同)。選取抑菌效果最好的菌株制備104cfu/mL的米根霉孢子懸浮液,均勻噴施在煙柄表面,待自然風干后分別置于濃度為107cfu/mL(A1)、106cfu/mL(A2)和105cfu/mL(A3)的生防菌液內浸泡10 min后取出,再次自然風干后轉入50 mL無菌燒杯內,用保鮮膜封口,再用挑針在其上扎20個小孔后置于37℃培養箱內黑暗保濕培養。每天觀察菌落生長動態,4 d后記錄各處理煙柄的發病情況。每個處理10個煙柄,3次重復。以用無菌水浸泡的煙柄作為對照(CK)。結合常規葉面病害統計方式設病情分級標準:0級,未感染;1級,發病面積占總面積的5%以下;3級,發病面積為5%～25%;5級,發病面積為25%～50%;7級,發病面積為50%～75%;9級,發病面積占總面積的75%以上。計算病情指數,發病率和相對防治效果。

發病率=發病樣本數/總樣本數×100%

病情指數=[∑(各級樣本數×相應級數)/(總樣本數×9)]×100

相對防治效果=[(對照病情指數-處理病情指數)/對照病情指數]×100%

2) 田間。在云南省楚雄州武定縣隨機選取一個自然發病烤房進行田間防治試驗。試驗烤房為普通氣流上升式4層密集式烤房,裝煙室規格為8.0 m×2.7 m×4.1 m,裝煙層距地面高度分別為1.2 m、2.0 m、2.8 m和3.6 m。制備活菌數為1.5×106cfu/mL、7.5×105cfu/mL及1.5×105cfu/mL生防菌液備用。采用浸泡葉柄和噴淋葉柄2種方式進行煙葉霉爛病防治:第1種為浸泡葉柄,將田間采集的新鮮煙葉基部(40～50 cm)分別在不同濃度生防菌液中浸泡10 min后取出,然后將煙葉在陰涼處晾干后按常規烘烤方式烘烤;第2種為噴淋葉柄,將不同濃度的生防菌液在烤煙烘烤前進行葉柄噴淋,噴淋完成后將煙葉在陰涼處晾干,然后按常規方式烘烤。以常規作對照,即不施用生防菌液,按照常規采烤方法進行烘烤。田間試驗方案設置見表1。每個處理3次重復,每個重復100片煙葉,隨機排列掛牌標記。初烤結束后,參考王永棟[12]的方法記錄發病情況,并計算病情指數、發病率和相對防效。煙葉霉爛病病情等級劃分:0級,正常煙葉;1級,煙稈發霉小于1 cm,葉片不發病;2級,煙稈發霉大于1 cm,葉片不發病;3級,煙稈發霉,且葉片發霉面積達1%～25%;4級,煙稈發霉,且葉片發霉面積達26%～50%;5級,煙稈發霉,且葉片發霉面積達50%以上。

發病率=發病葉數/調查總葉數×100%

病情指數=[∑(各級病葉數×相應級數)/(調查總葉數×5)]×100

相對防治效果=[(對照組病情指數-處理組病情指數)/對照組病情指數]×100%

表1 田間試驗處理設置Table 1 Treatment design for the field test

1.3 數據統計與分析

采用Excel 2016整理相關數據,采用SPSS 22.0進行單因素方差分析,各處理間采用Duncan's新復極差法進行顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 生防菌株的抑制效果

從表2看出,15株生防菌對米根霉的抑菌圈直徑為0.00～3.03 cm,其中,有4株菌株對米根霉有拮抗作用,其分別是解淀粉芽孢桿菌YWF-17-0001和YWF-17-0006、膠質芽孢桿菌YWF-17-0005及枯草芽孢桿菌YWF-17-0011,其抑菌圈直徑為0.94～3.03 cm,依次為YWF-17-0001>YWF-17-0011>YWF-17-0005>YWF-17-0006,以解淀粉芽孢桿菌YWF-17-0001對米根霉的抑菌效果最好,抑菌圈直徑達3.03 cm,顯著高于菌株YWF-17-0006和YWF-17-0005,與菌株YWF-17-0011差異不顯著,其余菌株間差異不顯著。解淀粉芽孢桿菌YWF-17-0001可作為備選菌株進行后續研究。

表2 不同生防菌株對米根霉的抑制效果Table 2 Inhibition effect of different biocontrol strains against R. oryzae

2.2 生防菌株對米根霉的防治效果

2.2.1 室內防效 觀察發現,在接種培養2 d后,對照(CK)煙葉的煙柄表面長出微量白色菌絲;隨培養時間的推移,霉爛病的發病情況不斷加重。各處理(A1～A3)較對照晚1 d左右發病,且米根霉的感染率大幅降低;4 d后,各處理的產孢量較對照明顯減少。從表3看出,A1～A3煙葉的發病率為0.00%～23.22%,病情指數為0.00～2.59,均表現為A3>A2>A1,且均顯著低于CK(80.00%,53.33),A1顯著低于A3和A2,A2與A3差異不顯著。A1～A3的相對防治效果為95.14%～100.00%,表現為A1>A2>A3,即隨解淀粉芽孢桿菌YWF-17-0001處理濃度降低,對米根霉的室內防治效果呈下降趨勢,當濃度為105cfu/mL時(A3)防治效果最差;當濃度達107cfu/mL時(A1),煙柄未出現霉變現象,防治效果達100.00%。表明,較低濃度的解淀粉芽孢桿菌YWF-17-0001菌液對米根霉有較好的防治效果。

表3 解淀粉芽孢桿菌YWF-17-0001對米根霉的室內防治效果Table 3 Indoor control effect of strain YWF-17-0001(B. amyloliquefaciens) against R. oryzae

2.2.2 田間防效 從表4看出,解淀粉芽孢桿菌YWF-17-0001各處理濃度對煙葉霉爛病均有較好的防治效果。發病率:隨處理濃度下降煙葉發病率呈上升趨勢,各處理的發病率為0.33%～5.00%,表現為T6>T5>T4>T3>T2>T1,其中,T1～T6煙葉的發病率均顯著低于對照(50.00%),T1～T3煙葉的發病率差異不顯著,但均顯著低于T4～T6,T4～T6差異不顯著。病情指數:隨處理濃度下降煙葉的病情指數呈上升趨勢,各處理的病情指數為0.04～0.38,表現為T6>T5>T3>T4>T2>T1,其中,T1～T6煙葉的病情指數差異均不顯著,但均顯著低于對照(21.11)。相對防治效果:各處理濃度的相對防治效果為98.20%～99.81%,表現為T1>T2>T4>T3>T5>T6,各處理間抑制作用差別較小,表明,用1.5×105cfu/mL的菌液浸泡或噴施煙柄,防治效果均超過98.00%。說明,在煙葉烘烤前,噴施或浸泡解淀粉芽孢桿菌YWF-17-0001菌液能夠有效防控烘烤期的煙草霉爛病。

表4 解淀粉芽孢桿菌YWF-17-0001對米根霉的田間防治效果 Table 4 Control effect of strain YWF-17-0001 (B. amyloliquefaciens) against R. oryzae in field

3 討論

烘烤期煙葉霉爛病的發生嚴重影響煙葉品質和經濟效益,如何進行控病減損,綠色、安全、高效地減少霉爛病的發生,也越來越得到行業的重視[14]。煙葉烘烤過程中霉菌污染主要發生在葉片變黃期,烤房內溫度36～40℃、相對濕度75%～85%時最有利于米根霉的生長[15]。利用微生物防控的原理,從變黃期的特定溫濕度條件出發,有針對性地篩選抗病、耐熱且易于定殖的微生物[16],并進行開發利用,結合烘烤工藝流程的微調整,從而實現煙葉霉爛病的生物防治,既滿足人們對綠色食品的需要,又符合農業可持續發展的需求。解淀粉芽孢桿菌[17]、枯草芽孢桿菌[18]、膠質芽孢桿菌[19]及貝萊斯芽孢桿菌[20]等對煙葉霉變菌具有較強的拮抗作用。本研究從15株生防菌株中篩選出4株能明顯抑制煙葉霉爛病病原菌米根霉生長的菌株,包括解淀粉芽孢桿菌YWF-17-0001和YWF-17-0006、膠質芽孢桿菌YWF-17-0005及枯草芽孢桿菌YWF-17-0011,其抑菌圈直徑為0.94～3.03 cm,其中,解淀粉芽孢桿菌YWF-17-0001的抑菌效果最好,室內噴施濃度為105cfu/mL及以上時對煙草霉爛病的防效達95%以上;煙葉烘烤前用YWF-17-0001菌液1.5×105～1.5×106cfu/mL噴施或浸泡煙柄,對煙葉霉爛病的防治效果達98%以上。趙文姬[17]研究也表明,解淀粉芽孢桿菌對煙葉霉變菌具有較強的抑制作用。解淀粉芽孢桿菌屬革蘭氏陽性菌,具備產生多種酶類和抗菌活性物質的能力,能夠促進生物膜形成,定殖在植物體內,與植物形成共生關系,促進植物生長,并對多種植物病原菌形成抑制作用[21];應用在煙葉烘烤過程中無毒無害,不會對煙葉品質產生不利影響,是一種綠色、安全且高效的煙葉霉爛病生物防控制劑。

煙葉烘烤過程中霉爛病對煙葉質量影響較大,采用以菌治菌是目前煙葉霉爛病防治較為綠色環保的方法,本試驗取得了初步的研究成果,但要推廣應用,菌株YWF-17-0001發酵底物篩選、發酵工藝優化及田間應用技術等有待進一步試驗,其對煙葉品質的影響也有待進一步研究。

4 結論

從15株耐熱芽孢桿菌中篩選出1株能夠明顯抑制米根霉生長的生防拮抗菌——解淀粉芽孢桿菌YWF-17-0001,其室內和田間對煙葉霉爛病的防效均達95%以上。解淀粉芽孢桿菌YWF-17-0001具有拮抗煙葉霉爛病病原菌的能力,可作為一種煙草霉爛病生物防控候選菌株進一步深入研究。