α- 酮戊二酸對豬精子獲能及抗氧化能力的影響

黃 芳，黃明光，黃 涵，張鈺欣，李芳芳，胡傳活*

1.廣西大學動物科技學院，南寧 530004；2.廣西畜禽繁育與疾病防控重點實驗室，南寧 530004；3.廣西畜牧站，南寧 530022；4.廣西大學生命科學與技術學院，南寧 530004；5.廣西壯族自治區畜禽品種改良站，南寧 530001

精子進入雌性輸卵管獲得能夠使卵子受精的能力的過程稱為精子獲能[1]。精子除了可以在體內獲能外，在體外獲能培養基中培養適當時間后也會發生獲能反應。獲能培養基中含有電解質和能量代謝產物（如葡萄糖、丙酮酸和乳酸），這些物質能夠保證精子在運動過程中所需的高ATP 消耗[2]。正常生理過程中，低水平的活性氧（ROS）能介導與精子獲能相關的信號轉導過程，如精子過度激活、獲能、頂體反應以及精子-卵母細胞結合等基本生理過程，而過量的ROS 會導致精子產生氧化應激，減少受精潛力以及配子正常胚胎發育的能力，甚至引起精子凋亡[3-4]。因此，緩解精子獲能過程中的氧化應激損傷對維持體外獲能的精子質量十分重要。

α-酮戊二酸（AKG）是三羧酸（TCA）循環中琥珀酰輔酶A 和異檸檬酸鹽之間的重要中間體，且AKG 具有良好的溶解性，不表現出毒性，其水溶液具有很高的穩定性[5]。AKG 作為無氧反應的關鍵點，可轉化為丙酮酸和乳酸，也可逆轉TCA 循環產生檸檬酸，能調節ATP 的產生，在細胞能量代謝中起著至關重要的作用。除了已知的代謝作用外，AKG也是一種潛在的抗氧化劑，在促進ATP 產生的同時減少TCA 循環中的等效（NAD+/NADH）生成，從而降低ROS 的產生，維持免疫系統的穩態[6-7]。因此，本試驗研究添加AKG 對豬獲能精子糖代謝及抗氧化能力的影響，為體外獲能試驗模型提供理論和科學依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

從廣西貴港秀博基因科技股份有限公司購買12 份性成熟長白豬精液樣品，精子濃度為4.5×107個/mL，計算機輔助精子分析系統（CASA）檢測活力不低于70%方可用于后續試驗。精子獲能培養液（BWW）購自上海吉美生物醫藥科技有限公司，精子活體染色試劑盒（伊紅-苯胺黑法）購自北京Solarbio 有限公司，CASA 系統購自法國卡蘇公司。ATP 含量、乳酸含量、總抗氧化能力（T-AOC）、超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）、丙二醛（MDA）測定試劑盒購自南京建成生物工程研究所。

1.2 精子獲能處理

按照文獻[8]所述，先將豬精液1 500 r/min 離心15 min 后棄去上清，用PBS 洗滌3 次。用BWW 獲能液重懸精子，并調整精子濃度為5×106～10×106個/mL。取1 mL 處理好的精液加入10 μL 不同濃度的AKG（5、15、30、45、60 mmol/L）混勻（獲能對照組添加相同體積的PBS）后置于5% CO2、95%空氣的培養箱中37 ℃孵育2 h。

1.3 精子活率檢測

按照說明書的操作步驟，取潔凈小試管，滴加孵育完成的精子樣本10 μL 和等量伊紅染色液，混勻放置15 s，滴加苯胺黑染色液20 μL，混勻靜置30 s。取精液-伊紅-苯胺黑染色液10 μL 于載玻片上，制成涂片。晾干、鏡檢，活精子為白色，死精子呈紅色，400 倍光學顯微鏡下觀察，計算白色精子的百分比，每個樣本至少計數200 條精子，試驗重復3 次。

1.4 精子質膜完整性檢測

根據謝運法等[9]的方法將孵育完成后的精子1 000 r/min 離心5 min，棄一部分上清，取100 μL精液置于37 ℃預熱的低滲溶液中調整精子濃度為1×106個/mL，37 ℃孵育30 min。取20 μL 懸液于載玻片上，蓋上蓋玻片，400 倍光學顯微鏡下觀察，計算尾巴卷曲的精子百分比。每個樣本至少計數200，計算條精子，試驗重復3 次。

1.5 頂體完整率檢測試劑

按照文獻[9]取100 μL 孵育完成后的精子于1 mL 3.7%多聚甲醛溶液中室溫固定30 min，PBS洗滌1 次，加入500 μL 的PBS 制成懸液，取10 μL涂片，室溫環境下自然干燥。將風干后的載玻片置于裝有考馬斯亮藍的染色缸中染色5 min。用超純水緩慢沖洗載玻片上的染色液，自然晾干后，用中性樹膠封片。400 倍光學顯微鏡下觀察精子頂體完整性（頂體呈均勻藍色，且表面光滑，輪廓清晰的精子為頂體完整的精子），至少計數200 個精子，試驗重復3 次。

1.6 精子動力學參數分析

根據文獻[10]所述方法，提前將CASA 系統的載物臺預熱至37 ℃，取2 μL 的精液緩慢滴入一次性精子計數池中，通過調節不同的視野區域觀察精子，記錄精子活力及相應運動速率，至少采集500個精子用作分析，試驗重復3 次。

研究評估的CASA 動力學參數包括：活力、曲線速度（VCL）、平均路徑速度（VAP）、直線速度（VSL）、頭部擺動幅度（ALH）、交叉運動頻率（BCF）、擺動比例（WOB）、線性運動比例（LIN）、直線運動比例（STR）。

1.7 精子ATP 含量、乳酸含量、T-AOC、SOD、CAT 活力及MDA 含量的檢測

各組精子用PBS 洗滌3 次后收集精子沉淀，按照試劑盒操作說明加入提取液，超聲破碎精子后分別加入相應的檢測液，用酶標儀和分光光度計測定精子的ATP 含量、乳酸含量、T-AOC、SOD、CAT 活力及MDA 含量。

1.8 統計分析

試驗數據采用SPSS 23.0 統計學軟件進行單因素方差分析（One-way ANOVA），以“平均值±標準差”表示，P<0.05 表示差異顯著，P>0.05 表示差異不顯著。用GraphPad Prism 8.0 軟件繪圖。

2 結果與分析

2.1 AKG 對獲能豬精子活率、頂體完整率、質膜完整性的影響

由表1 可知，與新鮮精子相比，當精子獲能后，精子的活率和質膜完整性顯著下降。與獲能對照組相比，添加不同濃度的AKG 獲能組未對精子的活率和質膜完整性產生顯著影響。新鮮精子組、獲能對照組和添加AKG 獲能組的頂體完整率之間無顯著差異。

表1 AKG 對獲能豬精子活率、頂體完整率、質膜完整性的影響（n=5） %

2.2 AKG 對獲能豬精子動力學參數的影響

如表2 所示，與新鮮精子相比，獲能后各組豬精子活力未發生顯著變化。與新鮮組相比，獲能后各組，除ALH 外，其余各項動力學參數均顯著升高。其中，BCF、LIN、STR 在獲能對照組中最高。AKG 濃度為5 mmol/L 時，WOB 最高；AKG 濃度為15 mmol/L時，VCL、VAP、VSL、ALH 最高。

表2 AKG 對獲能豬精子運動學參數的影響（n=5）

2.3 AKG 對獲能豬精子能量代謝的影響

如圖1 所示，與新鮮精子相比，獲能后各組精子的ATP 和乳酸含量顯著增加。與獲能對照組相比，AKG 濃度超過5 mmol/L 時，ATP 含量顯著增加，且AKG 濃度為15 mmol/L 時含量最高。獲能AKG 處理組的乳酸含量均顯著高于獲能對照組，且AKG 濃度為15 mmol/L 時乳酸含量最高。

圖1 AKG 對獲能豬精子能量代謝的影響

2.4 AKG 對獲能豬精子抗氧化能力的影響

本試驗最適AKG 濃度為15 mmol/L，進一步測定最適濃度處理后抗氧化指標的變化（圖2）。與新鮮精子相比，獲能對照組精子的T-AOC 和SOD 活力未出現顯著變化，CAT 活力顯著降低，而MDA 含量顯著升高。與獲能對照組相比，15 mmol/L AKG獲能組的T-AOC、SOD 活力和CAT 活力顯著增加，同時MDA 含量顯著降低。

圖2 AKG 對獲能豬精子抗氧化能力的影響

3 討 論

3.1 AKG 對獲能豬精子的運動速率和能量代謝的影響

精子在獲能和頂體反應的過程中會發生一系列變化，如膜的流動性增加和過度激活[11]。過度激活是精子運動的一種特殊狀態，其特征是高振幅、鞭毛運動的增加及不對稱、精子頭部側向移位增加以及非線性運動，是獲能精子成功穿透透明帶和受精所必需的[12]。過度激活的豬精子的運動速率依賴于氧化磷酸化，即需要線粒體產生大量的ATP。研究可見，AKG 通過促進能量代謝增加獲能精子的運動速率，維持精子的過度激活狀態。

3.2 AKG 對獲能豬精子的表觀指標和抗氧化能力的影響

精子在氧化磷酸化產生ATP 的過程中，通過位于質膜上的NADPH 氧化酶系統/線粒體NADH 依賴性氧化還原酶復合物產生ROS[13]。細胞內ROS 的濃度取決于ROS 的產生速率與各種抗氧化防御機制清除速率之間的平衡。當總抗氧化能力低于精子產生ROS 的能力時，就會出現氧化應激狀態[14]。MDA 可以用作分析和監測影響精子的脂質過氧化損傷水平的重要生化標志物。精子質膜中多不飽和脂肪酸含量高，特別容易受到氧化產物的影響，導致膜通透性破壞[15]。研究結果表明，獲能誘導產生的氧化物導致精子的活率及質膜完整性顯著下降。

AKG 在清除生物體中的ROS 方面起著至關重要的作用。Velvizhi 等[16]研究表明，AKG 可以通過增加SOD、GSH-Px 和CAT 活性來防止脂質過氧化，以促進脂肪代謝，從而減輕乙醇誘導的肝毒性和醋酸銨誘導的大鼠高氨血癥。研究發現，在AKG 的存在下，獲能精子的T-AOC、SOD 和CAT 活力顯著升高，MDA 顯著下降，這與Velvizhi 等[16]研究結果一致。AKG 在促進獲能精子產生大量的ATP 及乳酸的同時，并未導致活率及質膜完整性的進一步下降，說明AKG 導致過量生成的氧化代謝物被清除，使精子維持正常的獲能生理狀態。

在精子獲能液中添加15 mmol/L AKG 可以顯著提高精子的獲能狀態，并顯著提高獲能過程中的糖代謝及抗氧化能力。