大黃的生物學功能及其在水產養殖中的應用

衛力博,任同軍,2,王福強,2,韓雨哲,2

( 1.大連海洋大學 水產與生命學院,遼寧 大連 116023; 2.遼寧省北方魚類應用生物學與增養殖重點實驗室,遼寧 大連 116023 )

在目前的水產養殖模式下,過度或違規使用抗生素已成為制約水產養殖健康可持續發展的關鍵因素之一,因此研發安全綠色的新型漁藥已成為水產養殖的重點研究方向。中草藥相對于化學藥物具有無污染、成本低廉和資源豐富等優點,在水產研究中的應用受到越來越多的關注[1-2]。現有研究表明,中草藥在水產養殖中具有促進生長、增強機體免疫和病害防治等功能,是抗生素的良好替代品[3-6]。其中大黃作為我國傳統中藥之一,具有涼血解毒、清熱瀉火、瀉下攻積、逐瘀通經、利濕退黃的功效,廣泛應用在醫學領域[7]。另外,以大黃為主要原料制備的商品化漁藥(大黃末、三黃粉、病毒清等)在漁病防治方面已取得了良好的效果,大黃作為新型綠色漁藥在水產養殖中的應用前景廣泛。筆者總結了大黃的相關基礎研究及其在水產養殖中的應用現狀,為今后大黃在水產養殖中的合理開發和推廣應用提供理論參考。

1 大黃活性成分及其生物學功能

大黃(Radix et Rhizoma Rhei),為廖科大黃屬多年生高大草本植物,實際應用中的大黃多為掌葉大黃(Rheumpalmatum)、唐古特大黃(R.tanguticum)或藥用大黃(R.officinale)干燥的根及根莖[7-8],又稱將軍、黃良、火參和錦紋等。目前大黃作為藥物已載入19個國家的藥典,全世界的大黃屬植物大約有60種,其中我國主要集中分布在西北及西南一帶[9]。近年來,國內外學者對大黃的化學成分進行了分析,主要包括蒽醌類、蒽酮類、二苯乙烯類、苯丁酮類、色原酮類、黃酮類、鞣質類、多糖類等成分,其次還包括揮發油、甾醇類、有機酸類及微量元素等[8]。而大黃中蒽醌類成分質量分數為3%～5%,是大黃最主要的活性成分,主要分為游離型蒽醌和結合性蒽醌,其中游離型蒽醌主要包括大黃酸、大黃素和大黃酚等[10]。

1.1 大黃酸

大黃酸在大黃中的質量分數為0.2%～0.4%,屬于單蒽核類1,8-二羥基蒽醌衍生物[10],結構式見圖1。大黃酸已被證明具有抗氧化、抗炎和抗菌等生物學功能。研究表明,大黃酸可降低鎘染毒大鼠(SPF級雄性Wista大鼠,200～240 g,北京維通利華實驗動物技術有限公司提供,許可證編號:SCXK京2009-0004)體內丙二醛、乳酸脫氫酶的含量,增加一氧化氮合酶、超氧化物歧化酶和谷胱甘肽過氧化物酶的活性,進而對機體的氧化損傷起到保護作用[11];魏明艷[12]通過提取“地黃-大黃”對應的活性成分“梓醇-大黃酸”,探究其對試驗性自身免疫性腦脊髓炎小鼠(SPF級C57BL/6雌性小鼠,6～8周齡,18～22 g,北京維通利華實驗動物技術有限公司,許可證編號:SCXK京2012-0001)的作用機制,結果表明,梓醇配伍大黃酸具有顯著的抗炎和免疫調節作用;孫文武等[13]分離出感染類風濕關節炎的大鼠腹腔巨噬細胞、脾淋巴細胞,使用大黃酸處理后發現,大黃酸可以抑制巨噬細胞釋放炎介質一氧化氮,同時抑制關節炎淋巴細胞的趨化作用;而大黃酸作為植物抗生素對葡萄球菌(Staphylococcus)、鏈球菌(Streptococcus)、白喉桿菌(Corynebacteriumdiphtheria)、枯草桿菌(Bacillussubtilis)、炭疽桿菌(B.anthracis)、傷寒桿菌(Salmonellatyphi)、痢疾桿菌(Shigellacastellani)等均具有顯著的抗菌活性[14]。

圖1 大黃酸的結構骨架[7]Fig.1 The structural frame of rhein

1.2 大黃素

大黃素在大黃中的質量分數為0.15%～0.40%,化學結構式為1,3,8-三羥基-6-甲基蒽醌[10],結構式見圖2。與大黃酸類似,大黃素也同樣具有抑菌、抗病毒、抗氧化、抗炎及保護肝臟等生物學功能。研究表明,大黃素對冠狀病毒[15]、乙肝病毒[16]及脊髓灰質炎病毒[17]等均具有抑制作用;焉鑫[18]的研究表明,大黃素會顯著降低金黃色葡萄球菌(S.aureus)生物被膜形成相關基因的表達和群體感應系統信號分子AI-2的釋放,抑制細菌生物被膜的形成,進而在控制金黃色葡萄球菌感染和抗菌方面有良好的效果;據相關報道,大黃素具有清除羥自由基、抑制脂質過氧化物以保護機體免受損傷的作用;馬春艷等[19]用大黃素配伍芹菜素對自發性高血壓大鼠(SPF級雄性SHR大鼠,13周齡,北京維通利華實驗動物技術有限公司,許可證號:SCXK京2016-0611)通過灌胃進行給藥6周后發現,藥用組可顯著降低其腎臟中丙二醛含量,提高超氧化物歧化酶活性,減少高血壓對其腎臟的氧化損傷;張昊悅等[20]研究發現,大黃素可以調節Nrf-2/HO-1和MAPK信號通路,進而抑制由脂多糖誘導的小鼠單核巨噬細胞(小鼠單核巨噬細胞系RAW264.7,中國科學院上海科學研究院細胞庫)的細胞炎癥和氧化應激;張麗麗等[21]通過復合致病因素法建立肝纖維化大鼠(CL級成年雄性SD大鼠,200～220 g,北京軍事科學院實驗動物中心)模型后用大黃素進行干預,結果顯示,大黃素可抑制肝臟纖維化的形成,降低肝臟的氧化應激水平,對肝臟起到一定的保護作用。

圖2 大黃素的結構骨架[7]Fig.2 The structural frame of emodin

1.3 大黃酚

大黃酚在大黃中的質量分數為0.3%～1.1%,化學結構式為1,8-二羥基-3-甲基-蒽醌,結構式見圖3。其生物學功能主要集中在抗氧化方面,沈麗霞等[22]在使用不同劑量的大黃酚對經AlCl3致急性衰老的小鼠(KM小鼠,18～20 g,張家口醫學院動物管理室)進行注射給藥后發現,大黃酚可顯著提升其腦組織中超氧化物歧化酶和谷胱甘肽過氧化物酶的活性,推測其作用機制可能是通過增加抗氧化酶活性,清除氧自由基從而減少機體的氧化損傷。

圖3 大黃酚的結構骨架[7]Fig.3 The structural frame of chrysophanol

2 大黃在水產中的主要應用

2.1 給藥方法及抑菌作用

大黃具有價格低廉、綠色無污染等特點,在水產養殖的病害防治方面已被廣泛研究和應用。田海軍等[23]按一定比例將大黃、苦參、貫眾、百部、五倍子粉末混合煎煮后取不同質量濃度藥液,發現150 mg/mL的藥液對鱖(Sinipercachuatsi)無毒害作用并能有效地殺滅指環蟲;鄧海紅等[24]用大黃、黃芩、黃柏(質量比為4∶3∶3)制成三黃粉治療被病菌感染的史氏鱘(Acipenserschrenckii),投藥至第3天史氏鱘停止死亡,連續投喂5 d后史氏鱘攝食恢復正常,治愈率高達96%。在養殖過程中,大黃的給藥方法主要分為投喂、浸泡和潑灑等,其中:在針對魚類體表病,如小瓜蟲(Ichthyophthiriusmultifiliis)寄生、白頭白嘴病等的防治措施中,主要以中草藥水煎液進行全池潑灑和藥浴;而在針對病毒性疾病,如出血病、傳染性胰腺壞死病,和某些細菌性疾病,如細菌性腸炎、爛鰓病等時,則需將大黃等中草藥粉拌入餌料中進行投喂,并輔以藥浴進行預防和治療。大黃在實際養殖中作為病害預防手段的應用見表1。

大黃可作為植物性抗生素用于病害防治,主要因為其含有大黃素、大黃酸等蒽醌類活性物質,對水產養殖中常見病原菌具有很強抑制作用。周群蘭等[30]在評估大黃蒽醌類物質對水產養殖中常見病菌的抑菌效果時發現,其對嗜水氣單胞菌(Aeromonashydrophila)的最小抑菌質量濃度和最小殺菌質量濃度均為0.25 mg/mL,對鰻弧菌(Vibrioanguillarum)、副溶血弧菌(V.parahemolyticus)、點狀產氣單胞菌(A.punctatasubpunctate)也有很強的抑制作用;此外在進行藥敏試驗后發現,大黃提取物對嗜水氣單胞菌的抑菌圈直徑可達到氯霉素抑菌圈的70.34%,諾氟沙星的61.82%;綜合兩種結果可知,大黃提取物對水產養殖中常見病原菌可以達到良好的抑制作用。黎家勤等[31]在進行大黃和公丁香對哈氏弧菌(V.harveyi)的抑菌試驗時發現,大黃的抑菌圈直徑為(15±0.4) mm,相較于公丁香[(11.53±0.6) mm]具有更強的抑菌效果,并且在抑制哈維氏弧菌(V.harveyi)生物膜形成方面同樣效果顯著。張傳亮等[32]在分析27種中草藥及5種中藥復方配伍的體外抑菌活性試驗中發現,大黃、黃連、金銀花和復方(黃連、金銀花和連翹)對常見病原菌具有顯著的抑制效果。分析大黃的抑菌效果差異時發現,大黃的抑菌效果主要與有效成分的差異和試驗方法的差異有關:一方面,大黃不同的提取方法對同一菌種的抑菌效果會出現差異,針對大黃進行超微粉碎、超聲波提取等技術處理后的抑菌效果要高于水煎劑、乙醇提取等傳統粗提方法;另一方面,大黃及其蒽醌對病原菌的抑菌試驗主要以體外抑菌為主,測定方法主要包括抑菌圈直徑測定、最小抑菌質量濃度和最小殺菌質量濃度的測定,但每種測定方法也包括多種試驗方法,同時試驗中臨床分離出的菌種以及亞種之間也存在差異,對試驗結果均會存在潛在影響。大黃蒽醌主要通過影響病原菌的形態、遺傳物質和能量代謝起到抑菌作用,大黃素會改變病原菌細胞膜的通透性,加速內容物流出從而殺死細菌,在探究蒽醌類化合物對嗜水氣單胞菌作用的分子機制時發現,大黃素會與DNA的磷酸基團結合并嵌入到堿基對之間,影響DNA的復制與轉錄,導致細菌死亡[33]。另外,研究表明,大黃酸會抑制細菌自身線粒體呼吸鏈的電子傳遞,從而導致NADH脫氫酶、琥珀酸脫氫酶等活性下降,阻礙細菌底物氧化和脫氫過程使其死亡[34]。大黃及蒽醌對各病原菌的抑菌效果見表2。

表2 大黃及其蒽醌的抑菌效果Tab.2 Antibacterial effect of rhubarb and its anthraquinone

(續表2)

2.2 調節免疫的作用

多數水產養殖種類自身機體的防御機制仍主要為非特異性免疫[43],魚類的非特異性免疫主要分為3部分,外部屏障(鱗片、表皮和黏液等)、細胞免疫(吞噬細胞、淋巴細胞等)和體液免疫(溶菌酶、C3補體等)。中草藥可調節機體免疫的功能已被證明,其中大黃及其蒽醌對生物非特異性免疫的影響也有較多報道。陳孝煊等[44]分別將大黃、穿心蓮、金銀花和板藍根粗提后混入異育銀鯽(C.auratusgibelio)基礎飼料中進行投喂,結果顯示,這4種中草藥可明顯提高白細胞的吞噬活性和血清、體表黏液中溶菌酶的活性。明建華等[45]在團頭魴(Megalobramaamblycephala)飼料中添加60 mg/kg的大黃素飼喂60 d后進行嗜水氣單胞菌攻毒試驗,結果顯示,藥物組可顯著降低其死亡率,此外與對照組相比,試驗組團頭魴血清中堿性磷酸酶和溶菌酶水平顯著提高,肝臟中HSC70 mRNA和HSP70 mRNA的表達量明顯上升。楊維維等[46]在飼料中添加75 mg/kg大黃素可以顯著提高克氏原螯蝦(Procambarusclarkia)血清中溶菌酶活性、銅藍蛋白含量、肝胰腺谷胱甘肽含量和過氧化氫酶活性。Yang等[47]在仿刺參(Apostichopusjaponicus)飼料中分別添加大黃粉(大黃素含量0.93%)、蠟樣芽胞桿菌、酵母多糖和氟苯尼考,結果顯示,大黃粉添加組和蠟樣芽胞桿菌添加組的的仿刺參體腔液堿性磷酸酶活性顯著高于對照組和氟苯尼考添加組,表明大黃素是天然的免疫增強劑,然而高濃度大黃蒽醌可能會對機體產生負面作用。Kuo等[48]通過觀察斜帶石斑魚(Epinepheluscoioides)頭腎白細胞對大黃蒽醌提取物的免疫應答后發現,低濃度大黃蒽醌提取物會增強白細胞的吞噬活性,但高濃度組白細胞吞噬活性下降并且形態開始出現變化,表明高濃度的大黃蒽醌可能具有細胞毒性,對機體免疫造成損傷。在使用不同濃度大黃素處理草魚肝細胞的試驗中也發現了類似的結果,高濃度大黃素會誘導草魚肝細胞線粒體膜電位改變,導致細胞凋亡[49]。此外,高劑量大黃添加組飼料在投喂仿刺參3周之后,仿刺參會出現化皮現象[50]。因此,在探究大黃及其蒽醌與機體免疫的相關試驗時,需要考慮到有效成分的劑量問題。

2.3 提升抗氧化能力的作用

與高等動物相同,水產養殖動物也是依靠自身的抗氧化系統來保證機體健康。魚類的抗氧化系統主要由抗氧化酶(過氧化氫酶、超氧化物歧化酶等)和非酶物質(谷胱甘肽、熱休克蛋白等)組成[6]。大黃素等可清除氧自由基、抑制脂質過氧化物產生的作用在臨床醫學上已被證明,且關于大黃對水生生物抗氧化能力方面的研究也有類似的結果。劉波等[51]的試驗表明,大黃蒽醌提取物可以顯著提高羅氏沼蝦(Macrobrachiumrosenbergii)過氧化氫酶和超氧化物歧化酶的活性,降低丙二醛含量,并在高溫應激48 h后藥物組的肝胰腺抗氧化能力依舊強于對照組。曹麗萍等[52]全面評價了大黃素對CCl4誘導建鯉(C.carpiovarJian)肝損傷后的保肝效果,試驗組魚腹腔注射0.05 mL/g魚體質量的30%的CCl4,對照組魚腹腔注射等量橄欖油,禁食72 h后取血清與肝臟進行檢測。結果顯示,中、高劑量藥物組可明顯降低血清中谷丙轉氨酶、谷草轉氨酶及乳酸脫氫酶的水平,并顯著抑制肝臟中CCl4對CYP450酶的誘導,降低CYP1A、CYP3A的mRNA表達[52]。此外,使用DPHH自由基分析法評價大黃素抗氧化能力時,6 μg/mL的大黃素清除自由基能力可達到81%,表明大黃素可作為理想的抗氧化添加劑[52]。Song等[53]評價了大黃素對氧化魚油誘導團頭魴氧化損傷的修復效果,通過在氧化魚油飼料中添加大黃素進行飼養,結果顯示,大黃素可顯著降低肝臟中總超氧化物岐化酶、抗超氧陰離子自由基的活性和丙二醛含量,修復腸道損傷。說明大黃素在修復氧化損傷方面同樣具有巨大的潛力。大黃對機體的抗氧化能力的影響,其作用機制可能在于蒽醌類物質會調控體內參與抗氧化過程相關基因的表達,Song等[54]基于雙向電泳的蛋白質組學方法評價大黃素對團頭魴肝臟差異蛋白質組的潛在影響,探究大黃素對機體抗氧化能力的作用機制,試驗表明,在27種差異表達蛋白中,ALDOB、GAPDH、GPx1、GSTm、HSP70、ME1、LDHHB、Pgk1、Aldh8a1、Sord均參與了氧化代謝過程,并且大黃素會通過下調蛋白質(ALDOB、GAPDH、LDHHB、Pgk1、Eno3)的表達來抑制糖酵解,并通過磷酸戊糖途徑逆向激活NADPH。同時NADPH刺激活性氧的產生,進而上調GPx1、GSTm和HSP70基因的表達來激活抗氧化系統和NF-κB信號通路,最終提高機體的抗氧化能力。Song等[53,55]的研究也表明,適量的大黃素可以有效降低氧化魚油誘導的過氧化物酶體增殖物激活受體表達和改善Nrf2-Keap1信號通路及其下游靶點的表達,提升超氧化物歧化酶和過氧化氫酶的mRNA表達,印證了大黃素對于維持機體氧化還原穩態具有很強的調控能力。綜上所述,大黃及其蒽醌無論是增強動物自身抗氧化能力還是在修復氧化損傷方面都有重大的研究意義。大黃素增強機體抗氧化能力的作用機制見圖4。

圖4 大黃素增強機體抗氧化能力的作用機制[54]Fig.4 The mechanism of enhancement of body′s antioxidant capacity by emodin黃色縮寫表示大黃素作用機體后的差異表達蛋白,虛線箭頭表示差異蛋白的mRNA表達水平,實線表示差異蛋白的蛋白表達水平,紅色表示上調,綠色表示下調;G6P.6-磷酸葡萄糖;FDP.1,6-二磷酸果糖;GAP.3-磷酸甘油醛;1,3-BPG.1,3-二磷酸甘油酸;3-PG.3-磷酸甘油酸;PEP.磷酸烯醇丙酮酸;pyruvate.丙酮酸鹽;lacate.乳酸鹽;NAPDH.還原型輔酶Ⅱ;ROS.活性氧;H2O2.過氧化氫;NF-κB.核轉錄因子κB;ALDOB.果糖二磷酸醛縮酶B;GAPDH.3-磷酸甘油醛脫氫酶;pgk1.磷酸甘油酸激酶1;Eno3.烯醇化酶3;LDHB-B.乳酸脫氫酶-B;GPx1.谷胱甘肽過氧化物酶1;GSTm.谷胱甘肽S-轉移酶;HSP70.熱休克蛋白70;SOD.超氧化物歧化酶;MPO.髓過氧化物酶;CAT.過氧化氫酶;iNOS.誘導型一氧化氮合酶;TNF-α.腫瘤壞死因子-α;IL-1β.白介素1β;IL-6.白介素6;IL-12.白介素12.Abbreviations in yellow represent the altered proteins in present study, dashed arrows show mRNA expression, and solid arrows denote protein expression, the red color shows up-regulation, and the green color shows down-regulation; G6P. glucose 6-phosphate; FDP. 1,6 fructose diphosphate; GAP. glyceraldaldehyde-3-phosphate; 1,3-BPG. 1,3-bisphosphoglycerate; 3-PG. 3-phosphoglycerate; PEP. phosphoenolpyruvate; pyruvate; lacate ; NAPDH. nicotinamide adenine dinucleotide phosphate; ROS. reactive oxygen species; H2O2. hydrogen peroxide; NF-κB. nuclear factor κΒ; ALDOB. recombinant aldolase B, fructose; GAPDH. glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase; pgk1. phosphoglycerate kinase 1; Eno3. enolase 3; LDHB-B. lactate dehydrogenase-B; GPx1. glutathione peroxidase 1; GSTm. glutathione s-transferase; HSP70. heat stress protein 70; SOD. superoxide dismutase; MPO. myeloperoxidase; CAT. catalase; iNOS. inducible nitric oxide synthase; TNF-α. tumor necrosis factor-α; IL-1β.interleukins-1β; IL-6.interleukins-6; IL-12. interleukins-12.

2.4 其他作用

大黃在傳統中醫理論中具有“蕩滌腸胃,推陳致新”的功效,而在水產養殖中,大黃及其蒽醌對動物腸道也有積極的作用。齊紅莉等[56]用離體小腸平滑肌灌流法評價了不同質量濃度的大黃水煎劑對烏鱧(Channaargus)離體小腸運動性能的影響,結果顯示,大黃水煎劑可以明顯增強腸道平滑肌的收縮表現。而在大黃素對離體小鼠回腸影響的試驗中也有相似的結果,其作用機制可能與大黃素觸發機體釋放內源性乙酰膽堿有關[57]。除此之外,大黃及其蒽醌對生物腸道菌群也會產生有益影響,劉波等[58]的研究表明,在建鯉飼料中加入大黃蒽醌提取物會明顯抑制腸道內弧菌的生長,增加乳酸桿菌(Lactobacillus)的數量。動物機體在受到外部因子的應激后,體內活性氧因子快速升高,而大黃蒽醌類化合物有較強的清除氧自由基的能力,因此大黃及其蒽醌具有作為抗應激制劑的研究價值。Liu等[59]發現,用添加大黃素的飼料喂養團頭魴60 d后進行高密度應激24 h,與對照組相比,大黃素添加組團頭魴肝臟中HSP70 mRNA表達量和超氧化物歧化酶活性顯著升高,血清中皮質醇含量及肝臟中丙二醛含量明顯降低,說明大黃素可有效緩解高密度脅迫后的肝臟損傷,提升魚體的抗應激能力。另外在基礎飼料中添加大黃蒽醌類提取物,也可提升羅氏沼蝦[51,60]、建鯉[61]的抗應激能力。大黃及其蒽醌在水產養殖中的其他功效作用還需要進一步研究。

3 大黃在水產中應用存在的問題及建議

大黃在水產養殖中的病害防治、調節機體免疫抗氧化等方面的應用已取得一定的效果,并且隨著人們對糧食安全和生態保護的逐漸重視,大黃及其蒽醌類化合物在替代抗生素等化學藥品方面將具有深入研究的價值。然而,大黃在水產養殖中的應用也存在著一些問題。第一,大黃在實際應用中會存在毒性問題。在實踐中對于添加劑量和用藥時間需要進行細化,大黃及其蒽醌的毒理學需要進一步的研究。第二,實際養殖中的使用方法相對落后。大黃在養殖生產中潑灑、浸泡等方法較為低效,利用率也無法評估,無法精準使用,因此對大黃及其蒽醌進行有效的針對性提取和分離以提高藥效和減少盲目用藥是較為必要的。第三,目前大黃在水產養殖的研究主要集中在淡水魚、蝦等,其作為添加劑應用于海水生物的相關研究還相對匱乏。第四,大黃及其蒽醌對于水生生物的作用機制研究并不完善。目前大黃蒽醌的生物學功能和對靶器官的作用途徑大部分處于推測階段,而大黃對于各生物體內的藥代動力學依舊在起步階段,因此需要運用分子技術闡明其作用機理,為大黃的合理利用奠定理論基礎。第五,大黃的使用缺乏專業標準體系。大黃的有效成分會因其產地、品系、炮制方法等因素出現差異,因此只有規范生產、加工以及監測體系,才有可能實現大黃在水產養殖中的精準使用。

4 展 望

大黃在我國資源豐富,大黃蒽醌作為其最重要的活性物質,已展現出了多種生物學功能,應用范圍廣泛。在水產養殖中,大黃及其蒽醌對多種常見致病菌具有極強的抑制作用,可研發為新一代的綠色漁藥,此外,大黃對動物機體免疫和抗氧化性能具有促進作用,對改善機體腸道健康、抗應激能力等也有一定成效,可開發為不同類型的添加劑使用,而對于大黃的毒性研究和生物活性物質的利用仍需要進一步探索。