中藥藥效物質識別與作用靶標的表征確證技術研究進展

袁露萍，方文秀，李夢穎，吳 優，許曉瑩，秦路平，王小艷

中藥藥效物質識別與作用靶標的表征確證技術研究進展

袁露萍，方文秀#，李夢穎，吳 優，許曉瑩，秦路平*，王小艷*

浙江中醫藥大學，浙江 杭州 310000

中藥復雜體系中藥效物質的識別及與作用靶標相互作用的表征確證，是困擾中藥現代化研究的瓶頸難題。近年來，多種分子互作表征技術被成功應用于中藥研究領域，用來識別和表征中藥的關鍵藥效物質與疾病作用靶點的分子間相互作用。這些研究結果為探索疾病發生發展的病理基礎、詮釋中藥關鍵藥效物質與其作用靶點精準互作的藥效機制提供理論依據。通過對表面等離子體共振、等溫滴定量熱、生物膜干涉和微量熱泳動4種主要的分子互作表征技術的原理、優勢特點與應用進展進行綜述，為中藥現代化研究提供方法策略的參考依據。

中藥藥效物質；藥物靶點；分子間相互作用；表面等離子體共振；等溫滴定量熱；生物膜干涉；微量熱泳動

中藥藥效物質是中藥發揮藥效作用的物質基礎。但由于中藥的藥效作用普遍具有多成分、多靶點、多途徑的特點，使得中藥藥效物質的識別、作用靶標的發現表征及確證異常困難。并且，臨床上常以多味中藥配伍形成復方后應用于疾病的治療，這樣復雜的基質體系，使其更具挑戰。中藥發展的難點在于[1]：（1）中藥的藥效物質可能是通過介導體內間接途徑發揮藥效作用，這些成分的體內直接作用靶點較難明確；（2）中藥可能含有一些功效強但含量低的藥效物質，這些微量藥效物質的識別很難通過傳統的分離檢測手段得以實現；（3）中藥復方中的藥效物質可能是由復方中多味藥材共同煎煮過程中經多種成分相互作用發生物理化學反應而產生某些新物質，這些新物質的發現較難明確。因此，如何準確、靈敏、高效地從中藥的復雜基質中識別出關鍵藥效物質并確證其作用靶標，是探討中藥作用機制、提高中藥質量標準、開發中藥新穎用途等關乎中藥現代化研究與應用的關鍵性瓶頸問題[2]。

藥物作用于機體發揮藥理效應的本質是藥物分子與靶標受體間發生分子間相互作用。目前，隨著多學科知識技術的不斷交叉創新，陸續涌現出多種用于表征分子間相互作用的技術手段，如表面等離子體共振技術（surface plasmon resonance，SPR）、等溫滴定量熱技術（isothermal titration calorimetry，ITC）、生物膜層干涉技術（bio layer interferometry，BLI）、微量熱泳動技術（microscale thermophoresis，MST）等。本文通過對上述4種分子互作表征技術的原理、方法特點及在中藥研究中的應用進展進行綜述，為中藥藥效物質識別及與作用靶標相互作用的表征確證，提供方法策略上的參考或啟示。

1 SPR技術

1.1 SPR的技術原理與方法特點

SPR是一種無需標記的、表征分子間互作的光學檢測技術，能夠對分子間相互作用的動態過程進行實時監測、快速表征，并實現定量分析。

SPR檢測系統的核心元件、檢測原理與表征方法[3-4]見圖1。傳感芯片是以表面涂有一層薄金膜的玻璃片為載體，通常金膜上覆蓋有葡聚糖基質用于固定分子。光在棱鏡與金屬膜表面形成的消逝波會擾動等離子波，兩波相遇則發生共振，入射光的大部分能量被表面等離子波吸收，導致檢測到的反射光強會大幅度減弱，能量幾乎為零。在反射光強的響應曲線中，可以看到一個小的尖峰，此時對應的入射光波長為共振波長，對應的入射角為SPR角。當光波長一定時，SPR角會隨著傳感芯片表面的折射率變化而變化，而此折射率的變化與芯片表面結合的相對分子質量成正比。因此，可以通過監測SPR角的動態變化獲得在芯片表面發生的分子間相互作用的特異信號。表征時，將靶點蛋白受體通過氨基偶聯等方式固定在傳感芯片表面；將藥物分子配制成一定濃度的溶液作為分析物，通過微射流卡盤流通到傳感芯片表面。隨著藥物分子開始與靶點蛋白受體發生結合，SPR信號會迅速增加；當分析物連續輸送到傳感芯片上，受體上結合位點的數量減少，結合效應趨于飽和時，SPR信號趨于穩態平衡；當不再將分析物引入分析系統時，結合復合物發生解離，SPR信號降低。由此，通過監測SPR角信號的動態變化，從結合、解離反應的表征中得到兩分子間的結合常數（association constant，a）和解離常數（dissociation constant，d），二者之比即為兩分子間的平衡解離常數（dissociation equilibrium constant，KD），該值反映出藥物與靶點的分子間相互作用力大小及特異性等信息。

A-SPR技術的檢測原理 B-SPR技術的表征方法

1.2 SPR技術在中藥藥效物質識別與作用靶標表征確證中的應用

1.2.1 中藥單味藥研究中SPR技術的應用 王岱東等[5]和Mohanan等[6]研究發現腫瘤免疫調節的潛在靶點，程序性死亡-1受體（programmed death-1，PD-1）是由程序性細胞死亡蛋白1基因編碼的268個氨基酸殘基組成的膜蛋白。PD-1和其配體PD-L1結合，啟動T細胞的程序性死亡，使腫瘤細胞獲得免疫逃逸。而PD-1抑制劑則可通過克服患者體內的免疫抑制，重新激活患者自身的免疫細胞殺傷腫瘤，是一種全新的抗腫瘤免疫治療策略。因此，以PD-1為靶點的免疫調節對抗腫瘤、抗感染、抗自身免疫性疾病及器官移植存活等具有重要意義。中藥為尋找有效的PD-1抑制劑提供了重要的線索和巨大的化合物寶庫。王岱東等[5]通過液質聯用分析從人參中鑒定出人參皂苷Rc、人參皂苷Ro等9個皂苷類成分，并運用SPR技術從中識別出人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1和人參皂苷Re，且這3個成分均具有與PD-1靶點結合活性，進一步分別表征出它們的結合能力，即KD大小由高到低依次為人參皂苷Rb1＞人參皂苷Re＞人參皂苷Rg1；以此為基礎，對活性化學成分進行細胞藥理實驗驗證，為闡釋人參調節免疫和抗腫瘤的藥效機制提供依據。

1.2.2 中藥復方研究中SPR技術的應用 He等[7]研究發現血府逐瘀湯在傳統中醫典籍記載中具有活血祛瘀、行氣止痛之功效，臨床上可用于治療以氣滯血瘀證導致的斑禿病。該復方由桃仁、紅花、當歸等11味中藥組成；方中含有苦杏仁苷、羥基紅花黃色素A、山柰素、阿魏酸、梓醇、馬鞭草苷、β-蛻皮酮、桔梗皂苷D、芍藥苷、柚皮苷、新橙皮苷、甘草苷、甘草酸、柴胡皂苷A和柴胡皂苷D等豐富的化學成分，并聯合運用計算機模擬分子對接和SPR技術，預測并表征獲得了方中所含化學成分馬鞭草苷、甘草苷、山柰素和苦杏仁苷分別與斑禿病相關靶點白細胞介素-6（interleukin-6，IL-6）、IL-1β、腫瘤壞死因子-α和骨橋蛋白的藥靶兩分子間相互作用的親和力大小，為識別血府逐瘀湯中關鍵藥效物質、闡釋其干預斑禿病的藥效作用機制提供了科學依據。

此外，有大量研究將系統藥理數據挖掘、計算機分子對接、超高效液相色譜質譜聯用等多種技術與SPR聯合，成功地應用于防治新型冠狀病毒肺炎、惡性腫瘤等疾病的相關中藥藥效物質識別與其作用靶標的發現、表征及確證[8-11]。

2 ITC技術

2.1 ITC的技術原理與方法特點

ITC是一種無需標記的、高靈敏度、高自動化操作的微量量熱儀，可連續、準確地監測出分子間相互作用過程發生的熱量變化，表征出結合過程的量熱曲線，提供親和力和熱力學的全面信息，有助于了解分子間相互作用力的性質、探索其熱力學驅動因素。

ITC檢測系統的核心元件、檢測原理與表征方法[12-13]見圖2，在微量量熱儀中有2個加樣池（參比池和樣品池），2池以絕熱裝置隔開。在完全相同的溫度下，將靶蛋白受體溶液加入到樣品池中，再將藥物分子配體溶液連續滴加到樣品池中；配體與受體兩分子的結合量與儀器檢測到的熱量變化成正比；隨著配體和受體間摩爾比逐漸增加，受體的結合位點越來越被飽和，配體結合的次數也隨之減少，導致結合產生的熱量變化也趨于緩和，直到最終樣品池中的配體相對于受體達到過量，結合反應趨于飽和。表征時，從以時間尺度記錄熱量變化的量熱曲線，和以配體和受體的摩爾比作為橫坐標、熱量變化為縱坐標繪制出的熱量積分圖中，擬合獲得2分子的結合模型、a、結合焓變（Δ）、熵變（Δ）、結合位點數（）、反應吉布斯自由能（Δ）等熱力學和KD等全面信息。

2.2 ITC技術在中藥藥效物質識別與作用靶標表征確證中的應用

苦參具有清熱利濕、利尿解毒、改善肝功能等多種藥效[14]，其主要成分氧化苦參堿（oxymatrine，OMT）的關鍵作用靶點尚不明晰。血清白蛋白是脊椎動物血漿中含量豐富的蛋白質之一，具有結合、運輸內源與外源性物質、維持血液膠體滲透壓、清除自由基、抑制血小板聚集等重要生理功能[15]。徐香玉等[16]運用ITC技術表征發現OMT和牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）可發生分子間相互作用時有2類主要結合位點。當2分子在第1類位點結合時，宏觀熱力學表現為以熵驅動為主的焓-熵協同驅動過程，微觀上是以分子間疏水相互作用為主要驅動力，并且通過分析獲得第1類結合過程的平衡常數1＝（2.14±0.31）×105、標準摩爾Δ1＝（?1.07±0.50）kJ/mol、標準摩爾Δ1＝（?30.4±0.4）kJ/mol和最大1＝10.0±0.2等具體信息；當2分子在第2類位點相結合時，宏觀熱力學則表現為熵驅動過程，微觀上則是以靜電相互作用力為主要驅動力，第2類結合過程的平衡常數2＝（6.84±0.32）×103，標準摩爾Δ2＝（1.91±0.03）kJ/mol，標準摩爾Δ2＝（?21.9±0.4）kJ/mol，最大2＝25.0±0.3。根據得出的不同結合位點相互作用的熱力學差異，進一步結合圓二色譜結果分析，明確這2類結合過程中OMT與BSA的相互作用均可影響靶點蛋白質的二級結構、并導致不同結構單元相對含量變化等微觀機制。

A-ITC技術的檢測原理 B-ITC技術的表征方法

丹參是活血化瘀之良藥，但其藥效物質及作用靶點仍需深入挖掘。凝血酶是一種絲氨酸蛋白酶，可催化纖維蛋白原轉化為纖維蛋白，使血液凝固而止血，是現代藥物研究中抗凝防栓的關鍵靶點[17]。王佳宇[18]運用ITC技術表征發現丹參中的丹酚酸A、丹酚酸D、異阿魏酸、阿加曲斑與凝血酶發生分子間相互作用時Δ＜0，提示這些分子間的相互作用均可以自發發生；其中阿加曲斑與凝血酶的a最高，丹酚酸A次之；此外，通過結合Δ與Δ的數據分析，提示這5個化學成分與凝血酶的結合以離子鍵的形式發生。值得注意的是，丹酚酸D與異阿魏酸混合時與受體蛋白的a大于各自單獨滴定的a之和，且ITC表征曲線不符合Independent模型，提示丹酚酸D與異阿魏酸分別與凝血酶的不同位點發生相互作用。

此外，雷公藤具有抗炎、抗腫瘤、調節免疫、抗病毒等多種藥理作用，Peng等[19]應用ITC技術深入探討活性成分雷公藤紅素與熱休克蛋白90相互作用的分子基礎，解釋了雷公藤紅素在治療癌癥和改善退行性神經疾病方面的作用機制。這些研究結果為揭示中藥藥效物質與其作用靶標的藥靶互作機制提供了信息豐富的實驗證據。

3 BLI技術

3.1 BLI的技術原理與方法特點

BLI通過實時監測生物傳感器表面的光干涉信號，將其轉化為響應信號，以表征獲得2分子結合過程中發生相互作用的參數信息，具有耐受粗樣品、非標記、快速簡便、數據可靠等優點。

BLI檢測系統的核心元件、檢測原理與表征方法[20]見圖3，生物傳感器由末端外添加特殊光學層的玻璃光纖制成，為分子的固定提供表面化學基質。當分析物與固定在生物傳感器表面上的分子結合時，會引起光學層厚度增加，反射光的路徑長度增長，導致干涉光譜曲線發生改變，并產生向右的位移。同理，當2分子解離時，分析物從生物傳感器表面解離到溶液中，使得干涉光譜曲線向左位移。2分子發生結合，引起光干涉信號的改變。表征時，以干涉光譜曲線的偏移距離和反應發生的時間繪制得出BLI傳感圖。通過BLI傳感圖，可在各種結合模型的基礎上擬合出2分子相互作用的a、d、KD和起始結合速率等數值。

3.2 BLI技術在中藥藥效物質識別與作用靶標表征確證中的應用

BLI技術耐受粗樣品的優勢，更適于中藥復方提取液等這類復雜粗放樣品的藥效物質識別與靶點互作機制的研究。開心散是由人參、遠志、石菖蒲、茯苓4味中藥配伍組成，主要用于治療痰阻導致的老年性癡呆等癥狀[21]。β-淀粉樣蛋白（amyloid β-protein，Aβ）是通過淀粉樣前體蛋白經β-和γ-分泌酶裂解而成的多肽。人體中常見的亞型是Aβ1-40和Aβ1-42，其中Aβ1-42的神經毒性更強，容易聚集成纖維化的沉淀，最終在腦中形成老年斑。Guo等[22]應用BLI結合超高效液相色譜質譜分析技術，實時監測出開心散提取液（依次增加質量濃度為125～4000 μg/mL）與被生物素標記的Aβ1-42的結合及解離能力，并表征獲得二者的a＝115 L/(mol·s)、d＝2.60×10?21/s、KD＝170 μg/mL。進而，取BLI得到的解離液進行液相色譜聯用高分辨質譜分析，結果發現與Aβ具有很強結合能力的中藥成分主要有來源于茯苓的豬苓酸C、去氫土莫酸和土莫酸。

組分復方是現代中藥的一種新穎形式。BLI技術也同樣適用于這類相對粗放分析物的研究。丹參-人參組分復方是由丹參總酚酸、人參總皂苷和人參多糖這3種有效組分配伍而成。該組分復方對人肺癌A549細胞具有選擇性抑制其增殖的作用，能誘導肺癌細胞凋亡和降低肺癌細胞骨架面積，但可保護正常細胞的作用[23]。為進一步明確該組分復方的作用靶點，李變英等[24]應用BLI技術平行表征了組分復方及3種單獨組分與通過噬菌體展示技術篩選得到的目標多肽的親和力，結果表明與目標多肽相互作用的親和力，組分復方最高（KD＝4.57×10?8mol/L），人參多糖（KD＝7.23×10?8mol/L）和丹參總酚酸（KD＝7.66×10?8mol/L）次之，而人參總皂苷沒有典型的結合和解離效應，該研究結果表明丹參-人參組分復方與目標多肽結合的主要貢獻成分是人參多糖和丹參總酚酸，這為現代中藥靶向治療肺癌的研究提供了更精準的實驗依據。

此外，BLI技術也被應用于從復雜分析物中垂釣出靶點蛋白的研究。人參皂苷作為中藥人參的主要有效成分，對腦神經起保護作用，具有減輕興奮性毒性反應、抗氧化和抗神經炎癥、誘導神經干細胞分化以及維持線粒體穩定等方面的作用[25]，但該中藥成分在腦內的作用靶點尚不清楚。陳飛燕等[26]以直接親和法用人參總皂苷“垂釣”出了腦內靶點蛋白14-3-3，該蛋白是機體內參與信號轉導、細胞周期調控、凋亡和細胞應激反應等重要細胞生命過程的物質基礎；進而采用BLI技術分別表征“垂釣”出的蛋白14-3-3與人參總皂苷和人參皂苷單體間的相互作用，結果確認的靶蛋白14-3-3與人參總皂苷存在明確的分子相互作用，且僅有原人參二醇（KD＝7.8×10?4mol/L）和原人參三醇（KD＝5.62×10?4mol/L）2個人參皂苷單體與“垂釣”出的腦內靶點蛋白14-3-3有一定程度的相互作用，為人參總皂苷藥效作用靶點的發現及后續的確認提供了有力的實驗依據。

4 MST技術

4.1 MST的技術原理與方法特點

MST是一種實時監測在有溫度梯度的環境中的分子定向泳動，用于表征獲得生物分子發生結合的KD等參數，具有樣品無需固定化、檢測時間短、檢測靈敏度高、操作方便簡單等優點。

MST檢測系統的核心元件、檢測原理與表征方法[27-28]見圖4，目標分析物被置于薄毛細管腔中。紅外激光聚焦到毛細管中心，產生溫度梯度。當粒子在具有溫度梯度的氣體中時，處于較高溫度的分子要比處于較低溫度的分子以更高的動能與粒子發生碰撞，導致粒子在熱流力的作用下從高溫部分向低溫部分移動。并且，這種在微觀溫度梯度場中的定向移動，受分子大小、水化層、電荷改變等因素的影響。在這種熱泳現象中，儀器探測到熱泳動的特性改變，而產生高度敏感的MST信號變化。表征時，首先將受體經熒光標記后，和目標分析物同時放入到薄毛細管中；隨后，MST儀器內部發出紅外激光引起局部溫差致使管內分子發生定向移動；熒光標記受體的熒光強度在溫度梯度中隨時間發生變化，當依次將配體的系列濃度與標準化的熒光強度擬合成曲線，即可獲得分子間相互作用的KD值。

4.2 MST技術在中藥藥效物質識別與作用靶標表征確證中的應用

二氫楊梅素主要存在于顯齒蛇葡萄、苦蕎麥、北非雪松等中藥中，可用于治療酒精中毒、非酒精性脂肪肝病、糖尿病、骨質疏松癥等[29]。楊梅素則具有緩解焦慮和提高認知能力的作用，并可能預防阿爾茨海默病等神經退行性疾病[30]。而運輸藥物小分子的牛乳鐵蛋白常被認為是靶向腦病、肝病及肺病的靶點蛋白。Huang等[31]應用MST技術結合多光譜和分子對接分析，表征出牛乳鐵蛋白靶點分別與這2個中藥活性成分相互作用的KD [與二氫楊梅素KD＝（109.80±4.96）μmol/L，與楊梅素KD＝（17.65±0.34）μmol/L]，提示牛乳鐵蛋白對較大親和力的楊梅素的轉運能力強于較小親和力的二氫楊梅素，導致楊梅素在機體內的吸收和生物利用度更高。此外，MST技術成功應用于現代中藥的研究案例也多見其他報道[32-34]，豐富了可用于中藥藥效物質與其靶標分子間相互作用研究的方法策略。

A-MST技術的檢測原理 B-MST技術的表征方法

5 結語與展望

本文介紹了SPR、ITC、BLI、MST等用于表征分子間相互作用的分析技術。這4種技術分別基于不同的檢測原理，可提供多個角度的數據信息，各具特色、優點與不足（表1）。SPR技術的生物傳感器特異性高、靈敏度高，因此，更適合于通常與靶點蛋白親和力較低的中藥成分小分子化合物的分析表征；BLI技術對分析樣本的純度要求較低，因此，更適合于耐受中藥復方提取液、中藥組分溶液等這類粗放樣品的分析表征；ITC技術最大的優勢在于提供親和力和熱力學信息，因此，更適合全面深入地解析藥靶分子間發生相互作用的力學及熱力學等機制；MST技術最大的優勢在于，分析樣品的用量少，因此，更適合于微量樣品的分析表征。

表1 SPR、ITC、BLI、MST4種技術的比較

綜上所述，根據不同分析樣本的特點和研究目的，選擇一種或幾種適宜的分子互作技術進行交叉驗證，全面表征及確證中藥藥效物質與靶標蛋白兩分子間發生的藥靶相互作用，以期闡明中藥的藥效作用機制、揭示中藥的藥效科學內涵、促進中藥的現代新藥研發，這是中醫藥守正創新研究的關鍵路徑。

志謝：浙江中醫藥大學中醫藥科學院科研中心提供的平臺支持。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Research progress on technologies of characterization and identification on active substances and targets of traditional Chinese medicine

YUAN Lu-ping, FANG Wen-xiu, LI Meng-ying, WU You, Xu Xiao-ying, QIN Lu-ping, WANG Xiao-yan

Zhejiang Chinese Medical University, Hangzhou 310000, China

The identification of active substances in complex system of traditional Chinese medicine (TCM) and the characterization and confirmation of the interaction with the targets are the bottleneck problems plaguing the modernization research of TCM. In recent years, a variety of molecular interaction characterization techniques have emerged and been successfully applied to identify and characterize the intermolecular interactions between key active substances and their disease targets in field of TCM research. These research results will provide a theoretical basis for exploring the pathological basis of the occurrence and development of the disease and interpreting the pharmacodynamic mechanism of accurate interaction between the key pharmacodynamic substances of TCM and their action targets. The principles, advantages, and application advances of four major molecular interaction characterization techniques, such as surface plasmon resonance, isothermal titration calorimetry, bio layer interferometry and microscale thermophoresis, were reviewed, to provide reference for methodological strategies in research of TCM modernization.

traditional Chinese medicinal active substance; drug target; intermolecular interaction; surface plasmon resonance; isothermal titration calorimetry; bio layer interferometry; microscale thermophoresis

R284

A

0253 - 2670(2023)10 - 3370 - 08

10.7501/j.issn.0253-2670.2023.10.033

2022-12-23

國家自然科學基金資助項目（81973571）；浙江中醫藥大學遠志優青（2019）

袁露萍，碩士研究生，研究方向為中藥藥效物質與疾病靶點蛋白互作表征及功效驗證。E-mail: ylp0528208254@163.com

王小艷（1981—），博士，副研究員，從事中藥藥效物質識別與靶標挖掘及確證研究。E-mail: xy.wang@zcmu.edu.cn

秦路平（1966—），博士，教授，從事中藥資源開發利用研究。E-mail: lpqin@zcmu.edu.cn

#共同第一作者：方文秀，碩士研究生，研究方向為疾病靶點蛋白的重組表達純化及分子互作表征。E-mail: fwx55068305@163.com

[責任編輯 趙慧亮]