一種舒緩修護復合植物提取液的制備及功效評價

王一宇

（杭州三式化妝品有限公司，浙江 杭州 310011）

目前，越來越多的人受到敏感性肌膚的困擾。美國的一項調查表明，敏感性肌膚全球總體流行率約為44%[1]。皮膚敏感是指皮膚暴露于某些物理或化學刺激時會出現不愉快的感覺（如瘙癢、灼熱、刺痛等），而健康皮膚不會被這些刺激所困擾[1-2]。導致皮膚敏感的因素有很多，包括遺傳因素、內分泌失衡、環境和生活方式的改變、不恰當的皮膚護理等。研究者普遍認為皮膚敏感是一種涉及皮膚屏障-神經血管-免疫炎癥的復雜過程[3]。因此，具有舒緩及修護皮膚屏障功效的護膚品是解決皮膚敏感問題的有效措施。

目前，市售化妝品活性原料往往只具有舒緩或修護功效，解決敏感性肌膚問題的效果不夠理想。因此該文致力于開發同時具有舒緩、修護功效的植物提取物，以期高效解決敏感性肌膚問題。該研究分析了含辣木（Moringa oleifera）籽提取物的復合植物提取液（命名為新解憂精粹2.0）的制備方法及其舒緩、修護功效評價結果，為研發舒緩修護化妝品提供新思路。

1 試驗部分

1.1 試劑與儀器

III 型ZTC 1+1 天然澄清劑，北京正天成澄清技術有限公司；中性蛋白酶，夏盛（北京）生物科技開發有限公司；甘油，化妝品級，寶潔化工；D101 大孔吸附樹脂，西安瀚宇樹脂科技有限公司；RPMI 培養基，HyClone；FBS，Gibco；地塞米松（Dex）、佛波醇12-十四酸酯13-乙酸酯（PMA）、脂多糖（LPS）、十二烷基硫酸鈉（SLS），Sigma；白介素6（IL-6）ELISA Kit，欣博盛生物科技有限公司；前列腺素E2（PGE-2）ELISA Kit，Cayman。

Avanti J-E 離 心 機，Beckman；DMi1 倒 置 顯 微 鏡，Leica；Bio-II-A 生物安全柜，Telstar；371 二氧化碳培養箱，Thermo Fisher；SPARK 酶標儀，TECAN；MPA6 多功能皮膚測試儀、MX18 和色素和紅色素測試儀，CK；VapoMeter，Delfin；移液槍，Brand；斑試器，北京百億怡達科技開發有限公司。

1.2 試驗方法

前期研究發現，由小白菊（Chrysanthemum parthenium）花提取物、兩面針（Zanthoxylum nitidum）根提取物、蛇床（Cnidium monnieri）果提取物組成的復合提取液（命名為新解憂精粹1.0）具有明顯的舒緩、修護功效。但新解憂精粹1.0 的穩定性欠佳，室溫下長期放置會有少量沉淀析出。而添加一定比例辣木籽提取液后的復合提取液的穩定性得到改善且修護功效有進一步提升。

1.2.1 Ⅲ型ZTC 1+1天然澄清劑的配制

ZTC 1+1 澄清劑Ⅲ型A 組分溶液的配制：將A 組分粉末10g 置于燒杯中，沿燒杯內壁緩慢加入990g 水，攪拌均勻。置于55℃水浴中保溫30min 后，在室溫下過夜溶脹，備用。

ZTC 1+1 澄清劑Ⅲ型B 組分溶液的配制：將B 組分粉末10g 置于燒杯中，沿燒杯內壁緩慢加入980g 水、10g 冰醋酸，攪拌均勻。置于55℃水浴中保溫30min 后，在室溫下過夜溶脹，備用。

1.2.2 新解憂精粹2.0的制備

取75g 辣木籽，用物理壓榨的方式脫去油脂。脫脂辣木籽與750g 水混合，在45℃~50℃下攪拌提取2h（該溫度可提取出辣木籽蛋白，同時避免淀粉糊化，利于后續的分離純化）后，用Avanti J-E 離心機以8000r/min離心15min，收集上清液。利用鹽酸將上清液pH 調至辣木籽蛋白等電點附近（4.0~4.2）。室溫下靜置4h~5h 后，辣木籽蛋白沉淀析出，用Avanti J-E 離心機以8000r/min離心15min，收集固體（辣木籽蛋白）。辣木籽蛋白與500g水混合，調節pH 至6.3~6.5，邊攪拌邊升溫至45℃~50℃，直至形成澄清透明的溶液。向溶液中加入0.03g 中性蛋白酶，在45℃~50℃下酶解6h 后加熱至75℃~80℃，滅酶30min。在該溫度下，中性蛋白酶及殘留的辣木籽蛋白會變性為難溶于水的微小固體顆粒，而辣木籽蛋白的酶解產物（主要是肽類）溶解于水中。用0.1μm 聚丙烯膜過濾，濾液與500g 甘油混合，攪拌均勻，可得辣木籽提取液。

將75g 小白菊花、70g 兩面針根、60g 蛇床果混合，用3kg 水在90℃~95℃下攪拌提取2h 后用5μm 聚丙烯膜過濾。向濾液中加入50g Ⅲ型ZTC 1+1 天然澄清劑B 組分溶液，攪拌20min，再加入50g Ⅲ型ZTC 1+1 天然澄清劑A 組分溶液，攪拌20min。靜置1h~2h 后，蛋白、鞣質被沉淀出來。用Avanti J-E 離心機以8000r/min 離心15min，收集上清液。上清液用250gD101 大孔吸附樹脂攪拌吸附1.5h，棄去液體。樹脂先用500g 水攪拌洗脫30min，棄去水洗液。再用上文制備的辣木籽提取液攪拌洗脫2h。收集辣木籽提取液洗脫部位，用0.1μm 聚丙烯膜過濾，即得新解憂精粹2.0。

1.2.3 新解憂精粹1.0的制備

將75g 小白菊花、70g 兩面針根、60g 蛇床果混合，用3kg 水90℃~95℃攪拌提取2h 后用5μm 聚丙烯膜過濾。向濾液中加入50g Ⅲ型ZTC 1+1 天然澄清劑B 組分溶液，攪拌20min，再加入50g Ⅲ型ZTC 1+1 天然澄清劑A 組分溶液，攪拌20min。靜置1h~2h 后，蛋白、鞣質被沉淀出來。用Avanti J-E 離心機以8000r/min 離心15min，收集上清液。上清液用250g 的D101 大孔吸附樹脂攪拌吸附1.5h，棄去液體。樹脂先用500g 水攪拌洗脫30min，棄去水洗液。再用1kg50%甘油-水溶液洗脫，收集50%甘油洗脫部位，用0.1μm 聚丙烯膜過濾，即得新解憂精粹1.0。

1.2.4 穩定性考察

將新解憂精粹1.0、新解憂精粹2.0 分裝于容積為60mL的玻璃瓶內（每瓶裝樣55mL）。然后分別置于-18℃、4℃、45℃、室溫避光和室溫光照環境下考察樣品的穩定性。考察指標包括顏色、外觀和pH 值，考察周期3 個月。考察周期內，每隔一周記錄一次樣品的顏色、外觀和pH 值。

1.2.5 舒緩功效評價

取對數生長期的人單核白血病細胞（THP-1 細胞）以適當的密度接種到96 孔板中。然后每孔加入100μL 的PMA（終濃度為50ng/mL），孵育48h 后棄去細胞培養上清，每孔再加入100μL 濃度為1μg/mL 的LPS（只含PMA 和LPS，不含待測樣品的孔為模型組）。然后向測試孔中加入100μL不同濃度的新解憂精粹2.0（終濃度為0.03%~3.0%）或10μm 的Dex，繼續培養24h。加入新解憂精粹2.0 的測試孔為受試物組，添加10μm Dex 的測試孔為陽性對照組。培養結束后收集細胞培養上清至新的96 孔板中，將細胞培養上清稀釋至合適的濃度，根據細胞因子ELISA 檢測試劑盒操作說明進行細胞因子的含量測定。對測試結果進行統計學分析，采用單因素方差分析，ANOVA 計算統計學差異，并按照公式“抑制率（%）=100×（表達量模型組-表達量受試物組）/表達量模型組”計算新解憂精粹2.0 對細胞因子表達的抑制率。

1.2.6 修護功效評價

細胞模型的預試驗結果表明，新解憂精粹2.0 修護UVB 導致細胞損傷的能力強于新解憂精粹1.0。該研究參考國標及團標的方法[4-5]在人體上（30 例有效數據）評測新解憂精粹2.0 的修護功效，測試指標包括經表皮水分散失率（TEWL）和皮膚血紅素含量。

人體功效評測于恒溫恒濕實驗室進行。受試者在測試環境中適應30min 后再進行功效評測。將受試者手臂分為3 個區域，分別記作空白區、1%受試物區和5%受試物區。手臂用清水洗凈后吸取25μL 濃度為1.5%的SLS 溶液滴加于斑試器所附的濾紙片上，將斑試器貼敷于受試者手臂的3 個區域。24h 后去除斑試器，于室內平衡30min。待壓痕消失后，使用VapoMeter 探頭檢測初始TEWL，使用MX18探頭檢測初始血紅素含量。每個區域重復測試3 次，取平均值作為最終測試結果。然后向1%受試物區涂抹15μL 濃度為1%的新解憂精粹2.0 溶液，向5%受試物區涂抹15μL濃度為5%的新解憂精粹2.0 溶液，空白區涂抹15μL 空白溶劑。每日涂抹2 次，連續涂抹3 天。3 天后測試各區域TEWL 和血紅素含量。測試數據采用雙尾檢驗進行統計學分析，檢驗水準α=0.05。

2 結果與討論

2.1 新解憂精粹2.0的制備

該研究制備的新解憂精粹2.0 為黃色透明液體，具有輕微特征性氣味。根據文獻報道和定性分析的結果，新解憂精粹2.0 含有黃酮、生物堿、香豆素、肽類等成分[6]。這些成分是常見的舒緩、修護類活性物質。其中的辣木籽蛋白酶解產物（肽類）既能增強復合提取液的修護功效，又能提高提取液的穩定性，是較為關鍵的一類成分。因此，利用《中國藥典》2020 版4 部通則0731 中的第二法（福林酚法）測定新解憂精粹2.0 肽類的含量。制備的3 批樣品中，肽類的含量為0.3%~0.5%。

2.2 穩定性考察

在考察周期內，新解憂精粹2.0 在各條件下的顏色、外觀和pH 值均穩定。新解憂精粹1.0 在第三周時，在45℃條件下有微量固體析出。穩定性考察的結果表明，辣木籽提取物可以提升舒緩、修護復合植物提取液的穩定性。原因可能是辣木籽蛋白經酶解后，與超聲改性的結果類似，分子間聚集程度加強，結構更加致密，乳化能力增強[7]，增強了與其他成分之間的作用力，同時也增加了其他成分的溶解度，可避免復合植物提取液析出固體。

2.3 舒緩功效評價

樣品的舒緩功效測試結果如圖1 所示。10μm Dex 對IL-6、PGE-2 表達的抑制率分別為93.97%和89.17%。0.3%~3.0%的新解憂精粹2.0 對IL-6、PGE-2 表達的抑制率均大于77%。1%以上濃度的新解憂精粹2.0 對IL-6、PGE-2 表達的抑制率接近100%，具有明顯的劑量依賴性和顯著性差異，說明新解憂精粹2.0 具有舒緩功效。

圖1 新解憂精粹2.0 的舒緩測試結果

2.4 修護功效評價

TEWL 測試結果表明，涂抹新解憂精粹2.0 的3 天后，經表皮水分流失率有所下降，1%及5%的新解憂精粹2.0使TEWL 分別降低了6.0%和9.3%，而空白組的TEWL 幾乎沒有變化。

新解憂精粹2.0 也可減緩血紅素含量的增加。各區域血紅素含量測試結果見表1，血紅素含量增加量如圖2 所示。結果表明，3 天后，手臂各測試區域血紅素的含量均有增加（表1）。但涂抹1%和5%新解憂精粹2.0 的區域的血紅素含量增加較少（圖2）。TEWL 和血紅素含量測試結果說明，新解憂精粹2.0 具有一定的修護功效。在測試過程中，所有受試者均未出現不良反應。

圖2 3 天后血紅素含量增加值

表1 各測試區域的血紅素含量（30 位有效受試者平均值）

3 結論

根據前期研究結果，該文采用特定工藝制備了一種植物復合提取液，全成分INCI 名為甘油、水、辣木（Moringaoleifera）籽提取物、小白菊（Chrysanthemum parthenium）提取物、兩面針（Zanthoxylum nitidum）提取物、蛇床（Cnidium monnieri）果提取物，命名為新解憂精粹2.0。

穩定性考察結果表明，在4℃、45℃、室溫避光和室溫光照條件下，新解憂精粹2.0 的顏色、外觀和pH 值在3 個月考察期內均穩定。辣木籽蛋白經酶解后有提升植物復合提取液穩定性的作用。原因可能是辣木籽蛋白經酶解后，與超聲改性的結果類似，分子間聚集程度加強，結構更加致密，乳化能力增強，可增加其他成分的溶解度，進而避免復合植物提取液析出固體。

體外舒緩功效評測結果表明，新解憂精粹2.0 可抑制THP-1 細胞分泌IL-6 和PEG-2。人體修護功效評測結果表明，涂抹1%和5%的新解憂精粹2.0 可降低經表皮水分流失率，減緩血紅素的合成。在測試過程中，所有受試者均未出現不良反應。該文的研究結果表明，新解憂精粹2.0具有舒緩、修護功效，可作為舒緩、修護原料添加到化妝品中，以解決敏感性肌膚問題。