三都野生茶樹表型性狀和生化組分多樣性分析

楊春 郭燦 喬大河 郭燕 梁思慧 李燕 陳正武

摘要：為更好地保護和開發利用三都野生茶樹資源，以16份三都野生茶樹為研究對象，采用高效液相色譜和紫外分光光度法檢測茶樹的重要生化組分，并于春季和秋季對表型性狀開展觀測，結合變異系數和遺傳多樣性指數分析三都野生茶樹資源變異程度和多樣性水平。結果表明，20個描述性表型性狀變異系數在0～35.68%之間，平均值為9.94%，遺傳多樣性指數在0～1.095之間，平均值為0.257；9個數量性表型性狀變異系數在0～32.60%之間，平均值為12.68%，遺傳多樣性指數在0～1.927之間，平均值為1.077。17個生化性狀變異系數和遺傳多樣性指數變幅分別為0～400.0%和0～1.927，平均值分別為65.28% 和1.320。三都野生茶樹資源表型鑒定性狀表現為子房3室、無毛、頂芽有毛。生化特征表現為高茶多酚、高C、高可可堿和低游離氨基酸、無茶氨酸、低兒茶素總量、低EGCG、低或無咖啡堿。三都野生茶樹資源表型性狀和生化組分較統一，資源內部變異小，C和可可堿為優勢特征組分。結合表型和生化特征，推測三都野生茶樹資源可能為榕江茶的變種。

關鍵詞：三都；野生茶樹；遺傳多樣性指數；可可堿；表型性狀；生化組分

中圖分類號：S571.101 文獻標志碼：A

文章編號：1002-1302（2023）08-0111-08

基金項目 貴州省科技計劃（編號：黔科合支撐［2019］2254號、黔科合平臺人才［2020］2103號）；貴州省農業科學院特色動植物資源收集、保存與創制利用項目（編號：黔農科院種質資源［2022］03號）。

作者簡介：楊 春（1988—），女，湖南益陽人，碩士，助理研究員，主要從事茶樹資源育種與品種抗性研究。E-mail：610681998@qq.com。

通信作者：陳正武，研究員，主要從事茶樹資源育種工作。E-mail：zwchentea@163.com。

我國是茶樹［Camellia sinensis （L.） O.Kuntze］的原產地，云南、貴州等省分布著數量繁多、類型多樣的野生茶樹資源［1-4］，這些野生茶樹資源對于茶樹的遺傳演化、品種改良及分子育種等研究有著重要意義［5-7］。因此，加大力度保護和深入研究珍稀野生茶樹資源，是現今茶樹種質資源研究的重點［8］。

三都水族自治縣，位于貴州省黔南布依族苗族自治州，地處月亮山、雷公山腹地，是貴州野生茶樹集中分布地之一［9］。前期已針對三都野生茶樹親緣關系、遺傳多樣性等展開了一定研究［10-11］，但尚未見三都野生茶樹表型特征及生化性狀等方面的相關報道。本研究選取16份代表性三都野生茶樹為研究對象，通過測定主要生化成分和觀測樹、花、葉等表型性狀，結合統計分析方法，明晰三都野生茶樹資源表型及生化的變異程度和多樣性水平，歸納出三都野生茶樹資源整體的表型特征和生化特征，以期為進一步保護和開發利用三都野生茶樹資源打下基礎。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

高效液相色譜（HPLC）儀：Agilent 1260 Infinity Ⅱ（美國安捷倫）；

紫外分光光度計：TU-1800（北京普析）；

色譜柱：大連依利特Hypersil ODS2（4.6 mm×250 mm，5 μm）。

咖啡堿、沒食子酸、兒茶素類［兒茶素（C）、表兒茶素（EC）、表沒食子兒茶素（EGC）、表兒茶素沒食子酸酯（ECG）、沒食子兒茶素沒食子酸酯（GCG）、表沒食子兒茶素沒食子酸酯（EGCG） ］和茶氨酸標準品購自合肥博美生物科技有限公司，N，N-二甲基甲酰胺、乙腈、甲醇、冰醋酸等有機試劑為市售HPLC級。

1.2 試驗材料

試驗茶樹取自貴州省黔南州三都水族自治縣原始森林中，地理范圍為25°55′48″～25°59′40″N，108°9′32″～108°20′46″E，海拔范圍為1 300～1 500 m。選取基徑大于10 cm的野生茶樹進行取樣和掛牌（圖1）。福鼎大白茶（對照）取自貴州省茶葉研究所湄潭種質資源圃。

1.3 試驗方法

1.3.1 樣品制備 于2020年5月，采各標記單株1芽2葉鮮葉，用微波殺青的方法［12］，制備生化檢測樣。對照取樣時間為2020年4月，取樣標準1芽2葉。

1.3.2 檢測方法

表型性狀：分別于2020年、2021年春季和秋季調查記錄樹、葉、花、芽的性狀，表型調查及描述代碼參考《茶樹種質資源數據質量控制規范》，采用基恩士超景深顯微鏡（VHX-5000）觀測頂芽、子房和腋芽茸毛，每份材料調查10個葉、芽、花，數量性表型性狀取平均值，描述性表型性狀以出現概率最大的描述代碼為準。

生化成分：游離氨基酸含量采用GB/T 8314—2013 《茶 游離氨基酸總量的測定》中的方法進行測定；茶多酚含量采用GB/T 8313—2018 《茶葉中茶多酚和兒茶素類的檢測方法》進行測定；茶氨酸含量參考岳婕等的方法［13］進行測定；兒茶素組分參考周順珍等的方法［14］進行測定。每個樣品重復檢測3次，數據取3次平均值。

1.3.3 數據處理

評價遺傳多樣性指數采用香農-維納指數（Shannon-Wiener index）。性狀分布頻率及多樣性分析采用Excel 2010軟件。聚類分析和Pearson相關性分析采用SPSS 21.0。

2 結果與分析

2.1 表型性狀遺傳多樣性分析

本研究共統計分析了16份三都野生茶樹樹型、葉片大小、葉形等20個描述性表型性狀和葉長、葉寬等9個數量性表型性狀（表1、表2）。20個描述性表型性狀在描述代碼上有不同的分布表現，其中葉片大小和雌雄蕊相對高度在描述代碼上均有分布但不均勻，具體葉片大小以中葉居多，雌雄蕊相對高度以等高居多。樹型、葉形、葉身、葉齒密度、葉齒銳度、葉尖及葉色不均勻分布于描述代碼上的2～3項，具體來看，樹型表現為小喬木和喬木，以小喬木為主；葉形主要為橢圓形、長橢圓形和披針形，三者數量相差不大；葉身表現為內折和平，以內折居多；葉齒以密度密、銳度中居多；葉尖表現為急尖和漸尖，漸尖居多；葉色有綠色和深綠色，深綠色占絕大多數。葉面、葉質、葉基、萼片茸毛、萼片顏色、花瓣顏色、花瓣質地、花柱裂位、子房茸毛、腋芽茸毛及頂芽茸毛全部集中分布于1個描述代碼，具體表現為葉面微隆起、葉質中、葉基楔形、萼片茸毛無、萼片顏色綠色、花瓣顏色白色、花瓣質地薄、花柱裂位高、子房無茸毛、腋芽和頂芽有茸毛。

9個數量性表型性狀中萼片數和柱頭開裂數并無變化，穩定表現出萼片5瓣和柱頭3裂的性狀；葉脈對數和花瓣數同樣變幅較小，葉脈對數表現出8對或9對，花瓣7瓣居多；葉長、葉寬、葉面積、花冠直徑及花柱長度的變幅相對較大，遺傳多樣性指數同樣高于其他4個性狀。

20個描述性表型性狀變異系數在0～35.68%之間，平均值為9.94%；遺傳多樣性指數在0～1.095之間，平均值為0.257。9個數量性表型性狀變異系數在0～32.60%之間，平均值為12.68%；遺傳多樣性指數在0～1.927之間，平均值為1.077。29個表型性狀的平均變異系數和遺傳多樣性指數分別為10.79%和0.512，表明三都野生資源表型性狀的變異系數和遺傳多樣性指數處于較低水平，且有11個描述性表型性狀和2個數量性表型性狀集中分布，變異系數和遺傳多樣性指數都為0，這說明三都野生茶樹在表型上有多個性狀表現一致，資源內部變異較小，存在一定的封閉性。

2.2 生化性狀遺傳多樣性分析

參照茶樹中常規生化成分和特征性次生代謝產物的標準對16份三都野生茶樹的17個生化性狀進行分析，以福鼎大白茶為對照比對三都資源與代表性栽培種在生化性狀上的典型差異。

由表3可知，17個生化性狀變異系數和遺傳多樣性指數變幅分別為0～400.0%和0～1.927，平均值分別為65.28% 和1.320。三都資源在生化成分上與對照福鼎大白茶差異較大。福鼎大白茶中游離氨基酸和茶氨酸含量分別是3.94%和2.02%，而三都資源中游離氨基酸含量較低，最高僅1.63%，低于對照福鼎大白茶的一半，且16份三都野生茶樹中均未檢測到茶氨酸。福鼎大白茶中茶多酚含量為16.78%，兒茶素總量為12.49%，兒茶素占比為74.43%，符合兒茶素占茶多酚含量70.0%～80.0%的規律［15］，而三都資源表現出典型的高茶多酚、 低兒茶素的特征，茶多酚含量、兒茶素含量和兒茶素占比平均值分別為22.99%、6.29%和27.46%。對比三都野生茶樹和福鼎大白茶的兒茶素單體可知，福鼎大白茶中主要兒茶素單體為表沒食子兒茶素沒食子酸酯（EGCG），含量為7.02%，占兒茶素總量的56.2%。三都資源中占主導的兒茶素單體為兒茶素（C），含量在3.59%～5.56%之間，其次是表兒茶素沒食子酸酯（ECG），含量在0.71%～1.69%之間，表沒食子兒茶素（EGC）、沒食子兒茶素沒食子酸酯（GCG）、EGCG和表兒茶素（EC）含量均較低。對比生物堿組成可知，福鼎大白茶中主要生物堿是咖啡堿，含量為3.79%；三都資源中的主要生物堿為可可堿，含量范圍在3.31%～5.76%之間，幾乎不含咖啡堿。

2.3 聚類分析和相關性分析

2.3.1 聚類分析

以資源間存在變異的22個數量指標（葉長、葉寬、葉面積、葉脈對數、花瓣數、花冠直徑、花柱長度、氨基酸含量、茶多酚含量、沒食子酸含量、EGC含量、C含量、EC含量、EGCG含量、ECG含量、非酯型兒茶素含量、酯型兒茶素含量、兒茶素總量、兒茶素占比、咖啡堿含量、可可堿含量和茶堿含量）為依據，對16份三都野生茶樹進行聚類分析。

由圖2、表4可知，16份三都野生茶樹在歐式距離為10時，可分為3類。第Ⅰ類包括SD-26、SD-29 等7份野生茶樹，主要特點為葉長、葉寬和葉面積均較小，茶多酚和酯型兒茶素含量較高，氨基酸含量較低；第Ⅱ類包括SD-2、SD-20-1等8份野生茶樹，主要特點為氨基酸含量較高，C含量、非酯型兒茶素含量和兒茶素總量較低，兒茶素占比較低，可可堿含量較高；SD-20-2單獨構成第Ⅲ類，主要特點為葉長、葉寬和葉面積較大，茶多酚、酯型兒茶素和可可堿含量較低，C、非酯型兒茶素含量和兒茶素總量較高，兒茶素占比較高。

2.3.2 相關性分析

同樣以資源間存在變異的22個數量指標進行Pearson相關性分析，結果（表5）顯示，三都野生茶樹表型性狀與生化性狀間相關性不大，僅咖啡堿與花瓣數存在顯著負相關。表型性狀中葉片性狀相關性較強，葉長、葉寬和葉面積三者間存在極顯著正相關，花性狀僅中花冠直徑與花柱長度間存在極顯著正相關，葉片性狀與花性狀間不存在顯著相關性。生化性狀間的相關性要強于表型性狀，有19對生化性狀間存在顯著或極顯著相關性，沒食子酸含量與C、EC、 非酯型兒茶素含量及兒茶素總量和兒茶素占比間存在顯著或極顯著負相關。C含量和EC含量不僅相互間存在極顯著正相關，同時與非酯型兒茶素含量、兒茶素總量和兒茶素占比間存在顯著或極顯著正相關關系。EGCG含量和ECG含量與酯型兒茶素含量存在極顯著正相關。3個生物堿成分中，可可堿含量與茶堿含量間存在極顯著正相關。

3 討論

3.1 三都野生茶樹資源多樣性分析

三都野生茶樹表型性狀和生化成分的遺傳多樣性指數平均值分別為0.512和1.320，低于陜西［16］、江西［17］、重慶［18］及貴州多地的地方茶樹種質［19-20］，也低于納雍［21］、鎮寧［22］、雷波［23］等地的野生茶樹。說明三都野生茶樹生長環境較封閉，表型及生化遺傳背景單一，資源內部變異類型不豐富。

3.2 三都野生茶樹資源初鑒

子房有無茸毛、子房室數和頂芽（腋芽）是否具毛是茶種植物分類鑒定的主要依據［24］。茶種植物（C. sinensis）的鑒定表型特征為子房3室、有毛、頂芽有毛［25］，而三都野生茶樹則是子房3室、無毛、頂芽（腋芽）有毛的表型特征。參考陳濤林關于榕江茶、突肋茶和元寶山茶的研究［26］發現，三都野生茶樹在形態上與榕江茶相似度較高，除同樣是子房3室、無毛，頂芽有毛外，在葉長、葉寬、葉面積、葉尖、葉形、花柱長度等性狀上同樣表現相近，但在樹型、萼片茸毛等性狀上存在明顯差異，榕江茶為灌木，萼片外側有疏毛，三都野生茶樹不存在灌木類群，且萼片外側光滑無毛。生化上，三都野生茶樹與榕江茶均表現出以可可堿為主要生物堿、C為主要兒茶素單體及茶氨酸含量甚微的生化特征。因此，結合表型性狀和生化特性，推測三都野生茶樹與元寶山野生茶樹一樣，可能為榕江茶變種。

3.3 三都野生茶樹資源生化特性與利用

咖啡堿、EGCG和茶氨酸是茶樹中的優勢組分［15］。大量研究發現，野生茶樹有著區別于常規栽培種茶樹的生化特性。滕杰等研究發現，禿房茶（C. gymnogyna）中生物堿組成明顯有別于其他茶種，以可可堿為主要生物堿［27］。Jin等研究發現，福建野生紅芽茶中主要兒茶素單體為GCG，主要生物堿組分是可可堿［28］。陳瀟敏等研究發現，福建野生茶樹中存在以苦茶堿為主要生物堿的特異種質［29］。三都野生茶樹資源中C和可可堿為優勢組分，可可堿對癌癥、心血管疾病、呼吸疾病等方面有積極干預與治療作用［30］，后續可作為特異茶樹種質資源加以開發利用。

4 結論

三都野生茶樹資源表型和生化的遺傳多樣性指數均處于較低水平，在表型和生化層面分化程度不高。主要鑒定表型性狀表現為子房3室、無毛、頂芽（腋芽）有毛。生化性狀整體表現出高茶多酚、低兒茶素、低氨基酸和無茶氨酸的特點，C和可可堿是三都野生茶樹的特征性優勢組分。結合表型性狀和生化特性，推測三都野生茶樹可能為榕江茶變種。本研究僅對三都野生茶樹資源表型及茶樹常規生化開展研究，后續可結合非靶向代謝組分析三都野生茶樹與栽培種的差異代謝物，同時結合全基因組測序等分子手段，分析三都野生茶樹在茶樹起源及進化中的地位。

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