姜曲海豬ATP2B1基因克隆、生物信息學(xué)及組織表達分析

徐盼 趙為民 倪黎綱 張君勝 閆偉 劉家興 陶勇

摘要：克隆姜曲海豬質(zhì)膜鈣轉(zhuǎn)運ATP酶1（ATPase Plasma Membrane Ca2+Transporting 1，ATP2B1）基因CDS區(qū)序列，對其進行生物信息學(xué)分析，并探究ATP2B1基因在不同日齡姜曲海豬子宮組織的表達水平，以期為研究ATP2B1基因在姜曲海豬繁殖性能方面的作用提供參考依據(jù)，采用RT-PCR技術(shù)擴增姜曲海豬子宮ATP2B1基因CDS區(qū)序列，利用生物信息學(xué)軟件對其進行分析，利用實時熒光定量PCR檢測ATP2B1基因在1月齡和8月齡姜曲海豬子宮組織中的表達量。結(jié)果顯示，姜曲海豬ATP2B1基因CDS區(qū)全長3 663 bp，編碼1 220個氨基酸，與野豬同源性最高、親緣關(guān)系最近。姜曲海豬ATP2B1蛋白分子質(zhì)量約為134 737.94 u，原子總數(shù)為19 102個，理論等電點（pI）為5.63，帶正電荷、負電荷的氨基酸數(shù)分別為141、161個。該蛋白最可能位于細胞膜上，為跨膜、非分泌型疏水蛋白質(zhì)，有159個磷酸化位點和5個N-糖基化位點，無規(guī)則卷曲在預(yù)測的二級結(jié)構(gòu)中占比最大。實時熒光定量PCR結(jié)果顯示，ATP2B1基因在8月齡姜曲海豬子宮組織中的表達量顯著低于1月齡姜曲海豬子宮組織（P<0.05）。本試驗為探明ATP2B1基因?qū)ωi繁殖性狀的影響提供了分子理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞：姜曲海豬；ATP2B1基因；克隆；生物信息學(xué)；組織表達

中圖分類號：S828.2；S828.3 文獻標志碼：A

文章編號：1002-1302（2023）08-0150-07

基金項目：國家自然科學(xué)基金（編號：31702089）；江蘇高校“青藍工程”；江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計劃（編號：202112806093Y）；江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院科技創(chuàng)新團隊項目（編號：NSF2021TC04）。

作者簡介：徐 盼（1988—），男，江蘇南京人，博士，講師，從事動物遺傳育種與繁殖研究。E-mail：panxu_nj@hotmail.com。

通信作者：陶 勇，男，江蘇揚州人，博士，教授，從事畜禽品種資源保護與遺傳育種的教學(xué)及科研工作。E-mail：tyrsm1975@126.com。

近年來，受非洲豬瘟的影響，我國生豬生產(chǎn)無法滿足市場的需求，提高豬的繁殖性能對提高豬肉產(chǎn)量具有重要意義。作為豬最重要的經(jīng)濟性狀之一，繁殖性狀受遺傳、品種、營養(yǎng)、環(huán)境及年齡等因素的影響，其中遺傳是主要的影響因素。因此，對影響豬繁殖性狀的候選基因的挖掘與鑒定成為豬遺傳育種領(lǐng)域的熱點。

姜曲海豬具有耐粗飼、性成熟早、繁殖力高、肉質(zhì)細嫩、肉味鮮美、皮骨比例較低、早熟易肥等特點，該品種與江蘇省的其他5個品種（二花臉豬、淮豬、梅山豬、米豬、沙烏頭豬）已被列入國家保護計劃。Xu等使用GeneSeek GGP Porcine 80K SNP芯片對來自國家級姜曲海豬保種場的105頭姜曲海豬進行基因分型，通過計算LSBL（locus-specific branch length）值鑒別到包括質(zhì)膜鈣轉(zhuǎn)運ATP酶1（ATPase Plasma Membrane Ca2+Transporting 1，ATP2B1）基因在內(nèi)的9個與姜曲海豬繁殖性狀相關(guān)的受選擇的候選基因［1］。

作為P型離子轉(zhuǎn)運ATP酶家族中的一員，ATP2B1基因與鈉/鈣交換體協(xié)同作用，將細胞內(nèi)的Ca2+轉(zhuǎn)運至細胞外，維持靜息狀態(tài)下細胞內(nèi)Ca2+濃度處于較低水平，對維持細胞內(nèi)外鈣離子穩(wěn)態(tài)平衡具有重要作用［2］。Ma等研究發(fā)現(xiàn)，與低產(chǎn)二花臉母豬相比，高產(chǎn)二花臉母豬的子宮中鈣離子濃度更高［3］。由上述研究發(fā)現(xiàn)，ATP2B1基因可能對豬的繁殖性能有影響。目前，對地方豬ATP2B1基因的研究鮮見報道。本研究以姜曲海豬為研究對象，對子宮組織ATP2B1基因CDS區(qū)序列進行克隆及相關(guān)生物信息學(xué)分析，通過實時熒光定量PCR技術(shù)檢測不同日齡子宮組織中ATP2B1基因的表達，以期為進一步研究ATP2B1基因在豬繁殖性能方面的作用機制提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗時間和地點

本試驗于2021年3—6月在江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院和江蘇姜曲海豬種業(yè)有限公司進行。

1.2 樣品采集

1月齡和8月齡姜曲海母豬各3頭，由國家級姜曲海豬保種場（江蘇姜曲海豬種業(yè)有限公司）提供，采集其子宮組織放入-80 ℃冰箱中保存。

1.3 主要試劑

UNlQ-10柱式Trizol總RNA抽提試劑盒、M-MuLV反轉(zhuǎn)錄酶、2×SG Fast qPCR Master Mix （High Rox）定量試劑盒、柱式DNA膠回收試劑盒均購自生工生物工程（上海）股份有限公司；LA Taq酶購自寶日醫(yī)生物技術(shù)（北京）有限公司。

1.4 基因克隆

使用UNlQ-10柱式Trizol總RNA抽提試劑盒提取總RNA；使用M-MuLV反轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)錄合成cDNA；根據(jù)NCBI（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）網(wǎng)站Sus scrofa ATP2B1基因（登陸號：NM_214352.3）的cDNA序列設(shè)計克隆引物、定量引物和內(nèi)參引物（表1），引物委托生工生物工程（上海）股份有限公司合成；以姜曲海豬子宮組織cDNA為模板進行ATP2B1基因PCR擴增，產(chǎn)物用柱式DNA膠回收試劑盒回收，委托生工生物工程（上海）股份有限公司進行測序，得到姜曲海豬ATP2B1基因的cDNA序列。

1.5 生物信息學(xué)分析

利用MegAlign軟件比對姜曲海豬與其他物種ATP2B1基因CDS區(qū)序列的同源性并構(gòu)建系統(tǒng)進化樹；利用ProtParam分析姜曲海豬ATP2B1蛋白理化性質(zhì)；利用PSORT預(yù)測姜曲海豬ATP2B1蛋白亞細胞定位；利用SignalP 5.0預(yù)測姜曲海豬ATP2B1蛋白信號肽；利用TMHMM 2.0預(yù)測姜曲海豬ATP2B1蛋白跨膜結(jié)構(gòu)域；利用ProtScale預(yù)測姜曲海豬ATP2B1蛋白疏水性；利用NetPhos 3.1預(yù)測姜曲海豬ATP2B1蛋白磷酸化位點；利用NetNGlyC 1.0預(yù)測姜曲海豬ATP2B1蛋白糖基化位點；利用SOPMA和SWISS-MODEL分別預(yù)測姜曲海豬ATP2B1蛋白二級結(jié)構(gòu)和三級結(jié)構(gòu)（表2）。

1.6 姜曲海豬ATP2B1基因子宮組織表達分析

利用實時熒光定量PCR檢測1月齡和8月齡姜曲海豬子宮組織中ATP2B1基因的表達量。PCR反應(yīng)體系20.0 μL：2×SybrGreen qPCR Master Mix 10.0 μL，上下游引物各0.4 μL，ddH2O 7.2 μL，cDNA 2.0 μL。PCR反應(yīng)程序：95 ℃ 3 min；95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，共45個循環(huán)。每個樣品重復(fù)3次，以GAPDH基因為內(nèi)參，使用2-ΔΔCT法分析結(jié)果。數(shù)據(jù)采用SPSS 19.0軟件分析，結(jié)果采用“平均值±標準差”，P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 姜曲海豬ATP2B1基因克隆及序列分析

姜曲海豬ATP2B1基因PCR擴增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳圖（圖1）顯示，在322、1 182、1 168、1 257、390 bp處分別有單一條帶，與預(yù)期相符。測序結(jié)果顯示克隆所得的姜曲海豬ATP2B1基因CDS區(qū)長度為3 663 bp，編碼1 220個氨基酸。由圖2可知，姜曲海豬ATP2B1基因CDS區(qū)序列與野豬同源性最高（99.9%），與雞同源性最低（83.0%）；由系統(tǒng)進化樹（圖3）可知，姜曲海豬與野豬、牛、綿羊、山羊親緣關(guān)系較近，與雞、鴨親緣關(guān)系較遠。

2.2 生物信息學(xué)分析

2.2.1 理化性質(zhì)

姜曲海豬ATP2B1蛋白分子式為C6 009H9 633N1 611O1 805S44，分子質(zhì)量約為 134 737.94 u，原子總數(shù)為19 102個，理論等電點（pI）為5.63，偏酸性。由表3可知，在組成姜曲海豬ATP2B1蛋白序列的20種氨基酸中，亮氨酸占比最高，為9.2%；色氨酸占比最低，為1.1%；141個氨基酸帶正電荷，161個氨基酸帶負電荷。姜曲海豬ATP2B1蛋白理論半衰期為30 h（哺乳動物網(wǎng)織紅細胞、體外）、>20 h（酵母、體內(nèi)）、>10 h（大腸桿菌、體內(nèi)）；蛋白不穩(wěn)定系數(shù)為42.97，說明該蛋白為不穩(wěn)定蛋白；脂溶指數(shù)為95.57，表明該蛋白為脂溶性蛋白且流動性好；平均親水系數(shù)（GRAVY）為 -0.156，推測該蛋白為親水性蛋白。

2.2.2 亞細胞定位

利用PSORT對姜曲海豬ATP2B1蛋白亞細胞定位進行預(yù)測，結(jié)果（表4）表明，該蛋白分布于細胞膜、高爾基體、細胞核和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（膜），概率分別為0.600、0.400、0.320和0.300。

2.2.3 信號肽和跨膜結(jié)構(gòu)域

利用SignalP 5.0 server預(yù)測姜曲海豬ATP2B1蛋白信號肽，結(jié)果（圖4）表明，該蛋白無信號肽，說明該蛋白是非分泌蛋白；利用TMHMM預(yù)測姜曲海豬ATP2B1蛋白跨膜結(jié)構(gòu)域，由圖5可知，該蛋白為跨膜蛋白，有7個跨膜螺旋區(qū)，分別位于377～399、419～441、855～877、931～950、970～989、1 002～1 024、1 039～1 061 位氨基酸之間。

2.2.4 疏水性

利用Expasy ProtScale對姜曲海豬ATP2B1蛋白進行疏水性預(yù)測，結(jié)果（圖6）表明，最大分值是3.444，為第390位的亮氨酸（Leu），代表其疏水性最強，最小分值是-3.811，為第308位的賴氨酸（Lys），代表其親水性最強，親水性氨基酸殘基多于疏水性氨基酸殘基。

2.2.5 磷酸化位點和N-糖基化位點

利用NetPhos 3.1和NetNGlyC 1.0分別對姜曲海豬ATP2B1蛋白磷酸化位點和糖基化位點進行預(yù)測分析，結(jié)果（圖7、圖8）表明，該蛋白有159個磷酸化位點，存在5個N-糖基化位點，分別位于第6、468、543、834、1 201 位氨基酸處。

2.2.6 二級結(jié)構(gòu)和三級結(jié)構(gòu)

利用SOPMA預(yù)測姜曲海豬ATP2B1蛋白二級結(jié)構(gòu)，結(jié)果（圖9）表明，α-螺旋、β-轉(zhuǎn)角、無規(guī)則卷曲和延伸鏈分別占36.80%、5.74%、39.26%和18.20%。利用SWISS-MODEL構(gòu)建姜曲海豬ATP2B1蛋白可能的三級結(jié)構(gòu)模型，結(jié)果（圖10）表明，全局模型質(zhì)量估計（global model quality estimation，GMQE）值為0.73，且與模板的相似性為99.34。

2.3 ATP2B1基因在1月齡和8月齡姜曲海豬子宮組織中的表達量

利用實時熒光定量PCR技術(shù)檢測ATP2B1基因在1月齡和8月齡姜曲海豬子宮組織中的表達量，結(jié)果（圖11）表明，ATP2B1基因在8月齡姜曲海豬子宮組織中的表達量顯著低于1月齡姜曲海豬子宮組織（P<0.05）。

3 討論

豬的繁殖性狀主要包括產(chǎn)仔數(shù)、初生體質(zhì)量、斷奶體質(zhì)量等，其中產(chǎn)仔數(shù)最為重要。排卵率、受精率、子宮容積、胚胎成活率等是影響產(chǎn)仔數(shù)的主要因素，子宮是胚胎發(fā)育生長的場所，因此子宮對母豬高產(chǎn)意義重大。鈣是哺乳動物骨骼形成、肌肉收縮和胞吐等生理過程中的必要成分，同時，它也是細胞內(nèi)信號傳遞的第二信使和細胞黏附分子的激活劑［4-7］，在胚胎植入期對滋養(yǎng)外胚層和母體子宮內(nèi)膜之間的細胞黏附至關(guān)重要［8-10］。ATP2B1基因在細胞內(nèi)鈣動態(tài)平衡中起關(guān)鍵作用。

本研究以高繁殖力的姜曲海豬子宮組織為材料，克隆出ATP2B1基因的CDS區(qū)，進行了相關(guān)生物信息學(xué)分析和組織表達分析。同源性比對結(jié)果顯示，姜曲海豬ATP2B1基因CDS區(qū)序列與野豬、牛、羊等哺乳動物同源性較高，與雞、鴨等非哺乳動物同源性較低；系統(tǒng)進化樹顯示，姜曲海豬與野豬、牛、羊等哺乳動物親緣關(guān)系較近，與雞、鴨等非哺乳動物親緣關(guān)系較遠，驗證了同源性比對的結(jié)果。潘鵬丞等研究發(fā)現(xiàn)，陸川豬與野豬、牛、綿羊同源性較高、親緣關(guān)系較近，與原雞同源性較低、親緣關(guān)系較遠［11］。這2項研究結(jié)果相似，其原因是地方豬與野豬屬于同一個物種，豬和牛、羊均屬于偶蹄目。亞細胞定位顯示姜曲海豬ATP2B1蛋白分布于細胞膜的概率為0.600，且跨膜結(jié)構(gòu)域預(yù)測結(jié)果顯示該蛋白為跨膜蛋白，有7個跨膜螺旋區(qū)。Yang等通過免疫組化分析發(fā)現(xiàn)ATP2B1基因在子宮內(nèi)膜上皮層和腺上皮細胞中大量表達［12］；Choi等通過原位雜交分析表明，ATP2B1基因主要定位于子宮內(nèi)膜腔上皮、腺上皮和基質(zhì)細胞［13］。由此可推測，ATP2B1基因可能通過調(diào)節(jié)子宮內(nèi)膜鈣離子濃度而在妊娠的建立和維持中發(fā)揮重要作用。

除了在細胞內(nèi)鈣動態(tài)平衡中起關(guān)鍵作用，ATP2B1基因還對血管平滑肌收縮及血壓起重要作用［14］。ATP2B1基因是高血壓的重要候選基因，是第一個在針對高血壓的不同全基因組關(guān)聯(lián)分析研究中交叉驗證的基因。Levy等通過全基因組關(guān)聯(lián)分析發(fā)現(xiàn)ATP2B1基因多態(tài)與收縮壓、舒張壓和高血壓顯著相關(guān)［15］，該結(jié)果也在歐洲和亞洲人群中得到驗證［16-20］。子癇是一種妊娠期嚴重的高血壓疾病，是胎兒死亡的重要原因之一。該疾病可能與肥胖、高齡、外部環(huán)境和其他因素有關(guān)［21-22］。此外，遺傳性慢性高血壓也可能是該病的重要原因。多項研究表明，ATP2B1基因多態(tài)性與子癇的發(fā)生密切相關(guān)［23-24］。Kobayashi等使用Cre-loxP系統(tǒng)培育了血管平滑肌細胞特異性敲除ATP2B1基因小鼠，相比野生型小鼠，ATP2B1基因敲除小鼠的血管平滑肌細胞內(nèi)鈣離子水平及收縮壓上升［25］。這些結(jié)果表明，ATP2B1基因通過改變血管平滑肌細胞的鈣轉(zhuǎn)運和血管收縮來調(diào)節(jié)血壓。此外，ATP2B1基因的2個拷貝丟失會導(dǎo)致胚胎死亡［26］。本研究中ATP2B1基因在8月齡姜曲海豬子宮組織中的表達量顯著低于1月齡姜曲海豬子宮組織，提示ATP2B1基因可能影響姜曲海豬繁殖性狀。

4 結(jié)論

本研究以姜曲海豬子宮組織為材料，成功克隆了姜曲海豬ATP2B1基因CDS區(qū)，長度為3 663 bp，編碼1 220個氨基酸，與野豬同源性最高、親緣關(guān)系最近。姜曲海豬ATP2B1蛋白分子質(zhì)量約為 134 737.94 u，原子總數(shù)為19 102個，理論等電點（pI）為5.63，帶正電荷和負電荷的氨基酸數(shù)分別為141個和161個。該蛋白最可能位于細胞膜上，為跨膜、非分泌型疏水蛋白質(zhì)，有159個磷酸化位點和5個N-糖基化位點，無規(guī)則卷曲在預(yù)測的二級結(jié)構(gòu)中占比最大。ATP2B1基因在8月齡姜曲海豬子宮組織中的表達量顯著低于1月齡姜曲海豬子宮組織，說明該基因可能影響姜曲海豬繁殖性狀。

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