5株蘄艾內生細菌的促生因子及其對黃州蘿卜的促生效果研究

徐碧林 彭陳萬里 王鄧玥 張文敬 蔡菲 鄭永良 李世升

摘要：分別利用鉬藍比色法、原子吸收分光光度計、元素分析儀和Salkowski比色法測定5株蘄艾內生細菌溶磷、解鉀、固氮和產IAA的能力，并比較它們對黃州蘿卜種子萌發和幼苗生長的促進作用。結果表明，菌株Acinetobacter pittii lzy-1、Pseudomonas psychrotolerans lzy-2和Pantoea sp. Lzy-3既能溶劑有機磷（8.28～23.72 mg/L），也能溶解無機磷（75.57～342.77 mg/L）；Curtobacterium luteum lzy-9只能溶解無機磷（358.02 mg/L）。5株待測菌株都具有解鉀能力（5.77～19.77 mg/L），lzy1和lzy9具有固氮活性，且固氮能力相當（發酵液氮含量分別為8.55、8.73 mg/L）。除了lzy1，其余4株菌都能產IAA（10.38～15.43 mg/L），其中lzy2產IAA活性最高。5株菌均對黃州蘿卜種子萌發和幼苗的生長具有促進作用。其中lzy2提高發芽勢的效果最為顯著，lzy9對下胚軸長和株高的促生效果最為顯著，增長率分別為191.22%和83.23%；Bacillus cereus lzy-7對單株鮮質量的促生效果最為顯著，增長率達89.09%。本研究為進一步探究蘄艾內生細菌的促生機理以及開發應用于黃州蘿卜的專用微生物菌劑或菌肥奠定了基礎。

關鍵詞：蘄艾內生細菌；黃州蘿卜；微生物菌劑；促生因子；促生特性

中圖分類號：S182 文獻標志碼：A

文章編號：1002-1302（2023）08-0203-08

基金項目：中央引導地方科技發展專項（編號：2018ZYYD019、2019zyyd044）；湖北省教育廳科學技術研究計劃青年人才項目（編號：Q20182901）；湖北省重點實驗室、大別山特色資源開發湖北省協同創新中心聯合開放基金（編號：2021CX03）。

作者簡介：徐碧林（1986—），女，湖北黃岡人，博士，講師，研究方向為微生物生理生化。E-mail：xubilin@whu.edu.cn。

通信作者：李世升，博士，副教授，研究方向為作物發育與育種。E-mail：shishengli@hgnu.edu.cn。

蘿卜（Raphanus sativus L.）別稱萊菔，為十字花科蘿卜屬作物，在世界各地廣泛種植，是全球重要蔬菜之一［1］。作為重要的食用部位，蘿卜肉質根富含多種微量元素、萊菔子素和植物蛋白等，具有較高的營養價值和藥用價值。我國蘿卜產量高、耐貯藏，常年種植面積約120萬hm2，約占世界種植面積的40%，產量約占世界總產量的47%，是備受歡迎的大眾化蔬菜［2-3］。“黃州蘿卜”是黃岡特產，并于2008年獲國家地理標志產品保護［4］。“黃州蘿卜”不僅產量高、適應強，還具有不易糠心、肉質緊脆、耐貯藏等優良性狀和品質，尤其是生食甜、熟食味美、煨湯不稠、回火不爛的特點使其更受廣大消費者喜愛［5-6］。但由于農戶盲目追求高產，長期不合理施用化肥，造成土壤質量下降、環境污染等問題，不但沒有提高蔬菜產量和品質，反而還極大地浪費了資源。因此，不合理施用化肥已成為蔬菜生產中普遍存在的問題［7］。鑒于此，通過微生物菌肥替代或部分替代化肥的研究逐漸成為學者研究的熱點［8-9］。

內生細菌存在于植物的根、莖、葉、花和種子中，對植物的生長具有促進作用［10-12］。例如來源于白化茶的內生細菌能顯著提高水稻和扦插茶葉的生物量［13］；來源于湖平山碎米薺的內生細菌能在硒酸鹽脅迫下促進紅豆杉種子萌發［14］；來自甲烏豆根部的內生細菌對早期幼苗生長具有顯著的促進作用［15］；東鄉野生稻種子內生細菌對水稻幼苗根長、地上部長、干物質和葉綠素含量具有顯著的促進作用［16］。植物促生細菌采用多種機制促進植物生長，且大多是多種機制協同作用［17］。目前已報道的促生細菌的促生機制主要包括以下3個方面：（1）合成促進植物生長發育物質，例如吲哚乙酸（IAA）、植酸酶和吡咯喹啉醌（PQQ）等，尤其是通過色氨酸依賴途徑合成IAA會影響植物的生長［18-19］。 （2）通過固定大氣中的氮、改變根系形態、調節滲透壓、改善磷酸鐵載體的產生、增強增溶活性和調節氣孔等方式促進植物的生長和發育［20-21］。（3）還有一些促生菌能誘導植物產生系統耐受力和系統抗性，使植物抵抗生物類侵害和非生物脅迫，提高植物整體免疫抗病力，進而促進植物生長［22］。近年來，植物促生菌在水稻、小麥、玉米、大豆等大田作物，以及甘蔗、蘋果、辣椒、生菜、番茄、萵苣等果蔬上已有大量應用研究［23-32］。然而，植物促生菌在促進蘿卜種子萌發和苗生長效應等方面的研究鮮見報道。

不同的氣候環境、植物種類以及土壤類型，使得植物促生菌的特性和適宜性不同，導致菌肥效果差異也很大［33］。蘄艾（Artemisia argyi Levl. et Van. var. argyi cv. Qiai）為湖北省蘄春縣特產、中國國家地理標志產品、湖北省道地藥材［34-36］。研究發現，蘄艾含有豐富的內生菌。Cosoveanu等從湖北蘄春野生艾草根莖中分離出43 株內生真菌［37］。Shi等從蘄艾艾葉中分離得到能產新型真菌多酮類化合物和2種已知的酮類類似物的內生真菌Trichoderma koningiopsis QA-3［38］。楊倩從蘄艾根莖中分離純化得到1株產卷線孢菌素的內生真菌HCH285［39］。石小杉從蘄艾葉中分離純化得到2株對水產病害具有較強抑菌效果的內生真菌擬康寧木霉菌QA-3（T. koningiopsis）和綠木霉菌QA-8（T. virens）［40］。本團隊徐碧林等從蘄艾不同組織中分離得到20株具有不同程度的產酶活性及抑菌能力的內生細菌［41］。目前有關蘄艾內生菌促生作用的研究鮮見報道。

因此，本研究采用盆栽試驗，以黃州蘿卜為研究對象，在前期分離得到的蘄艾內生細菌的基礎上，篩選具有溶磷、解鉀、固氮和產IAA等能力的內生細菌，并比較它們對黃州蘿卜種子萌發和幼苗生長的促生效果，旨在為蘿卜種植以及蘄艾內生促生菌資源的開發與利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

供試菌株和蘿卜種子：本試驗所用蘄艾內生細菌Acinetobacter pittii lzy-1、Pseudomonas psychrotolerans lzy-2、Pantoea sp. Lzy-3、Bacillus cereus lzy-7和Curtobacterium luteum lzy-9以及黃州蘿卜種子，均保存于黃岡師范學院經濟林種質資源改良與綜合利用湖北省重點實驗室。

培養基：阿須貝氏培養基用于內生細菌固氮能力的篩選［42］；King氏液體培養基用于內生細菌分泌IAA特性測定［43］；無機磷液體培養基用于內生細菌溶無機磷特性測定［44］；蒙金娜有機磷培養基用于內生細菌解有機磷特性測定［45］；解鉀（鉀長石粉）培養基用于解鉀內生細菌的篩選［46］；LB培養基用于內生細菌的保存與培養［47］。

1.2 方法

1.2.1 促生細菌的初篩和復篩

1.2.1.1 溶磷、解鉀和固氮能力初篩 將純化的蘄艾內生細菌分別接種于無機磷、有機磷、解鉀和阿須貝氏固體培養基上，37 ℃培養24～72 h，分別測量記錄溶磷圈直徑/解鉀圈直徑（D）和菌落直徑（d）比值（D/d）大小，初步篩選具有溶磷和解鉀能力的菌株。觀察記錄菌株在阿須貝氏固體培養基上的生長速度和菌落大小，初步篩選具有固氮能力的菌株。

1.2.1.2 溶磷、解鉀和固氮能力復篩 將初篩得到的解磷、解鉀菌株分別接種到含磷和解鉀（鉀長石粉）液體培養基中，對照加等量無菌水，37 ℃、180 r/min 搖床培養7 d，各接種處理分別設置3個重復。分別用鉬銻抗比色法和原子吸收分光光度計測定發酵液中可溶磷和可溶鉀含量［48］。溶磷/鉀率=［試驗組可溶磷/鉀含量（mg/L）-對照組可溶磷/鉀含量（mg/L）］/試驗組可溶磷/鉀含量（mg/L）×100%。同時用梅特勒-托利多FiveEasy Plus系列pH計測最終的發酵液上清的pH值。參照王明歡等的方法，將篩選得到的具有固氮能力的菌株活化后，接種至100 mL阿須貝液體培養基中，37 ℃、180 r/min 振蕩培養3 d，8 000 r/min離心 10 min，除去上清，稱定沉淀的質量。取一定量的沉淀干燥至呈均勻粉末狀，稱定質量，命名為菌名+菌體1。剩余的菌泥平均分成3份，分別接種至3個150 mL新鮮的阿須貝液體培養基中，37 ℃、180 r/min 振蕩培養7 d，8 000 r/min離心10 min，取上清液旋蒸后冷凍干燥得均勻粉末，稱定質量，命名為菌名+發酵液1。沉淀干燥后稱定質量，命名為菌名+菌體3。然后，利用元素分析儀檢測上述所得3種樣品中的氮含有量［48-49］。

1.2.1.3 產IAA活性測定 采用Salkowski比色法，參照李福艷等的方法［50］，根據標準曲線測定細菌分離IAA的量。

1.2.2 菌株對黃州蘿卜的促生效果試驗設計

1.2.2.1 菌株對黃州蘿卜種子萌發的影響 將篩選出的具有溶磷、解鉀及分泌IAA能力的菌株分別接種于50 mL LB液體培養基中，37 ℃、180 r/min振蕩培養24 h，8 000 r/min離心10 min，將菌體重懸于50 mL無菌生理鹽水中，對菌懸液進行梯度稀釋，配制成D600 nm≈0.5（約1×108 CFU/mL）的菌懸液備用。挑選飽滿、大小一致的新鮮黃州蘿卜種子，用75%無水乙醇浸泡30 s消毒處理后，用無菌水沖洗干凈，置于鋪有3層無菌濾紙的培養皿中，每個培養皿內放30粒黃州蘿卜種子和10 mL菌懸液，每個處理重復3次。將培養皿置于25 ℃恒溫培養箱中黑暗浸種12 h后，轉移至25 ℃溫室培養5 d（空白對照CK使用無菌水處理）。每天觀察，以種子露白作為發芽標準，培養第3天統計發芽勢，第5天統計發芽率并用數顯卡尺測量下胚軸長和胚根長。

1.2.2.2 菌株對黃州蘿卜幼苗生長的影響 將菜園土和營養土以1 ∶1的比例混合，高壓蒸汽滅菌2次（每次121 ℃滅菌1 h）后，等量分裝于底徑9 cm×高11.5 cm×口徑12.5 cm的花盆中備用。根據上述方法對黃州蘿卜種子進行萌發處理，待種子萌發第3天，挑選長度一致的種子，每個花盆種2粒。試驗組每2 d用50 mL約1×108 CFU/mL的菌懸液澆灌，對照用等量無菌水澆灌，每種處理30盆，重復3次。將花盆至于（25±2） ℃溫室，空氣相對濕度65%左右，每個培養架的光照由3根40 W的直管燈管提供，采用每日光培養16 h和暗培養8 h的光周期。培養至第10天進行間苗，每盆留1株苗繼續培養約45 d。測量蘿卜幼苗的株高、鮮質量、根長和葉片數等農藝指標。

上述試驗于2021年3月至2022年4月在經濟林種質資源改良與綜合利用湖北省重點實驗室作物栽培室進行。

1.2.3 數據處理與分析

運用軟件SigmaPlot 14.5和SPSS Statistics 23.0進行數據處理和統計學分析。

2 結果與分析

2.1 促生細菌的初篩和復篩結果

2.1.1 內生細菌溶磷能力比較

經過初篩，發現菌株lzy1、lzy2和lzy3既可溶有機磷，又可溶無機磷，菌株lzy9只能溶無機磷。由表1可知，菌株lzy1、lzy2和lzy3溶有機磷的范圍為8.28～23.72 mg/L，溶磷能力依次為lzy1＞lzy2＞lzy3，溶磷率分別為94.3%、91.7%和83.7%。菌株lzy1、lzy2、lzy3和lzy9溶無機磷的范圍為75.57～358.02 mg/L，溶磷能力依次為lzy9＞lzy1＞lzy2＞lzy3，溶磷率依次為97.4%、97.3%、93.4%和87.8%。試驗組發酵液的pH值均低于對照組。

2.1.2 內生細菌解鉀能力比較

經過初篩，發現5株菌均具有不同程度的解鉀能力。由表2可知，發酵液中可溶鉀含量為5.77～19.77 mg/L，解鉀能力依次為lzy9＞lzy1＞lzy2＞lzy3＞lzy7，解鉀率依次為95.8%、94.8%、91.4%、90.7%和85.5%。

2.1.3 內生細菌固氮能力比較

經過初篩，發現菌株lzy1和lzy9能在不含氮的培養基上生長。由表3可知，這2株菌均可以固定空氣中的氮，且固定的氮一部分用于菌體生長，一部分溶于發酵液中，lzy9的固氮能力略強于lzy1。

2.1.4 內生細菌產IAA活性比較

通過菌株培養液IAA定性試驗對所有菌株進行初篩發現，只有菌株lzy1不產IAA。如圖1所示，這4株菌產IAA的濃度均大于10 mg/L，lzy2產IAA能力最強，達15.43 mg/L lzy9次之 為13.64 mg/L，lzy3和lzy7分別為12.54 mg/L和10.38 mg/L。

2.2 內生細菌對黃州蘿卜的促生效果比較

2.2.1 內生細菌促進黃州蘿卜種子萌發效果比較

分別用5株菌的菌懸液處理黃州蘿卜種子，結果如圖2和表4所示。在種子萌發第3天統計發芽勢，發現5株菌株均在不同程度上提高了黃州蘿卜的發芽勢，發芽勢的增長率依次為lzy2＞lzy3=lzy1=lzy9＞lzy7。在種子萌發第5天統計發芽率，發現試驗組的種子均全部發芽，而對照組的發芽率為90%，發芽率提高10百分點。此外，在種子萌發第5天分別測量幼苗的整體、下胚軸和胚根長度發現，與空白對照組相比，試驗組的上述參數均有不同程度的提高。其中整體長度和下胚軸長度增長率lzy9＞lzy2＞lzy3＞lzy7＞lzy1，[JP+2]整體長度增長率依次為94.0%、88.6%、79.0%、74.6%和73.6%，下胚軸長度增長率依次為191.22%、181.46%、160.49%、151.22%和143.41%。根長增長率lzy1＞lzy2＞lzy7=lzy9＞lzy3，依次為31.6%、28.14%、26.41%、26.41%和23.81%。

2.2.2 內生細菌促進黃州蘿卜幼苗生長的效果比較

分別用5株菌的菌懸液處理黃州蘿卜幼苗，結果如圖3和表5所示。通過對單株幼苗的鮮質量和株高進行統計發現，5株菌對黃州蘿卜幼苗的生長有著不同程度的促進作用。其中單株鮮質量增長率lzy7＞lzy9＞lzy2＞lzy3＞lzy1，依次為89.09%、81.52%、57.27%、41.82%和30.9%；株高增長率lzy9＞lzy7＞lzy3＞lzy1＞lzy2，依次為83.23%、58.42%、41.88%、38.05%和33.31%。

3 討論

內生菌可為植物提供營養成分，也可以通過代謝產物促進植物生長。本研究探討了5株蘄艾內生細菌的4項促生因子（溶磷、解鉀、 固氮、產IAA）及其對黃州蘿卜種子萌發和幼苗生長的影響。結果表明，這5株菌均能產生不同類型的促生因子，且都對黃州蘿卜種子萌發和幼苗生長具有一定的促進作用。

Ashfaq等的研究表明，解鉀細菌A. pittii L1/4和L3/3顯著提高了鹽漬條件下水稻植株的莖長、鮮質量、干質量和葉綠素含量，表現出較強的促生效果［51］。Wan等發現，溶磷細菌A. pittii gp-1具有較強的溶有機磷和無機磷的能力，且能促進鉛的固定化，可顯著改善土壤肥力和質量［52］。Khan等則從麥田中分離到了具有固氮能力的A. pittii［53］。與上述結果類似，本研究發現，蘄艾內生細菌A. pittii lzy-1能溶有機磷（23.72 mg/L）、無機磷（342.77 mg/L）、解鉀（16.23 mg/L）和固氮（菌體和發酵液的氮濃度分別為0.70 mg/g和8.55 mg/L），且對黃州蘿卜種子萌發和幼苗生長均具有較強的促進作用。Passari等發現，能產IAA、激動素和芐基腺嘌呤的P. psychrotolerans能顯著提高番茄的株高、根長和鮮質量［54］。Mei等發現，具有溶磷能力的P. psychrotolerans IALR632能顯著促進番茄的生長［55］。Kang等的研究表明，接種P. psychrotolerans CS51能誘導黃瓜產生內源吲哚-3-乙酸（IAA）和赤霉素（GAs），進而顯著提高了黃瓜植株的生長（根冠長度）和對重金屬的耐受性［56］。本研究結果表明，蘄艾內生細菌P. psychrotolerans lzy2能溶有機磷（16.18 mg/L）、無機磷（139.87 mg/L）以及產IAA（15.43 mg/L），且能顯著促進黃州蘿卜種子萌發和幼苗生長。不僅如此，本研究還發現，P. psychrotolerans lzy2具有解鉀活性，系首次報道具有解鉀活性的P. psychrotolerans。

Rasul等發現，Pantoea sp. MR1能溶解多種不同的難溶磷，且對小麥具有顯著的促生效果［57］。Trifi等的研究則表明，在含磷石膏的土壤中，Pantoea sp. BRM17能促進甘藍型油菜的生長［58］。Wang等研究發現，從莎草葉片中分離得到的Pantoea sp. YSD J2不僅能溶磷、解鉀，還能產IAA，且能顯著促進莎草的生長［59］。Bacillus能促進植物種子萌發、幼苗及根系生長，提高植物產量，改善品質。目前，關于Bacillus促生作用的報道較多。Wang等發現，耐鎘根際B. cereus M4通過產IAA和改善根際土壤環境促進水稻生長，減少鎘的積累［60］。Kumar等的研究表明，B. cereus LPR2可通過產IAA和溶磷來促進玉米的生長［61］。Ali等發現，具有解鉀能力的Bacillus cereus顯著促進了馬鈴薯的生長，使得總產量達40 t/hm2［62］。與上述結果類似，本研究表明，蘄艾內生細菌Pantoea sp. lzy3能溶有機磷（8.28 mg/L）、無機磷（75.57 mg/L）、解鉀（8.97 mg/L）以及產IAA（12.54 mg/L），蘄艾內生細菌B. cereus lzy7能解鉀（5.77 mg/L）和產IAA（10.38 mg/L），且二者都能促進黃州蘿卜種子萌發和幼苗生長。

目前，關于C. luteum促生作用的報道較少，Khan等研究發現，C. luteum SAK2通過產IAA促進鹽脅迫條件下水稻的生長發育［53］。Sturz等發現，C. luteum既可以單獨也可以與Rhizobium spp.聯合使用來促進紅三葉草的生長［63］。Long等的研究表明，C. luteum對紫花苜蓿的生長具有促進作用［64］。與上述結果類似，本研究發現，蘄艾內生細菌C. luteum lzy9對黃州蘿卜種子萌發和幼苗的生長具有促進作用。除此之外，本研究還首次系統地探究了C. luteum lzy9產生促生長因子的效果，結果發現，它不僅能溶無機磷（358.02 mg/L）、固氮（菌體和發酵液的氮濃度分別為0.60 mg/g和8.73 mg/L），還能產IAA（13.64 mg/L）。

近年來，不少研究者致力于促生長因子的特性及其相關性的研究。王奎萍等研究發現，菌株溶磷、固氮和產IAA的能力與促進植物生長效果之間存在明顯的正相關，且固氮和溶磷活性對于植物生長的影響大于產IAA［65］。正如本研究中lzy9雖然產IAA能力不如lzy2，但是其溶無機磷、解鉀和固氮均強于lzy2，因此其對黃州蘿卜種子萌發和幼苗生長的促生效果均強于lzy2。陳崢等的研究則表明，芽胞桿菌促生因子對植物的促生作用是相互獨立的，例如，促生因子（解無機磷、解有機磷、固氮效能、IAA含量、植酸酶活性、PQQ 濃度）之間無相關關系（P>0.05），與番茄種子發芽率、胚根長、胚芽長也無明顯相關關系（P>0.05）［66］，且促生效果好的菌株促生長因子的含量并不一定高，反之也有可能。例如本研究中的lzy7和lzy1，雖然lzy7產促生因子的能力均不如其他菌株，但是其對蘿卜幼苗生長的影響卻強于lzy1、lzy2和lzy3；而lzy1促生因子含量并不低于lzy2、lzy3和lzy7，但是其促生效果卻不如這3株菌。這可能與lzy7的生長速率顯著快于其他幾株菌，而lzy1的生長速率則顯著低于其余菌株有關（結果沒有列出）。本研究還發現，菌株產IAA的能力與其促進蘿卜種子萌發的效果幾乎呈正相關。該結果表明，在無土的種子萌發階段，產IAA的能力對于種子萌發的影響要大于溶磷、解鉀和固氮。總之，促生過程十分復雜，特定的促生因子起到的效果有限，需要聯合多種促生因子共同作用才能起到更好的促生效果。然而，具有高效促生能力的微生物菌劑用于農業生產，不僅能充分利用土壤潛在營養元素，還能減少由于化肥的過度使用造成的土壤退化和環境污染問題，對促進農業可持續發展具有重要意義。本研究還應該結合菌株生長情況，進一步量化其產促生因子的能力。在此基礎上，制備復合菌劑，以最大限度地提高其對黃州蘿卜生長發育的促進作用。此外，本研究篩選到的菌株的田間適應性也有待進一步研究。

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