大麻白絹病生防菌貝萊斯芽孢桿菌的篩選鑒定及發酵條件優化

王芳，曹璐，秦菁菁，林宇豐，許秀美，張政兵，李新文，李毅，程毅，孫正祥

(1.長江大學農學院，湖北 荊州 434000；2.中國農業科學院麻類研究所/南方經濟作物研究中心，湖南 長沙 410221；3.湖南農業大學園藝學院，湖南 長沙 410128；4.湖南農業大學植物與保護學院，湖南 長沙 410128；5.湖南省植保植檢站，湖南 長沙 410006)

大麻(Cannabis sativaL.)是我國傳統的經濟作物，目前為止，科研人員已從大麻植株中提取并鑒定出560 多種化學功能成分[1]。 大麻二酚因其潛在的治療作用，包括保護神經、抗癲癇、抗癌癥[2]及抑菌消炎[3]等功效而愈來愈被看好。 我國大麻種植區廣闊，逐漸形成南部地區以花葉為主、東北地區以纖維為主、中部地區以籽粒為主的產業布局[4]。 大麻白絹病是由半知菌齊整小核菌(Sclerotium rolfsiiSacc.)引起的一種嚴重土傳病害，主要危害植株莖基部和根部，發病嚴重時常導致整株枯死。

目前大麻白絹病的防治方式主要是輪作、土壤消毒以及施用化學農藥，但該病菌可以以菌核形態在土壤中存活多年，部分藥物雖有一定的防效，但長期使用化學藥劑容易產生耐藥性。 因此，挖掘安全、綠色的生防微生物資源，開發新型生物防治辦法意義重大。 柴阿麗等[5]從土壤中分離得到一株副地衣芽孢桿菌(Bacillus paralicheniformis)ZF480，該菌株對十字花科根腫病有良好防治作用，且該菌株對鐮孢菌和黃單胞野油菜變種也有較好的抑制作用。 王亞嬌等[6]從西瓜根圍土中分離獲得一株對西瓜枯萎病具有防治效果的解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)SFJ11，該菌株可以分泌多種胞外水解酶，如蛋白酶和纖維素酶等，此外，該菌株在大田試驗中防治效果可達78%，其防效顯著高于多菌靈的(55.45%)。 許麗婷等[7]從馬鈴薯根際土中獲得一株對立枯絲核菌有較強拮抗作用的枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)XC-1，該菌株通過造成立枯絲核菌菌絲斷裂而抑制菌絲生長。 大田試驗表明，菌株XC-1 在馬鈴薯收獲期對馬鈴薯黑痣病生防效果達到54.51%。 植物內生菌不僅應用于生物防治，其內生菌本身還可以產生與植物相同或相似的生物活性物質，一般認為抑菌活性物質的合成和分泌是細菌最重要的生物防治機制之一，活性物質如表面活性素、脂肽類物質等都可作為藥劑開發利用。 于洪升等[8]從銀杏植株中篩選到一株粗提物有較好抗真菌活性的青霉屬真菌，該真菌粗提物對紅色毛蘚菌的抗菌活性與陽性對照化學藥劑氟康唑的抗菌活性相當，這一發現為尋找新的抗菌活性化合物代替原有化學藥劑開辟了新的途徑。QIN 等[9]從熱帶雨林中的植物里獲得一株具有抗菌活性的放線菌，為新型抗結核藥物的研發提供了新的方向。

課題組人員從云南省工業大麻種植區的健康大麻葉片組織中分離出多株內生生防菌，其中一株對大麻白絹病菌具有顯著拮抗作用。 本研究對該菌株進行了形態學、分子鑒定、生理生化特征測定研究，并結合單因素試驗和響應面法優化該菌株發酵條件，旨在分離大麻內生細菌，并從中篩選挖掘大麻白絹病生防菌資源。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 材料

大麻植株葉片，用于分離大麻內生菌；

供試菌株:大麻白絹病菌(Sclerotium rolfsiiSacc.)(工業大麻葉片內生菌)，用于篩選大麻白絹病原生防菌。

1.1.2 培養基

肉膏蛋白胨培養基(Luria-Bertani 培養基/LB 培養基):蛋白胨10 g/L，酵母提取物5 g/L，氯化鈉10 g/L，PH 7.0～7.2；馬鈴薯葡萄糖培養基(potato dextroseagar，PDA):土豆200 g/L，葡萄糖20 g/L，PH 7.0～7.2；發酵基礎培養基:牛肉膏8 g/L，酵母膏5 g/L，葡萄糖10 g/L，pH 7.0～7.2。

1.1.3 供試土壤

湖南農業大學湘輝農業技術中心研制通用型營養基質土。

1.1.4 主要試劑和儀器

恒溫培養箱:SPX-250B-Z 型，上海博迅醫療生物儀器股份有限公司；超低溫冰箱:DW-HL528型，中科美菱低溫科技有限責任公司；梯度PCR 儀:T100TM Thermal Cycler 型，伯樂生命醫學產品(上海)有限公司；電泳儀:DYY-6C 型，北京六一儀器廠；凝膠成像系統:Tanon 2500 型，上海天能科技有限公司。

細菌基因組提取試劑盒(TIANamp Bacterial DNA Kit):擎科生化科技有限公司購買；細菌鑒定常用引物、PCRmix 及DNA marker:擎科基因股份有限公司提供。

1.2 生防菌的分離篩選和鑒定

收集健康工業大麻植株葉片，選取1 g 葉片組織，搗碎后置于9 mL 無菌水中，漩渦振蕩。 將懸浮液稀釋為10-1、10-2以及10-3三個濃度梯度，每個濃度吸取100 μL 懸浮液涂布至LB 固體培養基平板上，重復3 次。 平板放于28 ℃恒溫培養箱過夜培養36 h，挑選菌落劃線純化。 采用平板對峙培養法將大麻白絹病菌菌餅(直徑為6 mm)接種于PDA 平板(半徑為4.5 cm)中心，將生防菌點接至距平板中心2.5 cm 處，以點接無菌液體培養基的平板為陰性對照組，以點接藥劑苯醚甲環唑(100 倍、200 倍、400 倍和800 倍)的平板為陽性對照[10]，每個處理3 個重復。 2 d 后對照組菌落長滿全皿，測量點接生防菌平板菌絲生長半徑。

1.3 024A 菌株鑒定

1.3.1 形態學觀察

將內生菌024A 接種到LB 固體平板上，30 ℃條件下恒溫培養，光學顯微鏡下觀察菌落生長形態；吸取OD600為0.8 的培養物，離心后棄培養基，收集菌體沉淀于管底，用1×PBS 緩沖液洗2 次，棄上清，沿管壁緩慢加入4 ℃預冷的戊二醛固定液，采用掃描電鏡進行形態顯微觀察。

1.3.2 生理生化鑒定

參照《伯杰細菌鑒定手冊》(第9 版)對菌株進行生理生化鑒定。

1.3.3 16S rDNA 基因序列分析

采用煮沸法提取細菌DNA[11]；細菌擴增通用引物:B27F (5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和U1492R(5′GGTTACCTTGTTACGACTT-3′)；PCR 反應體系(25 μL):Supper Mix 22 μL，DNA模板1 μL，引物(10 mol/L)各1 μL；反應條件:98 ℃5 min；98 ℃30 s，56 °C 30 s，72 ℃1 min，32個循環；4 ℃保存；擴增產物送至擎科生物公司，序列在GenBank 中進行BLAST 比對，采用MEGA 7.0 構建系統發育樹。

1.4 菌株024A 對大麻白絹病的盆栽防效測定

在PDA 平板上培養大麻白絹病原菌3 d，在菌絲長滿培養皿后，用無菌打孔器取直徑6 mm 的菌餅。 用無菌針刺傷工業大麻根部，將菌餅置于基部附近，裹上無菌棉球并噴濕(有利于大麻白絹病菌發病)。 試驗共設2 個處理，每個處理設置9 盆長勢相似的大麻幼苗，每盆生長有1 株大麻幼苗。接種病原菌后處理組于大麻根基部(土壤表面)噴施20 mL 024A 菌液，菌液濃度達1.0×107cfu/mL，以噴施等體積無菌培養液為對照。 幼苗放置于(24±0.2)℃溫室中生長，在處理后第3 天，參照YANG等[12]方法并加以改進，計算病情指數和相對防效。 大麻白絹病病情指數分級如下[13]:

0 級:無病斑；

1 級:枯萎范圍較小，占根莖比例少于1/4；

2 級:枯萎范圍較大，占根莖比例達1/4～1/3；

3 級:枯萎范圍極大，占根莖比例達1/3～3/4；

4 級:成株枯萎，根部壞死。

病情指數=∑(各級病株數×病情級別數)/(植株總株數×最高病情級別數)×100。

相對防治效果(%)=(1-處理組病情指數/對照組病情指數)×100%。

1.5 菌株024A 發酵條件優化

1.5.1 發酵優化結果

以大麻白絹病菌為靶標菌，采用平板對峙法測定024A 菌株發酵液對大麻白絹病菌的抑菌率，并在波長600 nm 下測定024A 菌株發酵液的OD值，結合兩者檢測不同試驗設計下菌株024A 抑菌活性，每個處理進行3 次重復。

1.5.2 單因素法篩選最優碳源、氮源

利用單因素試驗尋找發酵培養基最優碳源和氮源。 碳源供選擇種類有葡萄糖、蔗糖、乳糖、甘油和麥芽糖，濃度為2%；氮源供選擇種類有胰蛋白胨、牛肉粉、酵母浸出粉、氯化銨，濃度為1%。024A 菌株種子液接種量為2%，將種子液接入裝有10 mL 培養基的錐形瓶(50 mL)中，28 ℃、180 r/min震蕩培養24 h，測定菌株024A 在波長600 nm 處吸光度及024A 對大麻白絹病菌抑菌率，每個處理重復3 次。

1.5.3 Box-Behnken Design 設計

應用Design-Expert 軟件設計試驗方案，以前期獲得的最優碳源(A)、最優氮源(B)、發酵溫度(C)和發酵時間(D)為影響因素，菌株024A 對大麻白絹病菌抑菌率(Y)為響應值，進行4 因素3 水平響應面試驗(表1)，試驗分25 組進行，包括3 個中心點重復。 通過Design-Expert 軟件基于二次多項式回歸模型建立設計空間。

表1 Box-Behnken 中心組合因素水平編碼表Table 1 Factors and levels in Box-Behnken center-united experiment design

1.5.4 結果分析

應用Design-Expert V8.0 軟件對試驗數據進行分析，方差分析和回歸方程采用F檢驗進行顯著性檢驗，p＜0.05 代表差異顯著。 采用R2表示多元回歸模型擬合度，R2＞0.9 判斷為優。p＞0.05說明擬合度失擬(Lack of Fit)不顯著，表明回歸模型與數據擬合良好。

2 結果與分析

2.1 生防菌的分離和篩選

從大麻植株的葉片組織中分離篩選到多株對大麻白絹病原菌有拮抗作用的內生菌。 其中，菌株024A 對白絹病菌的抑制率最高，達到75.0%(圖1)，顯著高于陽性對照苯醚甲環唑藥劑稀釋液處理的平板對峙(表2)。

圖1 菌株024A 對大麻白絹病原菌的拮抗結果Fig.1 Inhibitory effect of strain 024A on mycelial growth of Athelia rolfsii

圖2 藥劑苯醚甲環唑對大麻白絹病病原菌的拮抗結果Fig.2 Antagonistic results of difenoconazole against pathogen of cannabis southern blight

表2 024A 及醚甲環唑藥劑稀釋液對辣椒白絹的平板對峙結果Table 2 Plate confrontation results of 024A and diluent of ether methylcyclazole on Athelia rolfsii

2.2 024A 菌株的菌種鑒定

2.2.1 形態學特征

將菌株024A 在LB 固體培養基劃線培養1 d，菌株024A 的菌落呈乳白色，圓形或橢圓形，表面光滑，邊緣規則(圖3A)，2 d 后024A 表面變干燥，呈褶皺狀。 其革蘭氏染色結果呈陽性(圖3B)，通過掃描電子顯微鏡觀察菌株024A 的超微結構，在電鏡下024A 菌體為桿狀(圖3C)。

圖3 菌株024A 的菌落形態及掃描電鏡觀察Fig.3 Colony morphology and scanning electron microscopic observation of strain 024A

2.2.2 生理生化特征

參照芽孢桿菌的生理生化特性，對024A 的氧化酶反應、接觸酶和水解明膠等生理生化指標進行鑒定，結果顯示，菌株024A 能分解利用D-葡萄糖、蔗糖，可以水解明膠和淀粉，接觸酶反應、氧化酶反應呈陽性，吲哚試驗和檸檬酸鹽還原反應呈陰性(表3)。

表3 024A 生理生化特性Table 3 Physiological and biochemical characteristics of strain 024A

2.2.3 024A 16S rDNA 分子鑒定:

通過DNA 提取、PCR 擴增和測序獲得024A16S rDNA 基因片段，該片段在GenBank 上進行比對，結果表明，該菌株與Bacillus velezensis(OP435762.1)序列相似性達到100%。 利用芽孢桿菌屬不同種菌株的16S rDNA 基因序列構建進化樹，發現菌株024A 與貝萊斯芽孢桿菌具有較高同源性，同源性達91%(圖4)。

圖4 基于16S rDNA 基因序列構建菌株024A 的系統發育樹Fig.4 Phylogenetic tree of strain 024A based on 16S rDNA sequence

結合形態和生理生化鑒定結果，確定菌株024A 為貝萊斯芽孢桿菌Bacillus velezensis，上傳數據至GenBank，其登錄號為OP477121.1。

2.3 生防菌溫室防效試驗結果

在工業大麻幼苗期刺傷根部后接種2 塊大麻白絹病菌菌餅，024A 菌液灌根處理，澆灌同體積無菌水作對照。 結果顯示，接種工業大麻白絹病菌6 d 后，對照組幾乎完全發病，發病率和病情指數分別為77.8%與75.0，而處理組分別為22.2%與19.4(圖5)，024A 相對防效為32.24%(表4)。表明菌株024A 對大麻白絹病具有良好的防效。

圖5 生防菌024A 對大麻白絹病的生防效果Fig.5 Control effect of strain 024A on industrial hemp southern blight disease

表4 內生菌024A 對大麻白絹病防治效果Table 4 Control effect of endophytic bacteria 024A on industrial hemp southern blight

2.4 024A 菌株優化

2.4.1 氮源、碳源優化

最佳氮源和最佳碳源優化結果如圖6、表5、表6。 其中葡萄糖作為碳源時抑菌率和OD600值均達到最大(表4)，故選擇葡萄糖作為發酵碳源。 隨葡萄糖濃度增加，024A 細胞數呈現先增大后減少的趨勢(圖6a)，葡萄糖濃度達到10 g/L 時細胞數達到峰值，所以斜面響應試驗葡萄糖濃度取10 g/L為零水平。 酵母粉作為氮源時抑菌率和OD600值均達到最大(表6)，故選擇酵母粉作為發酵碳源。 隨酵母粉濃度的增加，024A 細胞數呈現先增加后減少的趨勢(圖6b)，酵母粉濃度達到15 g/L時細胞數達到峰值，所以斜面響應試驗葡萄糖濃度取15 g/L 為零水平。

圖6 氮源、碳源優化結果Fig.6 Optimization results of nitrogen and carbon sources

表5 不同碳源對菌株生長量及抑菌率的影響Table 5 Effects of different carbon sources on strain growth and inhibition rate

表6 不同氮源對菌株生長量及抑菌率的影響Table 6 Effects of different nitrogen sources on strain growth and inhibition rate

2.4.2 024A 發酵條件響應面優化試驗結果與分析

結合碳源與氮源優化結果，通過Design-Expert 軟件基于二次多項式回歸模型建立設計空間，試驗結果見表7、8。 結果表明，當酵母粉濃度14.12 g/L、葡萄糖濃度11.84 g/L、發酵溫度31.56 ℃、發酵時間17.91 h 時，菌株024A 達到最優發酵條件。 擬合得到二次回歸數學模型:Y=-630.85+22.19A+6.56B+24.00C+18.31D-0.04AB-0.04AC-0.12AD+0.06BC-0.01BD-0.11CD-0.64A2-0.37B2-0.371C2-0.39D2，該模型中，相關系數R2=0.95，說明該模型擬合較好，模型回歸極顯著(p＜0.000 1)，說明該模型可用于024A 發酵濾液抑菌率的預測。F值分析結果表明，4 個要素對抑菌率均有顯著影響，且每兩個因素之間存在一定的交互作用。 方程失擬項為1.98＞0.05，表明其失擬不顯著，說明模型較穩定，能夠很好地進行預測。

表7 Box-Behnken 中心組合試驗設計及菌株024A 發酵優化試驗結果Table 7 Design of Box-Behnken center-united experimentandresults of fermentation optimization test of strain 024A

表8 回歸模型方差分析及顯著性檢驗Table 8 Variance analysis of regression model and significance test

由圖7A、7B、7C 可知，酵母粉濃度取值一定時，隨著葡萄糖濃度由5 g/L 增加到15 g/L、培養溫度由27 ℃升高至33 ℃、培養時間由12 h 延長至20 h，024A 菌株對大麻白絹病菌抑菌率都表現出先升高后降低的趨勢；由圖7A 及7D、7E 可知，葡萄糖濃度取值一定時，隨著酵母粉濃度由10 g/L增加到205 g/L、培養溫度由27 ℃升高至33 ℃、培養時間由12 h 延長至20 h，024A 抑菌率都表現出先升高后降低的趨勢。 而上述結果的響應面分析圖和曲面圖都為凸面圖，說明抑菌率有最大值。 通過求解回歸方程，得到024A 發酵濾液抑菌率最大時的發酵條件為:酵母粉濃度14.12 g/L、葡萄糖濃度11.84 g/L、發酵溫度31.56 ℃、發酵時間17.91 h，預測抑菌率最高可達89.270 3%。

圖7 各影響因素對024A 抑菌率的響應面分析圖及等高線圖Fig.7 Response surface analysis and contour map of influence factors on 024A antibacterial rate

2.4.3 模型驗證

根據前文回歸方程模擬024A 最優培養條件，進行3 次重復實驗驗證，抑菌率分別為87%、86%和90%，平均為87.66%，與預測值89.270 3 較接近，證實了模型的可靠性。 與菌株024A 未進行培養基條件優化時的平板對峙抑菌率(75.00%)相比，優化后024A 的抑菌率提高了12.60%。 優化后得到的024A 發酵條件為:酵母粉濃度14.12 g/L、葡萄糖濃度11.84 g/L、發酵溫度31.56 ℃、發酵時間17.91 h。

3 討論與結論

芽孢桿菌屬、假單孢菌屬和農桿菌屬的細菌作為土壤和植物的內生微生物，在生物防治中發揮著重要的作用，貝萊斯芽孢桿菌因其豐富的次生代謝物質而應用廣泛。 貝萊斯芽孢桿菌不僅可以有效抑制病原菌的生長，且對植物的生長有促生作用。 張小利等[14]發現貝萊斯芽孢桿菌對草莓白粉病有較好的防效。 王安琪[15]發現貝萊斯芽孢桿菌可以顯著促進玉蜀黍根部生長。 本試驗中貝萊斯芽孢桿菌024A 可以有效抑制大麻白絹病菌生長，盆栽試驗中024A 對大麻白絹病的防效能夠達到87.1%。

優化菌株發酵條件能使菌株在有限的培養條件下產生更多功能代謝產物，進而提升菌株總體防效和菌株活性物質產量。 黃慧婧等[16]發現發酵條件優化后的TR-1 上清液對青枯菌的抑菌率約為優化前的2 倍，極大提高了TR-1 發酵液抑菌效果。 劉京蘭等[17]對內生菌解淀粉芽孢桿菌CC09 產Iturin A 培養發酵條件進行優化，結果顯示，發酵條件優化后可顯著提高菌株CC09 產抗菌脂肽Iturin A 的能力。 戴蓬博等[18]發現通過優化培養基可以顯著提高極長鏈霉菌菌株SL01 發酵產物的抑菌活性，極大增加菌株SL01 在紫外線條件下抑菌活性的穩定性。

前期從工業大麻葉片組織中分離出多株可以有效抑制大麻白絹病原菌的細菌。 本研究中菌株024A 對大麻白絹病菌的平板抑制率最高，抑菌率達75.0%，遠高于白絹病常用殺菌劑苯醚甲環唑(56.1%)抑菌率。 綜合024A 菌株形態學、生理生化特性以及16S rDNA 基因的系統發育分析結果，鑒定024A 菌株為貝萊斯芽孢桿菌。 盆栽試驗結果表明，024A 防治效果達到87.1%，該結果表明菌株024A 能有效地防治大麻白絹病。 本研究利用單因素試驗和斜面響應試驗對菌株024A 進行發酵條件優化，獲得菌株024A 的最佳發酵條件:酵母粉濃度14.12 g/L、葡萄糖濃度11.84 g/L、發酵溫度31.56 ℃、發酵時間17.91 h，該條件下的菌株發酵液對大麻白絹病菌抑菌率達87.66%。

本試驗通過優化024A 發酵體系，024A 對大麻白絹病菌的抑制率由75.0%提升到87.6%，顯著提高了貝萊斯芽孢桿菌024A 對大麻白絹病菌的抑制作用。