星油藤根腐病鐮孢屬病原真菌的鑒定及其拮抗菌篩選

劉陽平 張晉媛 林瑞 阮東碩 王偉偉

關鍵詞：星油藤；根腐病；鐮孢菌屬；芽孢桿菌；木霉菌

星油藤（PLukenetia VOILLbilis L．）學名南美油藤，屬大戟科多年生常綠攀援性藤本植物，其種子含油量高達45%～60%，且富含多不飽和脂肪酸，以及抗氧化劑VA、VE和蛋白質等，具有較強的抗氧化性和藥食保健功能，對調整人體血脂、預防心血管疾病、防衰老等作用明顯，被譽為“植物腦黃金”。在我國，星油藤已被列人中國科學院支撐服務國家戰略性新興產業化項目，目前僅在云南西雙版納、海南等少數地區種植。近年來星油藤根腐病發生嚴重，種植3年以上的植株發病率超過50%，癥狀表現為根和莖基部逐漸腐爛并蔓延至全株，導致植株生長遲緩、葉片變黃、枝條枯萎，最后全株死亡。

引起植物根腐病的病原種類較多。繆作清等對三七根腐病病原進行調查和鑒定，發現真菌類群主要包括壞損柱孢菌（Cylindrocarpon de-structans）、三七黃腐病菌（C．didynum）、茄腐鐮孢菌（Fusarium solani）、尖鐮孢菌（F．oxysporum）、草莖點霉（Phoma herbarum）、立枯絲核菌（Rhizocto-nia solani）等。張德珍等報道引起山東省小麥根腐病的病原菌有麥根腐平臍蠕孢菌（Bipolarissorokiniana）、尖鐮孢菌、層出鐮孢菌（F．prolifera-tum）、黃色鐮孢菌（F．culmorurn）等。嚴重威脅油梨產業發展的根腐病病原為樟疫霉菌（Phytoph-thora cinnamomi Rands）。目前，西雙版納星油藤種植區報道的根腐病病原為尖鐮孢菌，海南省陵水縣報道茄腐鐮孢菌可引起星油藤根腐病。經調查發現，海南大學儋州校區星油藤種植園中根腐病亦主要由鐮孢屬病原真菌侵染引起，但具體種尚未見報道。

根部病害所造成的危害往往是毀滅性的，發病初期不易被發現，化學農藥的施用效果不理想，并且選擇性差，大量使用會嚴重降低土壤中有益菌群的數量，所以生物防治是植物根部病害防治的有效手段。本研究對海南大學儋州校區農科基地星油藤根腐病鐮孢屬病原真菌進行分離，并依據柯赫氏法則及分子生物學進行鑒定：同時篩選并鑒定具有潛在開發前景的拮抗菌株，為星油藤根腐病的生物防治提供技術支撐。

1材料與方法

1.1病原物分離與純化

于海南大學儋州校區農科基地采集星油藤根腐病發病病根，病根用自來水沖洗后用吸水紙吸干水分，剪成長為為5mm左右小段，用2%Na-C10消毒2min，轉移至PDA培養基中置于28℃培養箱中倒置培養。待長出菌落，挑取疑似鐮孢菌分離物，進行純化培養，獲得純培養物。觀察分離物菌落形態，并記錄、拍照。

1.2致病性鑒定

將滅菌土分裝在花盆（底部直徑10cm，高約12cm）中，每個花盆種植兩株星油藤，放置于28℃、RH為60%～80%的溫室中培養，并根據花盆中水分情況及時澆水，待星油藤長至5～6葉時，選取長勢較好的幼苗從土壤中取出，并沖洗，用消毒手術刀在幼苗莖基部劃一小傷口，然后用滅菌打孔器在培養7d的分離物菌落邊緣取直徑為5mm菌塊接種在傷口處，將接種幼苗放置在鋪有被無菌水浸濕的吸水紙的搪瓷盤中，用保鮮膜封住保濕。每株分離物接種10株星油藤幼苗，以不接菌為對照。每天觀察發病情況并記錄。待發病后，對發病部位病原菌進行分離，并鑒定是否與接種菌株一致。

1.3TEF序列擴增及測序

將分離物接種于PDA培養基上，放置于28℃培養箱中培養7d后收集菌絲，并利用TIAN-GEN植物基因組DNA提取試劑盒提取基因組DNA，提取方法參照試劑盒說明書。利用引物EFl/EF2，以不同分離物基因組DNA為模板，擴增TEF序列．PCR反應體系及程序參照文獻。擴增產物使用Diamond DiaSpin柱式DNA膠回收試劑盒進行純化回收后，由生工生物工程（上海）股份有限公司測序。

1.4系統發育樹構建

將TEF序列在GeneBank數據庫中進行Blast比對，確定分離物分類地位。基于TEF基因，以Nectriaceaesp.JF740829和Nectriaceaesp.JF740791為外群，使用MEGA X構建NJ樹（neighbor-joining tree），利用自展分析（bootstrap，1000次重復）檢驗各分支的置信度。

1.5拮抗細菌的篩選及鑒定

于健康星油藤植株根部取根際土，稱取10g加入90mL無菌水中混勻制成土壤懸浮液，利用梯度稀釋法分離拮抗細菌，并通過平板對峙試驗進行初篩。挑選具有拮抗效果的單菌落，以十字交叉法接種在距離培養皿1cm處，將致病真菌菌餅（5mm）接種在PDA培養基的正中間，置于28℃培養，以不接種拮抗菌為對照，每處理3個重復。待對照菌落長滿培養皿后以十字交叉法測量菌落直徑，計算拮抗菌株的抑制率。抑制率（%）=（對照組菌落直徑一試驗組菌落直徑）／對照組菌落直徑×1000

選取抑制率大于60%的拮抗細菌提取基因組DNA，以27F/1492R為引物分別擴增16SrD-NA序列，使用Diamond DiaSpin柱式DNA膠回收試劑盒進行純化回收后，由生工生物工程（上海）股份有限公司測序。將序列輸入Gene-Bank數據庫中進行Blast比對，確定拮抗細菌的分類地位。

1.6拮抗木霉菌的篩選

為了篩選對星油藤根腐病具有較好拮抗效果的木霉菌株，選擇1 8株木霉菌（由海南大學植物保護學院劉銅教授惠贈），分別為棘孢木霉（Tri-choderma asperellum）

（HN059、XJ087、G2070、SC012、SCI01、SC098、XJ035、NX043），猥木霉（Zennaceum） LS019-2，哈茨木霉FJ069．綠色木霉，長枝木霉以及木霉菌HN083110-2、NX036、LG004-52、ZJB3-13、LS073 -23、LG027-32（未鑒定種），分別與星油藤根腐病菌DZG-43和DZG-13進行對峙培養，篩選抑制率較高的木霉菌，并驗證非揮發代謝產物對病原菌的抑制效果，對木霉菌拮抗機理進行初步研究。

1.7數據處理與分析

使用軟件IBM SPSS Statistics 21（IBM Corp，Armonk，NY，USA）對數據進行統計分析，在P<0.05水平進行t檢驗。所有試驗至少重復3次。

2結果與分析

2.1病原茵分離

在海南大學儋州校區農科基地星油藤種植園中星油藤根腐病發生嚴重，表現為根和莖基部逐漸腐爛，導致植株生長遲緩、葉片變黃、枝條枯萎，甚至全株死亡。采集根腐病病樣，經分離純化共獲得5株分離物，分別命名為DZG-13、DZG-1、DZG-12、DZG-16和DZG-43。在PDA培養基上，分離物菌落顏色起初呈白色，之后氣生菌絲呈白色至淺粉色，基內菌絲呈白色至黃色（圖1）。

2.2致病性測定

通過室內接種試驗，菌株DZG-13、DZG-12、DZG-43表現出較強的致病力，接種7d后接種部位出現褐色壞死病斑，并向上、向下擴展，最終導致根部腐爛，地上部死亡。菌株DZG-1和DZG-16致病力較弱，接種部位出現褐色病斑，但不擴展。對照未發病，但在根部從土壤中取出過程中導致了不可避免的損傷（圖2）。在病部可重新分離獲得與接種菌株相同的分離物。

2.3病原菌鑒定

將TEF基因序列提交至GeneBank數據庫，菌株DZG-13、DZG-43、DZG-12、DZG-1和DZG-16的登錄號分別為MW115935～MW115939。經Blast比對，DZG-13與Fusarium oxysporumKY859253和F．oxysporum MT313909相似度分別為99.05%和98.89%：DZG-16和DZG-43與F．solani MG857207和F．solani MG857198相似度均為100%; DZG-1和DZG-12與F．solanzMG857207和F．solani MG857198相似度分別為97.94%和95.43%。由圖3可以看出，DZG-13與F．oxysporum AF008504聚類；DZG-1、DZG-12、DZG-16和DZG-43與F．solani聚類，且DZG-16和DZG-43親緣關系更近。結合菌落形態特征，DZG-13鑒定為尖鐮孢菌（F．oxysporurn），DZG-1、DZG-12、DZG-16和DZG-43鑒定為茄腐鐮孢菌（F．solani）。

2.4拮抗細菌篩選與鑒定

拮抗細菌JK-A對鐮孢屬病原DZG-13、DZG-12和DZG-43的抑制率分別為68.19%、68.30%和69.70%，拮抗細菌JK-Z的抑制率分別為69.67%、68.67070和68.44%（圖4）。將擴增獲得的拮抗細菌16S rDNA序列分別在GeneBank數據庫中比對，JK-A與Bacillus cereus序列相似性為99.72%，JK-Z與B．subtilis相似性為99.93%。初步鑒定拮抗菌株JK-A為蠟樣芽孢桿菌（B．ce-reus），菌株JK-Z為枯草芽孢桿菌（B．subtilis）。

2.5拮抗木霉菌篩選

木霉菌株HN083110-2、LG004-52、NX043、ZJB3-13和綠色木霉對星油藤根腐病菌DZG-43具有較高的抑制率，分別為69.26%、67.68%、67.14%、66.35%和65.34%，顯著高于其它菌株（圖5A）；LG004-52、FJ069、XJ087、SC101、G2070、ZJB3-13和NX036對星油藤根腐病菌DZG-13具有較高的抑制率，分別為73.36%、73.30%、71.80%、71.75%、70.97%、70.26%和70.01%，顯著高于它菌株（圖SB）。選取HN083110-2、LG004-52、NX043、ZJB3-13和LG004-52、FJ069、XJ087、SC101分別驗證非揮發代謝物對DZG-43和DZG-13的抑制效果，結果表明．HN083110-2的非揮發代謝產物對DZG-43抑制效果最佳，抑制率為52.94%（圖5C）；FJ069的非揮發代謝產物對DZG-13的抑制效果最佳，抑制率為51.97%（圖5D）。其中，LG004-52的非揮發代謝產物對兩株病原菌均表現出較好的抑制效果。

3討論與結論

鐮孢屬真菌是引起植物根腐病的重要病原之一。由于鐮孢屬真菌的多型性和易變異的特點，使該屬真菌被認為是所有真菌類群中在形態分類上最難鑒定的屬之一。翻譯延伸因子TEF（translation elongation factor l-a）為鐮孢屬種水平上的系統發育提供了非常有用的信息。王琳等利用ITS、TEF和TUB基因對山西省鐮孢菌種群分布及變異進行研究，發現TEF基因最適用于鐮孢菌種類鑒定。

本研究依據柯赫氏法則及基于TEF基因的系統進化分析，確定鐮孢屬真菌的兩個種F．oxys-porum和F．solani都可侵染星油藤根部引起根腐病。分離獲得的5株鐮孢屬病原菌中有4株為F．soLani，說明F．soLani為引起星油藤根腐病的主要致病菌。此外，4株F．solani菌株菌落形態以及致病性存在一定差異，證明F．solani存在一定遺傳多樣性，后續可通過大量采樣，對海南島星油藤根腐病鐮孢屬病原真菌遺傳多樣性進行研究。

本研究篩選獲得兩株拮抗菌株JK-A和JK-Z，通過擴增16S rDNA序列并比對，拮抗菌株JK-A為蠟樣芽孢桿菌（B．cereus），菌株JK-Z為枯草芽孢桿菌（B．subtilis）。芽孢桿菌JK-A和JK-Z對具有較強致病力的鐮孢屬病原菌DZG - 13、DZG-12和DZG-43的致病力均接近70%，可以考慮作為生防菌株進行開發。

木霉菌是一種應用較為廣泛的生防真菌，對多種植物病害具有較好的防治效果。本研究通過對峙培養篩選對星油藤根腐病菌（DZG-43和DZG-13）具有較好防治效果的木霉菌，研究發現，木霉菌對尖鐮孢菌（F．oxysporum）DZG-13的抑制率可以達到70%以上，優于對茄腐鐮孢菌（F．solani）DZG-43的拮抗效果；其中木霉菌株LG004-52和ZJB3-13對兩株病原菌均表現出良好的拮抗效果。木霉菌拮抗病原菌的機制主要包括競爭、寄生以及產生抑菌物質等，本研究對幾株拮抗效果較好的木霉菌非揮發性代謝產物的抑菌效果進行了初步探究，發現HN083110-2的非揮發代謝產物對DZG-43抑制效果最佳，抑制率為52.94%：FJ069的非揮發代謝產物對DZG-13的抑制效果最佳，抑制率為51.97%。其中，LG004-52的非揮發代謝產物對兩株病原菌均表現較好的抑制效果，下一步可對其非揮發代謝產物進行研究，篩選發揮主要功能的代謝物質，有望開發為防治星油藤根腐病的生物農藥。