受害前后的九里香嫩梢對柑橘木虱的吸引作用及其揮發物成分分析

許 鑫,肖莊婷,柯偉政,張旭穎,王瀟瀟,岑伊靜*

(1. 華南農業大學柑橘黃龍病研究室/廣東省生物農藥創制與應用重點實驗室,廣州 510642;2. 中國林業科學研究院高原林業研究所,國家林業和草原局資源昆蟲培育與利用重點實驗室,昆明 650224)

柑橘木虱DiaphorinacitriKuwayama是柑橘類植物新梢期的主要害蟲,是柑橘黃龍病的主要傳播媒介,國外稱為亞洲柑橘木虱。柑橘黃龍病是目前世界柑橘生產上最嚴重的傳染性病害,有亞洲種、非洲種和美洲種,柑橘木虱傳播黃龍病亞洲種和美洲種(Halbert &Manjunanth,2004;Coletta,2005)。雖然柚喀木虱CacopsyllacitrisugaYang & Li在2012年被證實也可攜帶并傳播亞洲柑橘黃龍病的病原菌(Cenetal.,2012;周汶靜等,2012),但是其分布范圍局限在高海拔地區(郭俊等,2012),所以在多數柑橘產區柑橘木虱是黃龍病亞洲種唯一的媒介昆蟲。

化學信息物質是植物與昆蟲之間最為重要的化學信息紐帶,對昆蟲行為有著重要的影響,例如寄主植物定向、取食、交配、產卵、逃避、傳粉行為及天敵昆蟲寄主尋找行為(Tingleetal.,1989;Verkerketal.,1994;Isman,2006;Xu,2018;Maetal.,2019)。而植食性昆蟲對寄主植物造成的取食為害能誘導植物改變其揮發物的組成成分,并持續一段時間(Vet &Dicke,2015)。植物在受植食性昆蟲為害后,會釋放出有別于健康植物的植物揮發物(郝婭和婁永根,2013),從而影響到植食性昆蟲的行為,使其對寄主植物更加喜好或厭惡。

柑橘類嫩芽的揮發物對柑橘木虱尋找、定位、識別寄主植物起著重要的作用(Wenningeretal.,2009)。柑橘木虱成蟲對蕓香科寄主植物具有較強的正趨向反應,特別是最嗜好寄主植物九里香MurrayapaniculateL.(賴劍修和楊清華,1991),推測蕓香科植物中的某些揮發性物質成分為木虱寄主搜索行為過程的介導活性物質。本研究在明確了受柑橘木虱為害后的九里香對柑橘木虱的吸引作用增強的基礎上,采用極性含多種涂層的50/30 μm DVB/CAR/PDMS對木虱為害前后的九里香嫩梢揮發物分別進行萃取,利用氣相-質譜聯用儀(GC-MS)分析鑒定揮發物組分,并確定其化學結構,期望可以從寄主植物九里香中篩選出對柑橘木虱有效的引誘成分,開發引誘劑來監測和防治柑橘木虱。

1 材料與方法

1.1 材料

供試昆蟲及植物:柑橘木虱成蟲采自于華南農業大學柑橘黃龍病研究室在九里香上飼養的種群;九里香為華南農業大學柑橘黃龍病研究室在防蟲網室內隔離種植的3年生盆栽苗,為未受柑橘木虱為害的健康植株。

供試儀器:柑橘木虱選擇性試驗采用自制H型選擇器(PVC材質),該裝置兩側為直徑25 cm、高30 cm的圓柱(僅頂面開放),中間連接臂為直徑1 cm、長10 cm的圓形通道,通道正中間有直徑0.5 cm的圓形入口(圖1);氣相-質譜聯用儀(GC-MS)為Shimadzu QP-2010;手動固相微相萃取裝置和50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取頭為美國supelco公司生產。

1.2 試驗方法

1.2.1柑橘木虱對未受柑橘木虱為害和受為害的九里香的選擇性試驗

(1)柑橘木虱對正受柑橘木虱為害的九里香的趨性:選取兩盆長勢相似均未受木虱為害的九里香,分別放入自制“H”型選擇器的兩側圓柱中,其中一盆九里香接50頭柑橘木虱成蟲,讓其在九里香植株上取食,保鮮膜密封頂端開口以防木虱逃逸。24 h后,在不將正在取食的木虱取出的情況下,將30頭木虱成蟲從測試裝置連接臂的圓孔釋放到裝置內,讓其自由選擇,分別統計進入兩側圓柱的木虱蟲數,測試60頭后,調換選擇器的位置,消除光線和幾何位置影響。試驗重復4次,總共測試120頭蟲。

(2)柑橘木虱對已受柑橘木虱為害的九里香的趨性:選取兩盆長勢相似并未受木虱為害的九里香,分別放入自制“H”型選擇器的兩側圓柱體中,選其中一盆九里香接50頭木虱,24 h后將這些木虱全部取出,并用保鮮膜密封。然后測定柑橘木虱成蟲對受害和未受害九里香的趨性,測定方法同(1)。

圖1 H型選擇器示意圖Fig.1 Sketch of H-type selector

1.2 試驗方法

1.2.2柑橘木虱為害前后九里香揮發物的提取與分析

(1)頂空固相微萃取柑橘木虱為害前后的九里香嫩梢揮發物

選取兩盆長勢相似并未受木虱為害的九里香,選其中一盆取20 g左右的嫩梢放入20 mL頂空瓶中,然后密封,把固相微萃取裝置的萃取頭(50/30 μm DVB/CAR/PDMS)插入玻璃瓶內萃取其揮發物5 h。另一盆九里香接50頭木虱成蟲進行為害24 h后,將木虱全部移出,再取20 g的嫩梢放入頂空瓶中,后續處理方法和上述一致。

(2)木虱為害前后九里香嫩梢揮發物的GC-MS分析

將萃取頭插入GC-MS進樣口,250℃熱脫附樣品5 min進行色譜柱分析。條件參照(萬珊等,2010;楊玉枝等,2015)。GC條件:色譜柱為HP-5毛細管柱,規格為:30 m×0.25 mm×0.25 mm,載氣為高純氦氣(He),載氣流速為1 mL/min,無分流進樣。進樣口溫度:250℃,起始色譜溫度45℃保持3 min,以3℃/min梯度上升至135℃保持2 min,然后以8℃/min升至250℃保持5 min。MS條件:EI檢測器,接口溫度280℃,離子源溫度230℃,離子能70 ev,EI質量范圍40～500 amu/s,將采集到的質譜圖與標準譜庫進行核對并分析。

1.3 數據分析

數據先用Microsoft Office Excel 2013進行初步歸納,然后采用生物統計學分析軟件IBM SPSS Statistics 22.0配對樣本t檢驗和獨立樣本t檢驗進行差異顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 未受為害和受為害的九里香對柑橘木虱的吸引作用

柑橘木虱在“H”型選擇器中選擇未受柑橘木虱為害或受為害的九里香的結果如圖2所示。在將木虱取出和不取出兩種情況下,柑橘木虱選擇受害和未受害九里香的蟲口數差異都極顯著,被為害的九里香對木虱的吸引作用都顯著增強(t分別為6.971、8.660,P分別為0.006、0.003)。在未取出木虱(繼續受為害)的情況下,柑橘木虱對受害九里香的選擇率達到75%±3%;在為害24 h后將木虱取出的情況下,柑橘木虱對受害九里香的選擇率則降至65%±2%,表明帶有柑橘木虱的受害九里香對柑橘木虱的吸引作用更強(t=2.77,P=0.032)。

2.2 柑橘木虱為害前后九里香揮發物的提取與分析

2.2.1揮發性化合物分析

柑橘木虱為害前后的九里香嫩梢揮發性成分均含有烯烴類、醇類、酯類等物質(表1)。

未被為害的九里香揮發性化合物主要含有16種,相對含量從高到低依次為α-姜烯(9.67%)、β-石竹烯(4.37%)、2,6-二叔丁基對甲酚(4.2%)、(S)-β-甜沒藥烯(3.29%)、1-(1,5-二甲基己基)-4-甲基苯(2.43%)、香樹烯(2.04%)、B-倍半水芹烯(1.97%)、α-香檸檬烯(1.67%)、α-柏木烯(1.44%)、甘香烯(1.35%)、桉油烯醇(1.31%)、α-姜黃烯(1.21%)、(R)-β-雪松烯(1.18%)、(+)-喇叭烯(1.1%)、乙酸葉醇酯(1.04%)、β-欖香烯(0.99%)。

木虱為害后的九里香揮發性化合物主要含有15種,相對含量從高到低依次為B-倍半水芹烯(5.63%)、β-石竹烯(5.61%)、α-姜黃烯(5.13%)、(S)-β-甜沒藥烯(4.71%)、甘香烯(3.81%)、順式-β-金合歡烯(3.66%)、(R)-β-雪松烯(3.26%)、(+)-香橙烯(3.03%)、α-香檸檬烯(2.51%)、香樹烯(1.74%)、Epi-β-檀香烯(1.33%)、α-姜烯(1.26%)、十四甲基環七硅氧烷(1.24%)、(+)-喇叭烯(1.16%)、2,6-二叔丁基對甲酚(1.07%)(表1)。

圖2 柑橘木虱對未受其為害和已受其為害九里香的選擇性Fig.2 Selectivity of citrus psyllids to Murraya paniculate of undamaged or damaged by psyllid注:“**”表示同組數據經配對樣本 t 檢驗在0.01水平上差異顯著。Note: “**” indicated that the same group of datas were significantly different at the 0.01 level by the paired sample t test.

2.2.2揮發物相同組分化合物的相對含量變化

在木虱為害前后九里香釋放的同種化合物中,一些成分的相對含量差異比較明顯,在被為害后的九里香中,α-姜黃烯、β-倍半水芹烯、甘香烯、(R)-β-雪松烯、(S)-β-甜沒藥烯、β-石竹烯、α-香檸檬烯、(+)-喇叭烯等物質相對含量明顯高于未被為害的,而α-姜烯、2,6-二叔丁基對甲酚、桉油烯醇、Delta-杜松烯、乙酸葉醇酯、香樹烯等物質相對含量明顯低于未被為害的(表1)。

2.2.3揮發物化學成分的差異

木虱為害前后的九里香揮發性化學物質組分的差異較大,其中孕烯醇酮(圖3-A25)、β-欖香烯(圖3-A24)、2,6-二叔丁基苯醌(圖3-A13)、異丙茴香醚(圖3-A10)、1-(1,5-二甲基己基)-4-甲基苯(圖3-A9)、α-柏木烯(圖3-A8)這 6種僅存在于未被為害的九里香中,而γ-橄欖烯(圖3-B21)、α-愈創木烯(圖3-B12)、Epi-β-檀香烯(圖3-B13)、順式-β-金合歡烯(圖3-B14)、(+)-香橙烯(圖3-B15)、α-菖蒲二烯(圖3-B17)、十四甲基環七硅氧烷(圖3-B18)、α-綠葉烯(圖3-B29)共8種僅存在于被為害后的九里香中(表1)。

表1 HS-SPME提取柑橘木虱為害前后的九里香嫩梢揮發性成分分析結果

續表1 Continued table 1

圖3 九里香揮發物色譜圖Fig.3 Chromatogram of Murraya paniculate volatiles注:A,未受柑橘木虱為害;B,已受柑橘木虱為害。Note: A, undamaged by psyllid; B, after damaged by psyllid.

3 結論與討論

本研究結果顯示相比于未受害九里香,被柑橘木虱為害過的九里香對柑橘木虱成蟲的吸引作用顯著增強。Loughrin等(1995)研究發現相比于健康的寄主海棠葉,日本麗金龜Popilliajaponica為害后的海棠葉對日本麗金龜更具有引誘效果。Carroll等(2008)研究發現草地貪夜蛾Spodopterafrugiperda為害玉米后釋放的萜類等揮發性化合物對其幼蟲具有引誘作用,以確定寄主植物的位置。被植食性昆蟲為害的寄主植物可能會促進對同種植食性昆蟲的吸引作用。

在為害后未將木虱取出和為害后將木虱取出的兩種情況下,前者柑橘木虱的選擇率(75%±3%)顯著高于后者(65%±2%),原因可能是在為害后未將木虱取出的情況下,影響木虱趨性為3種揮發物的混合物(健康九里香揮發物、木虱為害誘導的九里香揮發物、木虱蟲體揮發物);而在為害后將木虱取出的情況下,影響木虱選擇則為兩種揮發物的混合物(健康九里香揮發物、木虱為害誘導的九里香揮發物)。楊樺等(2010)發現竹橫錐大象Cyrtotrachelusbuqueti雌、雄成蟲的蟲體揮發物對異性成蟲都有吸引作用,證明蟲體揮發物能夠對同種其他個體產生吸引作用。

本研究采用頂空固相微萃取和GC-MS方法提取分析受木虱為害前后九里香揮發物的成分。Robbins等(2012)用頂空動態收集健康九里香的揮發物,通過GC-MS分析發現β-石竹烯含量高達7.8%,α-姜烯含量高達4.4%。Arya等(2017)從北阿坎德邦地區(印度)本地種的九里香葉片經水蒸餾提取得到揮發油,通過GC-MS分析發現β-石竹烯含量為(3.25%),α-姜黃烯含量為(3.54%),并且該地區本地種、野生種九里香揮發油成分差異較大。這與本研究利用頂空固相微萃取九里香揮發物收集到的主要組成成分的結果較相似。

受木虱為害前后的九里香嫩梢釋放的揮發性化學物質種類差異較大,相同組分化合物的相對含量差異比較明顯,這可能是由于柑橘木虱吸食九里香韌皮部汁液時,從唾液腺中分泌一些特殊物質并破壞寄主的防御反應,進而改變寄主植物的揮發性次級代謝產物。喬海莉等(2015)研究發現白木香Aquilariasinensi在受到植食性昆蟲黃野螟Heortiavitessoides取食后,會釋放蟲害誘導植物揮發物,明顯多于健康植株的揮發物。顧丁(2009)研究發現健康蠶豆Viciafaba揮發物組成種類(46種)多于南美斑潛蠅Liriomyzahuidobrensis為害誘導的蠶豆揮發物(43種),并且揮發物組成種類差異較大。Rioja等(2016)研究發現較高的葉螨Oligonychusyothersi種群密度和連續葉螨取食可以增加鱷梨Perseaamericana嫩梢揮發物的排放量。這些試驗結果與本試驗中木虱為害前后揮發性化學物質組成和種類差異較大的結果相似,木虱為害后的九里香揮發物比未受害九里香多兩種,可能為蟲害誘導產生的物質。。

九里香在受柑橘木虱為害后,會釋放出不同于未受害植物的揮發物,進而吸引其它柑橘木虱聚集取食,推測為害前后九里香的差異性揮發物成分可能在柑橘木虱寄主定位行為過程發揮著重要作用,可介導柑橘木虱行為調控的九里香揮發物活性成分有待進一步篩選測試。柑橘木虱的蟲體揮發物對其他木虱個體可能也具有吸引作用,但此類揮發物目前還沒有研究報道,其活性成分有待研究。

致謝：感謝澳大利亞西悉尼大學Andrew Beattie教授對本研究的熱情指導和幫助。