24 個水稻抗稻瘟病單基因系的抗性評價與利用前景分析

李小娟，彭建，文吉輝，于江輝，周小平，余成，朱艷，肖友倫?

(1 湖南省植物保護研究所，湖南 長沙 410125；2 常德市農(nóng)林科學研究院，湖南 常德 415000；3 湖南金色農(nóng)華種業(yè)科技有限公司，湖南 長沙 410128)

水稻是我國最重要的糧食作物，稻瘟病是危害我國水稻生產(chǎn)的3 大病害之一，一般引起水稻減產(chǎn)20%～30%，嚴重情況下可減產(chǎn)50%以上甚至絕收[1]。湖南省隸屬長江中下游稻區(qū)，其水稻播種面積與產(chǎn)量均位居全國前列，但近年稻瘟病年均發(fā)生面積達30 萬hm2，給水稻生產(chǎn)造成嚴重威脅[2]。生產(chǎn)實踐證明，在控制稻瘟病流行與危害的諸多措施中，選育與利用抗性品種被認為是最經(jīng)濟與安全有效的方法[1]。利用傳統(tǒng)育種技術(shù)選育抗性品種周期較長，且較難兼顧產(chǎn)量與米質(zhì)，通過分子標記輔助選擇技術(shù)跟蹤抗性基因是培育抗性品種最快速有效的手段，不但可以有目的地利用某一特定抗性基因，還可在短時間內(nèi)實現(xiàn)多個抗性基因的聚合，培育出持久廣譜抗稻瘟病品種[3]。然而，為在育種與生產(chǎn)上合理利用抗稻瘟病基因，必須明確抗性基因在特定稻區(qū)的抗性水平及其應用價值。為此，各國學者利用抗性單基因品系開展了相關(guān)研究。Hossain等[4]研究認為，孟加拉國水稻抗瘟性育種與生產(chǎn)應用上主要推薦Pi－9(t)、Pi－sh、Pi－ta與Pi－ta2等基因。Nguyet 等[5]研究揭示，Pi－sh、Pi－km、Pi－ta、Pita2、Pi－1、Pi－kh、Pi－k、Pi－kp、Pi－7(t)、Pi－9(t)、Piz5(即Pi－2)等基因在越南水稻生產(chǎn)上均具應用前景。我國對抗性單基因在水稻生產(chǎn)與育種上的應用在黑龍江[6]、湖南[7]、四川[8]等省均有相關(guān)報道。然而，上述研究均采用室內(nèi)接種方法，試驗結(jié)果較田間偏重，加之接種菌株群體在稻區(qū)的代表性有限，且室內(nèi)接種未鑒定穗頸瘟的抗性。因此，有必要在田間病圃對單基因品系的抗瘟性進行鑒定，以全面了解這些基因?qū)γ缛~瘟與穗頸瘟的田間抗性，從而為其合理利用提供依據(jù)。

湖南桃江病圃位于湖南省桃江縣高橋鎮(zhèn)羅溪村，病圃四面環(huán)山、日照時間短、結(jié)露時間長、濕度大，具備稻瘟病發(fā)生流行有利條件，長期是湖南省水稻稻瘟病抗性鑒定基地，其病菌群體與小種類型在所在稻區(qū)具有代表性[9－10]。為此，本研究于2020—2021 年在該病圃鑒定評價了水稻主要抗稻瘟病單基因品系的抗性，以期為湖南乃至長江中下游稻區(qū)水稻抗病分子育種和含不同抗性基因品種的合理利用與推廣提供更科學的指導。

1 材料與方法

1.1 供試水稻材料

普感品種麗江新團黑谷(LTH)及24 個水稻抗稻瘟病單基因系品種，其原種由中國水稻研究所與四川省農(nóng)業(yè)科學院植物保護研究所提供。24 個單基因系品種具有LTH 遺傳背景，是通過含相應基因的供體與LTH 回交選育而成[11]，具體名錄及所含抗病基因信息詳見表1、2。抗病品種特特普(Tetep)，由本課題組保存并繁殖。

表1 抗稻瘟病單基因系在桃江病圃的苗葉瘟抗性鑒定與評價結(jié)果Table 1 Results of resistance identification and evalutation of 24 monogenic lines to leaf blast in Taojiang nursery

1.2 苗葉瘟與穗頸瘟田間病圃自然誘發(fā)鑒定與評價

田間病圃苗葉瘟與穗頸瘟抗性鑒定試驗地設置在湖南桃江病圃。26 個供試品種于每年5 月中下旬播種，采用條播方式，秧廂中間播種普感品種LTH，兩邊隨機播種24 個單基因系及抗病對照品種Tetep。移栽前鑒定苗瘟，待普感品種LTH 充分發(fā)病(病級7 級以上)后，調(diào)查單基因與Tetep 的苗瘟病級。大田分蘗盛期鑒定葉瘟，每個單基因品種分小區(qū)隨機排列種植、栽插30 蔸。為使其充分發(fā)病，每個單基因系至少有一側(cè)臨近普感品種LTH，大田四周栽植普感品種，且普感品種種植3 行以上。水稻黃熟初期鑒定穗頸瘟抗性，穗頸部或離穗頸1/2 處以下部位主軸發(fā)病的稻穗才被認為是穗頸瘟，同一品種每重復逐穗記錄與調(diào)查其發(fā)病情況，以上試驗均設置3 次重復。

苗葉瘟調(diào)查時，根據(jù)葉片病斑形狀與發(fā)病面積進行病級分級，具體標準詳見農(nóng)業(yè)行業(yè)標準?水稻品種試驗稻瘟病抗性鑒定與評價技術(shù)規(guī)程?(NY/T 2646－2014)。苗葉瘟統(tǒng)計分析時，同一品種每重復取發(fā)病最嚴重葉片的病級，而每品種的病級取3 次重復的平均值。穗頸瘟調(diào)查時，每重復隨機調(diào)查100 穗，再根據(jù)發(fā)病穗數(shù)計算穗頸瘟發(fā)病率。基于發(fā)病率對穗頸瘟進行分級，具體標準如下:發(fā)病率＝0.0%，為0 級；0.1%≤發(fā)病率≤5%，為1 級；5.1%≤發(fā)病率≤10.0%，為3 級；10.1%≤發(fā)病率≤25.0%，為5 級；25.1%≤發(fā)病率≤50.0%，為7 級；發(fā)病率≥50.1%，為9 級。穗頸瘟統(tǒng)計分析時，每品種發(fā)病率及其病級均取3 次重復的平均值。

苗葉瘟與穗頸瘟抗性評價標準如下:平均病級<0.1，評價為高抗(HR)或免疫(IM)；0.1≤平均病級≤2.0，評價為抗(R)；2.1≤平均病級≤4.0，評價為中抗(MR)；4.0≤平均病級≤6.0，評價為中感(MS)；6.1≤平均病級≤7.5，評價為感(S)；7.6≤平均病級≤9.0，評價為高感(HS)。依據(jù)上述標準，分別評價2020、2021 年24 個單基因系及抗感病對照品種的苗葉瘟與穗頸瘟抗性水平，綜合評價結(jié)果分別取2 年中苗葉瘟與穗頸瘟較嚴重的年份。

2 結(jié)果與分析

2.1 抗稻瘟病單基因系在桃江病圃的苗葉瘟抗性評價

2020—2021 年，24 個抗稻瘟病單基因系與抗感病對照品種在桃江病圃的苗葉瘟鑒定與評價結(jié)果見表1。普感品種LTH 苗葉瘟病級2 年均為9 級，苗葉瘟發(fā)病充分，試驗結(jié)果可靠。評價結(jié)果進一步顯示，這2 年中均無單基因系對苗葉瘟表現(xiàn)抗或高抗水平，2020 年僅IRBLz5－CA、IRBL1－CL、IRBL7－M、IRBLta2－Pi 等4 個單基因系表現(xiàn)中抗苗葉瘟，分別含有Pi－z5、Pi－1、Pi－7(t)與Pi－ta2，其余單基因系對苗葉瘟均表現(xiàn)中感及以上水平，其中含Pi－i、Pi－t與Pi－20等單基因的品系最感病。2021 年除上述4個單基因系對苗葉瘟表現(xiàn)中抗外，還有IRBLkp－K60、IRBLkm－Ts 等品系也表現(xiàn)中抗苗葉瘟，因此抗性表現(xiàn)較好的單基因有Pi－z5、Pi－1、Pi－7(t)、Pita2、Pi－kp與Pi－km，其余單基因系都表現(xiàn)中感及以上水平。綜合2 年結(jié)果，含Pi－z5、Pi－1、Pi－7(t)與Pi－ta2等單基因的品系苗葉瘟抗性較好。

2.2 抗稻瘟病單基因系在桃江病圃的穗頸瘟抗性評價

2020—2021 年，24 個抗稻瘟病單基因系與抗感病對照品種在桃江病圃的穗頸瘟發(fā)病率及其病級與抗性評價結(jié)果見表2。2020—2021 年普感品種LTH穗頸瘟發(fā)病率均在90%以上、病級為9.0 級，穗頸瘟發(fā)病充分。進一步分析表3 結(jié)果，2020 年鑒定的24個單基因系中，IRBLz5－CA(含Pi－z5)、IRBL1－CL(含Pi－1)、IRBLta2－Pi(含Pi－ta2)對穗頸瘟表現(xiàn)抗級(R)水平，IRBLta－KI(含Pi－ta)、IRBL12－M(含Pi－12(t))、IRBLkm－Ts(含Pi－km)表現(xiàn)中抗(MR)水平，其它18 個品系均對穗頸瘟表現(xiàn)中感及以上，其中含Pi－i、Pi－20、Pi－a、Pi－ks、Pi－z、Pi－t與Pi－19(t)的品系最感病。2021 年，對穗頸瘟表現(xiàn)抗級水平分別為含Pi－1、Pi－9(t)基因的品系IRBL1－CL、IRBL9－W，表現(xiàn)中抗水平的為IRBLkp－K60、IRBLkh－K3、IRBLz5－CA、IRBL12－M、IRBLkm－Ts、IRBLta2－Pi 等單基因品系，它們分別含有Pi－kp、Pi－kh、Piz5、Pi－12(t)、Pi－km、Pi－ta2，含其它單基因的品系都對穗頸瘟表現(xiàn)中感及以上水平，其中含Pi－i、Pi－20、Pi－zt的品系最感病。綜合2 年結(jié)果，含Pi－1、Pi－z5、Pi－ta2、Pi－12(t)與Pi－km的品系對穗頸瘟表現(xiàn)抗或中抗水平。

表2 抗稻瘟病單基因系在桃江病圃的穗頸瘟抗性鑒定與評價結(jié)果Table 2 Results of resistance identification and evalutation of 24 monogenic lines to neck blast in Taojiang nursery

表3 水稻主要抗稻瘟病單基因?qū)γ缛~瘟與穗頸瘟抗性的綜合評價Table 3 Comprehensive evaluation of resistance of 24 major blast resistance genes to leaf and neck blast

2.3 抗稻瘟病基因在桃江病圃的抗性綜合評價及利用前景分析

對2020—2021 年24 個單基因系在桃江病圃的苗葉瘟與穗頸瘟抗性結(jié)果進行綜合評價，結(jié)果見表3。基于連續(xù)2 年的綜合評價結(jié)果，表明含Pi－z5、Pi－1、Pi－ta2的品系在湖南桃江病圃對苗葉瘟與穗頸瘟均有較好的抗性，這3 個基因首薦在湖南水稻抗病育種與生產(chǎn)上應用。其后，有應用價值的基因依次為Pi－12(t)、Pi－km，這2 個基因雖對苗葉瘟表現(xiàn)中感，但2020—2021 年對穗頸瘟均表現(xiàn)中抗，可作為替補的有效基因應用于抗性育種。Pi－7(t)基因雖對苗葉瘟表現(xiàn)中抗水平，但2020—2021 年的穗頸瘟發(fā)病率均達到了20%左右；Pi－9(t)、Pi－ta在桃江病圃對苗葉瘟與穗頸瘟皆表現(xiàn)中感，因此，對含上述單個基因的品種在抗病育種與生產(chǎn)上應用需謹慎。2020—2021 年對苗葉瘟與穗頸瘟都表現(xiàn)感病或高感水平的單基因有Pi－sh、Pi－11、Pi－k、Pi－b、Pi－5(t)、Pi－i、Pi－20、Pi－a、Pi－ks、Pi－z、Pi－zt、Pi－t與Pi－19(t)等，這些基因在育種與生產(chǎn)上已失去應用價值。

3 討論

目前，已鑒定或定位的水稻抗稻瘟病基因至少在100 個以上，但抗譜較廣被應用廣泛的僅少數(shù)基因，主要有Pi－1、Pi－z5(即Pi－2)、Pi－9(t)、Pi－ta、Pi－ta2與Pi－kh(即Pi－54)等，這些基因被證實具有廣譜抗性，在自然病圃的田間抗性表現(xiàn)較好[12]。我國湖南省及長江中下游地區(qū)水稻區(qū)域試驗新品種均須在湖南桃江病圃鑒定稻瘟病抗性，其抗瘟性達到審定標準的品種才能在該稻區(qū)審定與推廣應用。本研究通過2020—2021 連續(xù)2 年的抗性監(jiān)測，明確了含Pi－1、Pi－z5與Pi－ta2等單基因的品系在桃江病圃對苗葉瘟與穗頸瘟均具有較好抗性，這3 個基因在抗性育種與生產(chǎn)上最具利用前景。Pi－1基因源于利比亞粳型品種“LAC23”。Hua 等[13]研究表明，該基因?qū)ξ覈＝ā⒑稀⒃颇稀①F州、四川、江蘇、遼寧、黑龍江等省菌株的抗性頻率都在70%以上，廣譜抗性明顯，可作為抗性育種與生產(chǎn)上的有效基因廣泛應用。研究發(fā)現(xiàn)，Pi－1在廣東從化病圃具有較好的田間抗性，對廣東稻瘟病菌的抗菌頻率達82.2%，抗譜很廣，目前在廣東已利用該基因育成了一批雜交稻不育系與恢復系[14－15]。Pi－z5(Pi－2)，它對分離自我國各稻區(qū)的792 個稻瘟病菌中的絕大部分菌株表現(xiàn)抗性，只有7.55% 的小種能使其致病[16]，已被廣泛應用于育種與生產(chǎn)中[17]。Pi－ta2抗譜廣于Pi－ta基因，初步判斷其與Ptr為同一基因。Zhao 等[18]研究發(fā)現(xiàn)，在IRRI 3 000 份水稻基因組重測序材料中，僅48 份含有Ptr抗性基因型，表明該基因在水稻抗病育種方面具有廣闊的應用前景。另外廣譜抗性基因Pi－9(t)、Pi－ta也有廣泛利用[19]。但據(jù)本研究結(jié)果，含這兩個基因的單基因品系在桃江病圃對苗葉瘟與穗頸瘟均表現(xiàn)中感水平，這2 個基因宜與其它抗性基因聚合應用。

根據(jù)本研究結(jié)果，已測試的24 個稻瘟病主效抗性單基因在桃江病圃大多表現(xiàn)出較差的田間抗性；加之，含單個抗稻瘟病基因的品種其抗性降低甚至喪失的風險較大，因而，在抗性育種與生產(chǎn)中，在對水稻產(chǎn)量和品質(zhì)沒有明顯不利影響的前提下，推薦聚合至少2 個有效的抗性基因，且其中至少一個單基因在特定稻區(qū)具有廣譜或較好的田間抗性，如針對湖南桃江病圃，推薦Pi－1和Pi－2、Pi－1和Pi－9(t)及Pi－2和Pi－ta等基因聚合方式。此外，目前國內(nèi)外鑒定和定位的稻瘟病抗性基因已超過100 個，但育成的具有普感品種背景的水稻單基因品系偏少，如本研究只用了其中的24 個，大部分基因由于缺乏相應單基因品系而無法評價其田間抗性，影響了其在育種與生產(chǎn)上的應用。

4 結(jié)論

24 個水稻抗稻瘟病單基因品系在湖南桃江病圃呈現(xiàn)出不同的田間抗性水平，其中，苗葉瘟抗性表現(xiàn)較好的為含Pi－z5、Pi－1、Pi－7與Pi－ta2等單基因的品系，穗頸瘟抗性表現(xiàn)較好的為含Pi－1、Pi－z5、Pi－ta2、Pi－12(t)與Pi－km等單基因的品系。綜合來看，含Pi－1、Pi－z5、Pi－ta2等單基因的品系對苗葉瘟與穗頸瘟皆表現(xiàn)出較好的田間抗性，這3 個基因在生產(chǎn)上最具利用前景，可單獨或與其它抗性基因聚合應用。