免疫原性細胞死亡在口腔腫瘤中的初步機制*

曾宇祺，郭麗娟，楊森

563000 貴州 遵義，遵義醫(yī)科大學口腔醫(yī)學院/附屬口腔醫(yī)院 口腔頜面外科（曾宇祺、郭麗娟、楊森）；629000 四川 遂寧，遂寧市中心醫(yī)院 口腔頜面外科（曾宇祺、郭麗娟、楊森）

頭頸部癌癥是全球最常見的癌癥類別之一［1］，其中由人類乳頭狀病毒、吸煙或飲酒誘發(fā)相關的口腔癌病例正在增加［2］。口腔癌中超過90%來源于鱗狀組織，稱口腔鱗狀細胞癌（oral squamous cell carcinoma，OSCC），是口腔中最常見的惡性腫瘤［3］。近年來，免疫治療在對抗癌癥細胞方面起著重要作用，據文獻報道，不同治療手段刺激口腔腫瘤細胞后，不僅可將腫瘤細胞殺死，而且可在其表面表達多種抗原信號分子，恢復腫瘤細胞的免疫能力，呈現一種針對死亡細胞宿主的適應性抗腫瘤免疫形式，即免疫原性細胞死亡（immunogenic cell death，ICD）［4］。ICD 誘導劑可引導口腔腫瘤細胞發(fā)生應激、自噬和壞死等活動，使腫瘤細胞釋放多重抗原分子，發(fā)生免疫性死亡［5］。有研究表明，Ⅰ型誘導劑（如蒽環(huán)類、他汀類抗癌藥物）在臨床較為常見，可間接參與內質網（endoplasmic reticulum，ER）活性氧簇（reactive oxygen species，ROS）生成，觸發(fā)輕微ER 應激（endoplasmic reticulum stress，ERS），致腫瘤細胞發(fā)生 ICD［6］；Ⅱ型誘導劑［如光動力療法（photodynamic therapy，PDT）、高靜水壓或溶瘤病毒（oncolytic virus，OVs）］在臨床應用較少，可直接作用于腫瘤細胞，觸發(fā)強烈ERS，導致蛋白質不能或錯誤折疊，此類蛋白累積后可激活未折疊蛋白反應（unfolded protein response，UPR）［7］，而后進入 ICD 過程。

在口腔腫瘤細胞ICD過程中，各種損傷相關分子模式（damage-associated molecular patterns，DAMPs）表達上調，DAMPs暴露或釋放出來，以“find me”或“eat me”的信號調節(jié)不同的免疫反應，促進抗原呈遞細胞和/或吞噬細胞的成熟和活化，參與免疫抗原呈遞［8］。ICD誘導劑作用口腔腫瘤細胞時DAMPs表達的情況包括：（1）鈣網蛋白（calreticulin，CRT）暴露到細胞表面；（2）熱休克蛋白（heat shock protein，HSP）轉位和Ⅰ型干擾素（typeⅠ interferon，IFNⅠ）分泌；（3）高遷移率族蛋白B1（high mobility group box protein B1，HMGB1）中晚期釋放；（4）三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）釋放（圖 1）。未成熟樹突狀細胞（dendritic cells，DCs）上的模式識別受體與以上信號結合，未成熟DCs變成熟DCs，進而吞噬凋亡腫瘤細胞，并將其與主要組織相容性復合體Ⅰ（major histocompatibility complexⅠ，MHCⅠ）和成本刺激分子（CD83/86）一起呈遞給CD8+T細胞，特異性激活細胞毒性 T淋巴細胞（cytotoxic T lymphocyte，CTL）；另外，腫瘤細胞分泌的細胞因子招募天然殺傷（natural killer，NK）細胞參與調控適應性免疫應答發(fā)生［9-10］。

圖1 ICD誘導劑作用口腔腫瘤細胞時DAMPs表達的情況Figure 1. DAMPs Expression When ICD Inducers Act on Oral Tumor Cells

1 口腔腫瘤ICD時釋放DAMPs的機制

1.1 ERS

當口腔腫瘤細胞受到“侵襲”時，ER在內外界因素“壓力”下發(fā)生“保護性反應”，此時細胞內蛋白質因凝集障礙導致折疊濃度下降，激活UPR適應和防御機制，消亡腫瘤細胞啟動ERS以維持內部穩(wěn)定［11-12］。ERS的常見誘因有缺氧、酸中毒、營養(yǎng)剝奪等外在因素，以及致癌活化、遺傳改變、釋放能力惡化等內在因素［13］。腫瘤細胞釋放的可溶性信號因子如細胞外囊泡、蛋白質或乳酸可將原生細胞與骨髓來源細胞建立聯(lián)系，引起傳播性ERS（transmissible endoplasmic reticulum stress，TERS），并以此聯(lián)系細胞的凋亡過程［14］。在口腔腫瘤方面，李若焓等［15］研究發(fā)現，ERS狀態(tài)的OSCC癌細胞可誘導小鼠胰島素瘤MIN6細胞出現TERS并引起胰島β細胞應激，抑制胰島素合成。

研究顯示，ER主要通過三類感受器激活UPR的防御反應：（1） 蛋白激酶RNA樣ER激酶（protein kinase RNA-like ER kinase，PERK）。 作 為 ROS 調控的ERS臂和UPR膜感受器之一，PERK可導致eIF2α的磷酸化，抑制蛋白質生成［16-17］。活化轉錄因子 4（activating transcription factor 4 ， ATF4）［18］和CCAAT/增強子結合蛋白同源蛋白（C/EBP-homologous protein， CHOP）［19］是 ER 應激誘導口腔腫瘤細胞ICD的關鍵因素，同樣促進細胞凋亡的還有 DNA 損傷誘導基因（GADD153）［20］。綜上，PERK/ ATF4通路激活其下游的凋亡信號因子CHOP/ GADD153表達，促進腫瘤細胞發(fā)生ICD；（2）肌醇需要跨膜激酶/內切酶（inositol requires transmembrane kinase/endonuclease enzymes， IRE1）通路。作為一種ER 膜I型跨膜蛋白，IRF1可介導X盒結合蛋白1誘導UPR，促進細胞生存，但IRF1過表達也會促進口腔腫瘤細胞的凋亡。IRF1活化后，其攜帶的酶位點與腫瘤壞死因子受體相關因子 2（TNF-receptor-associated factor 2，TRAF2）和凋亡信號因子調節(jié)激酶 1（apoptosis signal-regulating kinase 1，ASK1）共 同 形 成 ER 外 膜 上 的 IRE1-TRAF2-ASK1 復合體。上述復合體可激活c-Jun氨基末端激酶（c-Jun amino-terminal kinase，JNK）、P38和有絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）磷酸化，誘導CHOP的表達，形成IRE1/CHOP通路或下游通路，介導腫瘤細胞發(fā)生 ICD［21］；（3） 活化轉錄因子 6（activating transcription factor 6， ATF6）。ATF6 是細胞 ER 膜上的Ⅱ型跨膜蛋白，ERS 使ER腔結構結合免疫球蛋白（BIP，也稱為GRP78）從 ATF6上分解，在ERS條件下，BIP與ER應力傳感器無法正常結合，從而促進蛋白質折疊［22］。激活的ATF6進入胞核與核轉錄因子（NF）Y結合，再與啟動子 ERSE（ER stress response element）元件結合形成 ATF6-（NF）Y-ERSE復合體，該復合體進而誘導包括CHOP在內的 ER應激基因的轉錄表達，形成ATF6/CHOP通路，介導腫瘤細胞凋亡［23-24］。

1.2 CRT暴露

CRT是一種可溶和高度保守的ER分子伴侶，具有Ca2+穩(wěn)態(tài)、MHCⅠ內外組裝等功能［25］。化療或放療等治療手段作用腫瘤細胞ICD的早期，ERS狀態(tài)可致CRT大量轉移到細胞質膜外部并暴露，釋放“eat me”信號，被DCs識別和結合，或在CD47和MHCⅠ等細胞共同刺激下殺傷腫瘤細胞［26-27］。Sankaya等［28］測量小鼠 OSCC MOC1和 MOC2細胞用X射線和質子輻照后CRT在胞膜上的水平，發(fā)現免疫信號CRT表達的基線水平相對較高。

研究顯示，CRT主要以三種機制暴露在口腔腫瘤細胞的表面：（1）ERS。CRT暴露于細胞主要依賴于PERK介導的真核細胞起始因子2α（eukaryotic initiation factor 2α， eIF2α）磷酸化反應。ICD誘導劑的處理能激發(fā)PERK/eIF2α及其下游的信號通路，區(qū)別在于半胱氨酸天冬氨酸蛋白8（cysteinyl aspartate specific proteinase 8， caspase8）或 UPR 的ATF4感受器。在長期ERS下，eIF2α持續(xù)活化和ATH4的表達增加，導致CHOP通過各種信號途徑誘導細胞凋亡。綜上， CRT可通過一定途徑在細胞膜上或胞膜外暴露，其包括PERK/eIF2α/caspase8通路、PERK/eIF2α/ATF4通路及其下游CHOP/caspase3通路；（2）線粒體介導細胞凋亡。在ERS持續(xù)作用下，caspase級聯(lián)激活（如caspase8），口腔腫瘤細胞發(fā)生凋亡緊密聯(lián)系著BAP31和Bcl-2家族蛋白（Bax和Bak），隨蛋白的上調或下調而發(fā)生相應改變［29］；（3）ER-高爾基體囊泡轉運。CRT 可與囊泡或質膜相關蛋白（VAMP1、SNAP23等）緊密結合，以囊泡形式［30］從ER轉運到高爾基體，再轉運到細胞膜上（圖 2）。

圖2 口腔腫瘤ICD時CRT暴露到細胞表面的機制Figure 2.Mechanisms of CRT Exposure to the Cell Surface during ICD in Oral Tumors

1.3 HSP家族轉位

HSPs是一組特異性蛋白家族，根據分子量遞增 可 分 為 sHSP（small HSP，分 子 量 12～43 kDa）、HSP60、HSP70、HSP90、HSP110 等亞類成員。HSPs主要保護口腔腫瘤細胞免受環(huán)境應激損傷，也可通過促進血管生成［31］和抑制細胞凋亡介導ICD，但其釋放相當被動，且在不同腫瘤中的具體機制尚未完全明確［32］。有文獻認為，HSPs發(fā)揮免疫作用可能與T細胞輔助因子Th1增加有關，HSP70在Th1比例大時發(fā)揮更強的腫瘤免疫效應［33-34］。HSPs可使受損蛋白恢復正常，抵御危害并保護細胞存活和適應外界環(huán)境變化［35］；另外，HSPs與胞質內特異性腫瘤抗原肽結合和/或胞膜上MHCⅠ分子收到HSPs信號形成活化的腫瘤抗原復合物，激活CTL，發(fā)揮抑制口腔腫瘤作用。在ERS下，HSP70/90可以通過Fas/caspase8通路參與抗口腔腫瘤細胞凋亡過程，當壓力持續(xù)刺激，HSP70/90又可以介導Bcl-2蛋白家族的促凋亡信號作用［36］。

1.4 IFNⅠ分泌

IFNⅠ是一種低分子蛋白質或糖蛋白，具有免疫調節(jié)、抗病毒復制及抗細胞增殖等功能。IFNⅠ 可在應對各種刺激產生的自身免疫性疾病中傳導增強，也可能潛在靶向相關 STING信號通路。在口腔腫瘤細胞ICD時，IFNⅠ分泌可激活DCs上的TLR3信號通路，與IFNⅠ自分泌IFNα或旁分泌IFNβ受體相配合，協(xié)同增強抗腫瘤免疫力［37-38］。

1.5 HMGB1釋放

HMGB1蛋白是HGB含量最多的亞類，可在口腔腫瘤ICD時主動釋放或被動呈遞到細胞外，促使未成熟 DCs成熟，增加 CD40、CD80、MHC Ⅱ等細胞的表達。研究顯示，在ICD中晚期釋放的HMGB1可與多種信號體配合作用，如與糖基化終末產物受體（receptor for advanced glycation end products，RAGE）結合［39］。HMGB1參與口腔腫瘤ICD的途徑可通過JNK/P38/MAPK通路或介導非典型核因子B（noncanonical nuclear factor κB，NF-κB）信號，促進口腔腫瘤細胞浸潤和轉移或血管生成、細胞炎性反應［40］。同時，HMGB1可在胞膜上和細胞外作用DCs表面受體TLR4和TLR2，抑制口腔腫瘤細胞生長［41］（圖3）。

圖3 口腔腫瘤ICD時HMGB1釋放的機制Figure 3.Mechanisms of HMGB1 Release during ICD in Oral Tumors

1.6 ATP釋放

ICD過程發(fā)展到晚期可促進由危險信號驅動的胞外 ATP（extracellular adenosine triphosphate，eATP）的運輸。在eATP參與口腔腫瘤ICD的過程中，eATP與其關鍵性感受器DCs表面的受體P2X7（離子型）或P2Y2（代謝型）相互結合，觸發(fā)免疫原性信號，分泌炎癥介導因子IL-6、IL-1β、IL-12，導致ATP不能發(fā)送“find me”信號，阻斷ICD介導吞噬細胞的招募和聚集，進而抑制腫瘤細胞自噬力及增強免疫功能［42］。eATP 是成熟 DCs激活 CD4+、CD8+T 細胞和NK細胞所必需的［43］，若eATP在細胞外被CD39和CD73水解為腺苷，腺苷的水平增加會抑制T細胞和NK細胞極化過程，從而促進口腔腫瘤細胞的發(fā)展與轉移（圖4），因此，抗口腔惡性癌癥的免疫治療誘導腫瘤發(fā)生ICD有eATP釋放的參與［44］。當化療藥物或光動力療法作用口腔腫瘤細胞時，細胞發(fā)生自噬早期釋放ATP，或通過PERK調節(jié)分泌ATP和依賴PI3K激酶晚期釋放eATP［45］。作為DAMPs之一，ATP釋放可在ICD過程早期發(fā)生［46］，值得注意的是，eATP可在ICD晚期甚至全程到胞外發(fā)揮作用［47］。ATP何時釋放存在爭議，ATP釋放機制可能因化療誘導ICD的過程而變得不同，需要進一步的實驗去論證。

圖4 口腔腫瘤ICD時eATP釋放的機制Figure 4.Mechanisms of eATP Release during ICD in Oral Tumors

1.7 膜聯(lián)蛋白 1（annexin1，ANXA1）釋放

ANXA1是膜結合蛋白超家族的一員，具有多基因、Ca2+調節(jié)和磷脂依賴等特性，研究表明，ANXA1的調控解除與腫瘤的發(fā)生、侵襲、轉移和耐藥性有關，或可作為特定癌癥的腫瘤抑制因子生物標志物［48］。Lin等［49］早先發(fā)現有ANXA1核染色的OSCC患者的總生存期明顯縮短，用肝細胞生長因子處理的口腔癌SAS細胞可以誘導ANXA1從細胞質向細胞核轉位。近來研究發(fā)現，ANXA1在體外抑制OSCC細胞的增殖和侵襲，轉化生長因子β1/表皮生長因子誘導的上皮-間質轉化在OSCC細胞中被ANXA1逆轉，說明ANXA1可作為OSCC細胞的潛在腫瘤抑制基因［50-51］。

2 口腔腫瘤治療中ICD誘導劑的應用

用于治療口腔腫瘤的I型誘導劑，如蒽環(huán)類、抗生素類、鉑類藥物和紫杉醇等化療藥物，可通過抑制DNA修復和復制、阻礙胞質或跨膜相關蛋白生成等機制特異性誘導CRT暴露以及ATP、HMGB1、HSPs等釋放［52-53］。蒽環(huán)類化療藥物在急性髓性白血病、心血管疾病臨床治療中廣泛應用，但在頭頸部和口腔頜面癌癥鮮有研究［54-55］，這說明抗口腔腫瘤免疫治療有望取得進一步發(fā)展。近年來，抗生素類化療藥物平陽霉素（pingyangmycin，PYM）處理后的舌鱗癌CAL27細胞發(fā)生了CRT由胞內至胞膜上暴露，且HMGB1分泌量增加，證明PYM可以誘導口腔鱗癌 ICD 發(fā)生［56］；Park等［57］研究采用基于鉑的化療藥物奧沙利鉑（oxaliplatin，OXA）和順鉑（cisplatin，DDP）聯(lián)合處理人頭頸部鱗狀細胞癌（head and neck squamous cell carcinoma，HNSCC）細胞，證明OXA和DDP聯(lián)合可增加HNSCC細胞ICD過程中CRT、HSP70和HMGB1的釋放來抑制細胞生長；化療藥物可抑制生長周期，以此促進腫瘤細胞凋亡，Nakakaji等［58］通過共價聯(lián)合一種磁化的紫杉醇（paclitaxel，PTX）偶聯(lián)物處理口腔癌細胞，發(fā)現其可誘導細胞周期G2/M阻滯和細胞凋亡，但其在誘導腫瘤細胞發(fā)生ICD的領域尚未明確指出，有待深入研究。

用于誘導口腔腫瘤細胞凋亡的Ⅱ型誘導劑主要有PDT、OVs等。PDT使用光敏劑靶向作用增生活躍的腫瘤部位，在給予特定波長的光照后，細胞內的藥劑會產生破壞性較強的ROS，導致腫瘤細胞死亡。Nasrin等［59］采用葉酸和姜黃素設計PDT光敏劑組合來產生雙光子NIR，發(fā)現該光敏劑組合可觸發(fā)ROS，增強口腔癌細胞凋亡OVs可直接針對腫瘤細胞并致其溶解凋亡，并具有靶向性、免疫調節(jié)性和修飾腫瘤微環(huán)境的能力。Saravanan等［60］研究溶瘤HSV-1病毒通過細胞融合或內吞作用進入OSCC細胞核中復制，引發(fā)程序性細胞死亡、細胞壞死、自噬細胞死亡與的相互作用。然而，能否準確將OVs靶向注入到口腔腫瘤細胞仍是一個待解決的問題，需要進一步研究其抗腫瘤免疫應答的應用。

3 總結與展望

在口腔腫瘤臨床治療與ICD機制中，ICD誘導劑作用于口腔腫瘤細胞使細胞表面高表達CRT、ATP、HSPs、HMGB1、IFNⅠ等引起機體免疫反應的抗原分子，提高DCs識別腫瘤細胞的能力，激活DCs對腫瘤的攻擊，促使炎性因子釋放，從而達到更理想的抗腫瘤免疫療效。ERS和UPR已成為各種人類惡性腫瘤的重要靶點，可由此發(fā)展免疫靶向藥物介導口腔腫瘤發(fā)生ICD ，增加ER靶向遞藥的研究。

各種類型的ICD誘導劑揭示了藥物、化療、高溫以及溶病毒等手段誘導口腔腫瘤ICD的DAMPs上調和實現體內抗種腫瘤免疫反應的能力。Wang等［61］研究表明溴結構域蛋白BRD4抑制劑JQ1通過誘導ICD發(fā)生在舌鱗狀細胞癌中表現出治療潛力，表明從ICD角度研究口腔腫瘤患者的免疫治療作用在國內逐漸受重視。目前有望利用免疫原性治療方式與當前和新型免疫治療方案的組合，開發(fā)出高效的治療體系，增強腫瘤治療效果，改善現有臨床口腔腫瘤治療策略。然而，口腔腫瘤細胞ICD的相關分子機制中的確切通路還有待進一步探索，相關藥物的應用還需要更多長期的前瞻性研究和隨機對照研究來進一步驗證。

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