高純度泰萬(wàn)菌素制備工藝研究

王祎萌，李芳，王文亮，張曉強(qiáng)

(寧夏泰益欣生物科技股份有限公司，寧夏 銀川 750001)

0 引言

泰萬(wàn)菌素屬于大環(huán)內(nèi)酯類抗生素中的一種，在當(dāng)前世界醫(yī)藥行業(yè)內(nèi)，已被認(rèn)定為預(yù)防、治療由支原體引起的畜禽類疾病的最新藥品，并在行業(yè)內(nèi)廣泛應(yīng)用[1-2]。泰萬(wàn)菌素作為一種新型的大環(huán)內(nèi)酯類抗生素，攻克了其他同類藥物的缺點(diǎn)，具有效率高、毒性低、殘留少、同類間無(wú)交叉耐藥性的優(yōu)點(diǎn)。泰萬(wàn)菌素的抗菌能力，是泰樂(lè)菌素的5～10 倍，是替米考星的2～5 倍。主鏈能有效改變細(xì)胞的pH 值，抑制PRRS病毒的繁殖，可用于防治畜禽支原體病(豬哮喘、雞慢性呼吸道疾病)、豬藍(lán)耳病、傳染性胸膜肺炎和鏈球菌病。

泰萬(wàn)菌素全稱為乙酰異戊基泰樂(lè)菌素，主要由耐熱鏈霉菌在合適的發(fā)酵條件下產(chǎn)生。耐熱鏈霉菌含有酰化基因acyA 和acyB，分別負(fù)責(zé)乙酰化和異戊基酰化[3]。在作用機(jī)制方面，泰萬(wàn)菌素與其他大環(huán)內(nèi)酯類抗生素基本相同，能與敏感細(xì)菌的核糖體50s 亞基結(jié)合，從而抑制肽鏈的合成和延伸，通過(guò)切斷轉(zhuǎn)肽酶化和mRNA 置換影響細(xì)菌蛋白質(zhì)的合成。泰萬(wàn)菌素對(duì)諸多革蘭氏陽(yáng)性菌具備抗菌活性，如：棒狀桿菌、氣球菌、彎曲桿菌、腸球菌、鏈球菌、葡萄球菌、微球菌、芽孢桿菌、節(jié)桿菌等。同時(shí)，對(duì)支原體也有一定的抗菌活性，濃度高時(shí)效果會(huì)更顯著，但對(duì)較多的革蘭氏陰性菌沒(méi)有作用。泰萬(wàn)菌素和3-AT 以兩種不同的靶點(diǎn)攻擊支原體和細(xì)菌，它們的協(xié)同作用使抗菌和抗支原體活性得到提升，使得藥物在體內(nèi)的作用時(shí)間得到有效延長(zhǎng)。病原微生物有個(gè)缺陷，即其難以同時(shí)在兩個(gè)不同的地方發(fā)生突變且產(chǎn)生耐藥性。泰萬(wàn)菌素發(fā)酵合成的發(fā)酵液經(jīng)酸溶堿沉后獲得泰萬(wàn)菌素成品，但隨著科技的發(fā)展和醫(yī)藥行業(yè)的進(jìn)步，對(duì)各類抗生素的純度等質(zhì)量的要求具有明顯提升，因此本文主要以泰萬(wàn)菌素成品為原料，通過(guò)硅膠柱層析法純化，調(diào)配控制洗脫液、洗脫液配比、洗脫液使用量及洗脫速率等實(shí)驗(yàn)條件，制備高純度泰萬(wàn)菌素，其結(jié)構(gòu)如圖1 所示。

圖1 泰萬(wàn)菌素結(jié)構(gòu)式

1 材料與方法

1.1 試劑

乙酸乙酯、石油醚、氯仿、正丁醇等試劑均為試劑級(jí)，采購(gòu)于天津市大茂化學(xué)試劑有限公司；硅膠為工業(yè)級(jí)，采購(gòu)于天津市承大化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器

本實(shí)驗(yàn)主要儀器為層析柱、電子天平、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀、循環(huán)水真空泵、高效液相色譜儀等，各儀器詳情如表1 所示。

表1 本實(shí)驗(yàn)儀器詳情表

2 材料與方法

2.1 材料

泰萬(wàn)菌素成品來(lái)源于寧夏泰益欣生物科技股份有限公司。

2.2 方法

2.2.1 制備方法

用電子天平稱取60 g 泰萬(wàn)菌素成品于2 L 玻璃燒杯中，加入適量乙酸乙酯溶解，再向2 L 燒杯中繼續(xù)加入80 g 硅膠攪拌，充分混勻、蒸干后上樣(干法上樣)。上樣時(shí)，先用300 g 硅膠填充層析柱，將蒸干后的樣品填充于硅膠上方，以石油醚對(duì)裝填后的硅膠層析柱進(jìn)行潤(rùn)洗。完成潤(rùn)洗后加入洗脫液沖洗，收集的洗脫液經(jīng)濃縮蒸干后檢測(cè)組分。

2.2.2 檢測(cè)方法

采用HPLC 進(jìn)行檢測(cè)，流動(dòng)相為乙腈(0.15 mol/L)、醋酸銨溶液、醋酸比例為45∶45∶10；柱子型號(hào)為C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流速為1.0 mL/min，柱溫為30 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)為280 nm；進(jìn)樣量為10 μL。

制備檢測(cè)樣品: 精密稱量50 mg 高純度泰萬(wàn)菌素成品于100 mL 容量瓶中，加入流動(dòng)相溶解并定容，充分搖勻后，經(jīng)0.45 μm 濾頭過(guò)濾待用。

3 結(jié)果與分析

3.1 不同洗脫液對(duì)泰萬(wàn)菌素A 組分的影響

在柱層析洗脫過(guò)程中，不同洗脫液對(duì)不同組分的溶解度不同，選用不同洗脫液對(duì)洗脫的效果至關(guān)重要。因此，本實(shí)驗(yàn)選用了石油醚、氯仿和正丁醇三種有機(jī)溶劑分別與乙酸乙酯進(jìn)行一定比例混合組成洗脫液，收集洗脫液，進(jìn)行液相檢測(cè)，考察洗脫液種類對(duì)泰萬(wàn)菌素A 組分含量的影響。具體結(jié)果如表2 所示。

表2 不同洗脫液對(duì)泰萬(wàn)菌素A 組分含量的影響

由表2 可知，三種洗脫液中，洗脫液為乙酸乙酯和石油醚時(shí)，其A 組分的含量為86.14%，明顯高于乙酸乙酯：氯仿和乙酸乙酯：正丁醇，分別高出4.40%和6.87%。因此，確定洗脫液為乙酸乙酯和石油醚。

3.2 不同洗脫液配比對(duì)泰萬(wàn)菌素A 組分的影響

柱層析填充料對(duì)樣品中的不同組分的吸收能力存在差異，洗脫液的不同配比對(duì)各組分的洗脫效果不同，本研究共設(shè)置1∶1、1∶2、2∶1、1∶3、3∶1、2∶3 和3∶2 等7 中洗脫液配制比例進(jìn)行驗(yàn)證洗脫液對(duì)泰萬(wàn)菌素A 組分含量的影響。具體結(jié)果如表3 所示。

表3 不同洗脫液配比對(duì)泰萬(wàn)菌素A 組分含量的影響

根據(jù)表3，觀察1、2、4 組實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，隨著洗脫液中石油醚含量的增加，A 組分含量呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，說(shuō)明洗脫液中石油醚含量越低，A 組分的含量越高，洗脫的效果越好；觀察1、3、5 組實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，隨著洗脫液中乙酸乙酯含量的增加，A 組分含量呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，說(shuō)明乙酸乙酯的含量過(guò)多或過(guò)少都會(huì)降低A 組分的含量，所以洗脫液中乙酸乙酯的含量應(yīng)該適中。對(duì)比3、7 兩組實(shí)驗(yàn)結(jié)果，乙酸乙酯和石油醚的配比為2∶1 時(shí)，A 組分含量最高，為90.77%。因此，確定乙酸乙酯和石油醚的配比為2∶1。

3.3 不同洗脫液體積對(duì)泰萬(wàn)菌素A 組分的影響

洗脫液的體積對(duì)洗脫結(jié)果具有直接影響，洗脫液用量過(guò)少，可能會(huì)導(dǎo)致洗脫不徹底，有效組分無(wú)法完全收集，造成A 組分含量較低。洗脫液用量過(guò)多，必然會(huì)造成有機(jī)溶劑的浪費(fèi)，有機(jī)溶劑的揮發(fā)及回收過(guò)程中都會(huì)有溶劑的損失，造成成本的增加。本研究設(shè)置層析柱體積的1.0 倍、1.5 倍、2.0 倍、2.5 倍、3.0 倍、3.5 倍、4.0 倍、4.5 倍 和5.0 倍 等9 種 洗 脫液的體積進(jìn)行驗(yàn)證。具體結(jié)果如表所4 所示。

由表4 可知，隨著洗脫液體積的增大，A 組分含量不斷上升，從4 倍柱體積洗脫開始，A 組分含量上升幅度明顯減小，趨于平緩；4.5 和5.0 倍柱體積洗脫時(shí)，A 組分含量?jī)H高出4 倍柱體積的0.05% 和0.09%，說(shuō)明繼續(xù)增加洗脫液體積，意義不大，同時(shí)也可以節(jié)約經(jīng)濟(jì)成本和避免試劑的浪費(fèi)。因此，以4 倍柱體積的洗脫液為最佳洗脫液用量繼續(xù)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

表4 不同洗脫液體積對(duì)泰萬(wàn)菌素A 組分含量的影響

3.4 不同洗脫速率對(duì)泰萬(wàn)菌素A 組分的影響

硅膠柱用洗脫液沖洗過(guò)程中，通過(guò)控制洗脫速率可以有效的提升泰萬(wàn)菌素A 組分的含量，本實(shí)驗(yàn)將洗脫速率分別控制在10 mL/min、20 mL/min、30 mL/min、40 mL/min、50 mL/min、60 mL/min，考察對(duì)泰萬(wàn)菌素A 組分含量的影響。具體結(jié)果如表5 所示。

表5 不同洗脫速率對(duì)泰萬(wàn)菌素A 組分含量的影響

由表5 可知，隨著洗脫速率的增加，A 組分含量逐漸降低，說(shuō)明洗脫速率越小，洗脫時(shí)間越長(zhǎng)，A 組分含量越高，洗脫效果越好，但隨著時(shí)間的增加，泰萬(wàn)菌素有效成分會(huì)降解，并且實(shí)際生產(chǎn)應(yīng)用中，洗脫速率不宜過(guò)慢。在洗脫速率為40 mL/min 時(shí)，A 組分含量為95.65%，洗脫速率適中，A 組分含量較優(yōu)，因此，確定洗脫速率為40 mL/min。

3.5 平行試驗(yàn)

通過(guò)單因素試驗(yàn)，獲得最優(yōu)參數(shù)，組合為最優(yōu)的泰萬(wàn)菌素柱層析洗脫條件，具體參數(shù)如下：洗脫液為乙酸乙酯和石油醚，洗脫液的最佳配比為2∶1；洗脫液體積為4 倍柱體積；洗脫速率為40 mL/min。進(jìn)行3 組平行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證穩(wěn)定性，結(jié)果如表6 所示。

表6 平行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證數(shù)據(jù)

由表6 可知，三組實(shí)驗(yàn)所得泰萬(wàn)菌素A 組分平均含量為95.51%。

4 結(jié)論

本研究通過(guò)對(duì)泰萬(wàn)菌素純化過(guò)程中的洗脫液、洗脫液配比、洗脫液體積和洗脫流速等相關(guān)參數(shù)條件進(jìn)行優(yōu)化，并通過(guò)穩(wěn)定性重復(fù)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證此工藝的穩(wěn)定性、可靠性。結(jié)果顯示洗脫液為：乙酸乙酯和石油醚，洗脫液的最佳配比為2∶1；洗脫液體積為4 倍柱體積；洗脫速率為40 mL/min，A 組分含量可達(dá)95.51%。