‘海大2號’菠蘿蜜莖尖組培褐變過程中酚類物質(zhì)及相關酶活性的影響

丁燕　郭佳慧　范紫云　向星星　干雨露　閔天雨　楊廷　豐鋒　葉春海

關鍵詞：菠蘿蜜；組織培養(yǎng)；褐化；抗褐化劑

中圖分類號：S667.8 文獻標識碼：A

菠蘿蜜（Artocarpus heterophyllus Lam.），屬于桑科木菠蘿屬的熱帶果樹，常綠喬木，是一種集食用、藥用、木本糧食于一身的多用途經(jīng)濟樹種[1]，因果實甜美而受到歡迎，市場前景廣闊。大量研究表明，菠蘿蜜的葉、莖、種子和果肉具有較高的藥用、食用價值[2]。

目前，菠蘿蜜的繁殖方式主要有實生繁殖、嫁接繁殖和組織培養(yǎng)[3]。由于實生繁殖后代易發(fā)生性狀分離而難以保存木本優(yōu)良性狀等問題，導致果實品味和品質(zhì)發(fā)生較大改變[4]。目前生產(chǎn)上主要采取嫁接繁殖的方法，此方法可以保存母本優(yōu)良性狀。但因菠蘿蜜存在流膠較多的特性，嫁接時創(chuàng)面極易被膠污染，成活率受到嚴重影響[5]。

組織培養(yǎng)可加快植物的繁殖速度，在短期內(nèi)獲得大量遺傳性一致的種苗，并使其保持母本優(yōu)良的性狀，更有利于新品種的選育[10]，目前在香蕉、桉樹、蝴蝶蘭等植物上得到廣泛應用。前人曾利用菠蘿蜜嫩莖等外植體通過組織培養(yǎng)獲得試管苗[7-9]。但利用成年菠蘿蜜樹莖尖來進行繁殖尚無報道。1960年，MOREL[10]就利用大花穗蘭的莖尖成功誘導分化出植株。利用此技術于‘海大2 號組培快繁中發(fā)現(xiàn)，菠蘿蜜組織培養(yǎng)過程中褐化嚴重，導致其難以建立無性繁殖體系，產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)難以實現(xiàn)。

周亞輝等[11]研究認為，組培褐化機制可分為酶促褐變和非酶促褐變2 種，菠蘿蜜外植體的褐變主要是酶促褐變，在氧化酶催化下酚類物質(zhì)形成褐色的醌類及其聚合物稱為酶促褐變。牛佳佳等[12]研究認為，醌類化合物的產(chǎn)生會使得外植體的傷口處變深褐色，這些褐色物質(zhì)產(chǎn)生后會慢慢滲透到培養(yǎng)基中，來達到抑制其他酶活性產(chǎn)生這一目的，植株在吸收營養(yǎng)物質(zhì)時受到阻止，導致外植體褐變而死亡，植株的生長受到影響。

菠蘿蜜組織培養(yǎng)快繁全過程的理論和技術已基本成熟，然而在實際生產(chǎn)上卻難于重復和推廣[13]。為盡早實現(xiàn)菠蘿蜜的工廠化繁殖，為獲得大量優(yōu)質(zhì)苗木而奠定基礎，本研究以菠蘿蜜莖尖為材料，探究經(jīng)過不同低溫（4 ℃）處理后及不同濃度PVP 對外植體褐化的影響，并測定各處理下莖尖PPO 活性、酚類物質(zhì)含量，以此更深入地了解菠蘿蜜組織培養(yǎng)褐化的因素，探究褐化的機理。旨在促進菠蘿蜜組培快繁技術體系的建立，以期為構建菠蘿蜜種苗繁育技術體系及其產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)示范提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

本研究試驗材料‘海大2 號菠蘿蜜外植體來自廣東海洋大學后山園林基地，選取長勢強壯，無病蟲害的植株，在晴天早晨進行采摘。實驗培養(yǎng)基采用1/2 MS 培養(yǎng)基，NAA 0.1 mg/L，蔗糖30 g/L，瓊脂5.5～6.0 g/L，pH 5.8，培養(yǎng)溫度（24±1） ℃，光照強度2000 Lx，光照10 h/d。實驗中所用藥劑均來自麥克林公司及廣州試劑廠。

經(jīng)過表面滅菌處理后，將外植體依次接種至滅菌培養(yǎng)基中，每個處理接種30 瓶，每瓶接種1個頂芽，3 次重復。15 d 后統(tǒng)計菠蘿蜜外植體的污染率和褐化率。低溫（4 ℃）處理時間分別設定為12、24、48 h，15 d 后分別統(tǒng)計其褐化率及萌芽率，并測定其PPO 活性及酚類物質(zhì)含量[6， 14]。

外植體經(jīng)過12～24 h 的低溫處理后將接入不同濃度的PVP（聚乙烯吡咯烷酮）培養(yǎng)基中，15 d后分別統(tǒng)計其褐化率及萌芽率，并測定其PPO 活性及酚類物質(zhì)含量。

1.2 方法

外植體底部褐色色塊超過0.1～0.5 cm 均為褐化（圖1）。采用以下誘導評價公式計算萌芽率及褐化率。

萌芽率=誘導出腋芽的瓶數(shù)/同批次接種的外植體瓶數(shù)×100%

褐化率=褐化的外植體數(shù)/同批次接種的外植體瓶數(shù)×100%

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗數(shù)據(jù)采用Microsoft Excel 2007 軟件對重復樣的平均值與標準差進行計算，采用DPS 7.05軟件和Duncans 分析法對不同指標進行差異顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 不同低溫預處理時間對菠蘿蜜莖尖組培褐化的影響

如表1 所示，未進行低溫處理的外植體，褐化率高達58.89%，萌芽率為38.89%。隨著低溫處理時間的延長，其褐化率顯著降低。低溫處理12 h，外植體的褐化率為46.67%，與其他處理相比，差異顯著。低溫處理24 h，萌芽率最高，達到57.78%，與對照組相比，差異顯著。結果表明，采集后的菠蘿蜜外植體經(jīng)過一定的低溫預處理后，對其褐化率及萌芽率影響顯著（圖2）。

2.2 不同PVP濃度對菠蘿蜜莖尖組培褐化的影響

如表2 所示，PVP 的添加對菠蘿蜜外植體褐化及萌芽率的影響顯著。PVP 濃度為2.0 g/L 時，褐化率最低，萌芽率最高，分別為15.56%和66.67%，與對照組相比，褐化率降低了41.11%，萌芽率升高了30.00%，差異顯著。結果表明，PVP對菠蘿蜜外植體的褐化能夠起到抑制作用，且在濃度為2.0 g/L 時，效果最佳。具體生長情況見圖3，驗證效果見圖4。

2.3 不同低溫預處理時間對‘海大2 號菠蘿蜜莖尖PPO 活性、總酚及總黃酮含量的影響

2.3.1 PPO 活性 如圖5A 所示，‘海大2 號菠蘿蜜莖尖在經(jīng)過低溫處理后，體內(nèi)PPO 的活性并未出現(xiàn)下降的趨勢，各處理組均高于對照，且隨著低溫處理時間的延長，體內(nèi)PPO 活性隨之增加，在低溫處理48 h 時，PPO 活性達到最高值，為229.07 U/（gmin），且各處理與對照組相比，差異顯著。

2.3.2 總酚含量 如圖5B 所示，‘海大2 號菠蘿蜜莖尖在經(jīng)過低溫處理后，與對照組相比，呈現(xiàn)先降低后升高的趨勢。低溫處理12 h 和24 h，其體內(nèi)的總酚含量與對照組相比有下降的趨勢，且在低溫處理12 h 時達到最低值，為35.47 mg/g，與對照組相比下降了13.56%。在低溫處理48 h后，莖尖的總酚含量高于對照組。

2.3.3 總黃酮含量 如圖5C 所示，菠蘿蜜莖尖在經(jīng)過低溫處理后，外植體體內(nèi)黃酮的含量均呈現(xiàn)不同程度的降低，與對照組相比差異顯著。在低溫處理24 h 后，菠蘿蜜外植體體內(nèi)的總黃酮含量最低，為40.04 mg/g，與對照組相比下降37.25 mg/g。低溫處理12 h 和48 h 后，外植體總黃酮含量與對照組相比分別降低21.62%和8.72%。

2.4 不同PVP 濃度對‘海大2 號菠蘿蜜莖尖PPO 活性、總酚及總黃酮含量的影響

2.4.1 PPO 活性 如圖6A 所示，培養(yǎng)基中添加PVP 后，菠蘿蜜外植體內(nèi)PPO 活性與對照組相比，差異顯著，當添加濃度為2.0 g/L 時，PPO 活性最低，為82.67 U/（gmin），與對照組相比降低了318.66 U/（gmin）。其他處理組與對照組相比，PPO活性均有不同程度的降低，且與對照組相比分別降低了185.06、70.66 U/（gmin）。

2.4.2 總酚含量 如圖6B 所示，當添加濃度為1.0 g/L 時，總酚含量與對照組相比無明顯差異。添加的PVP 濃度為2.0 g/L 時，菠蘿蜜莖尖總酚含量最低，為28.46 mg/g，與對照組相比降低了25.90 mg/g，差異顯著。添加的PVP 濃度為3.0 g/L時，與對照組相比總酚含量下降了11.79 mg/g。

2.4.3 總黃酮含量 如圖6C 所示，PVP 添加后，外植體的總黃酮含量顯著降低。PVP 濃度為1.0 g/L時，外植體的總黃酮含量與對照組相比降低了19.21 mg/g。PVP 濃度為2.0 g/L 時，菠蘿蜜外植體總黃酮含量達到最低值，為17.21 mg/g。PVP 濃度為3.0 g/L 時，外植體的總黃酮含量與對照組相比降低了33.06 mg/g。各處理組與對照組相比，差異顯著。

3 討論與結論

3.1 討論

菠蘿蜜莖尖組織培養(yǎng)中，經(jīng)過低溫處理后能夠有效地降低褐化。前人研究發(fā)現(xiàn)，外植體在高溫培養(yǎng)下，褐變加劇，而降低培養(yǎng)溫度后發(fā)現(xiàn)，褐化得到明顯的改善，這與本試驗研究結果一致[15-16]。喻娜[17]研究認為，低溫組培下的外植體有利于降低褐化，劉蘭英[15]在核桃組織培養(yǎng)過程中發(fā)現(xiàn)，低溫下進行組織培養(yǎng)可降低褐化，羅麗華[16]在板栗愈傷組織培養(yǎng)中研究發(fā)現(xiàn)，低溫處理可減輕外植體褐化的現(xiàn)象。在本研究中，菠蘿蜜外植體進行一定時間的低溫預處理后，與對照組相比，外植體體內(nèi)的總酚及總黃酮含量顯著降低，試驗結果與前人研究結果一致，即適當?shù)牡蜏靥幚碛欣谕庵搀w褐化率的降低。

PVP 添加后，發(fā)現(xiàn)不同濃度的PVP 均能降低外植體的褐化，這與劉英[18]研究結果一致。目前普遍認為，外植體的褐化與多酚氧化酶（PPO）對酚的作用有關，乜蘭春等[19]研究認為PPO 是酚類催化反應的關鍵酶，因為酚會氧化形成醌[20]，醌會導致外植體的褐化，目前很多學者認為這是導致褐化的主要原因，但不是唯一的原因，眾多學者一直就這方面進行研究與探討，但目前還未得到一致結論。酚酸、類黃酮和單寧是酚類物質(zhì)結構的三大類化合物，這三大類化合物在褐變過程中充當著重要的角色[21]。印芳[22]研究認為，蝴蝶蘭的褐化與酚酸類物質(zhì)有關，劉紅[23]研究結果表明，各處理下的外植體總酚含量與褐化程度呈正相關，即褐化越重，總酚含量越高，本研究也得到了同樣結果。

前人研究表明，辣椒和葡萄的褐化可用硝酸銀緩解[24-25]，焦金鳳[26]認為，合適的抗褐化劑物質(zhì)有利于降低植物組織培養(yǎng)過程中出現(xiàn)的褐化問題，植物組培養(yǎng)中常用的抗褐化劑根據(jù)其作用機理可分為兩大類型：（1）防止酚氧化的抗氧化劑，如，VC、Na₂S₂O₃、CA 等；（2）用來吸附醌類物質(zhì)的吸附劑，如AC、PVP 等。本研究結果表明，添加PVP 2.0 g/L 時用菠蘿蜜組織培養(yǎng)抗褐化的效果最好，這可能是因為同一種褐化劑的不同濃度起到的抗褐化效果不一樣[26]，張俊林等[27]在核桃組培中，JAIN 等[28]在歐洲李組織培養(yǎng)中研究發(fā)現(xiàn)，抑制植物組培褐化效果最好的抗褐化劑是PVP，本試驗在添加2.0 g/L PVP 時，對抑制菠蘿蜜莖尖褐化起到了較好的效果。張小紅等[29]在對核桃進行組織培養(yǎng)中發(fā)現(xiàn)，Na₂S₂O₃抑制植物組培褐化效果最好。劉霞等[30]研究發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)基中添加AC 對烏龍子根芽眼組織培養(yǎng)的效果最好，由此可見，不同植物的外植體、取材時間、部位等均會影響抗褐化劑的效果[26]。本研究結果表明，酚類物質(zhì)的含量與褐變程度呈正比，這與許傳俊等[31]在蝴蝶蘭的研究中、毛沛琪[6]在牡丹等的研究中結果一致。此外，前人研究表明，降低酚類物質(zhì)即可降低褐化[32-33]，本研究結果也反映出了這一現(xiàn)象。

3.2 結論

本研究以‘ 海大2 號菠蘿蜜莖尖為試驗材料，分析了低溫預處理后菠蘿蜜的莖尖及不同濃度PVP 對菠蘿蜜莖尖PPO 活性、總酚及總黃酮含量的影響，研究結果表明：在低溫處理12 h，菠蘿蜜外植體總酚含量最低，低溫處理24 h，外植體總黃酮含量最低。莖尖經(jīng)過12～24 h 低溫處理后再接入添加2.0 g/L PVP 的1/2 MS 培養(yǎng)基中，這一濃度下菠蘿蜜外植體的褐化率最低且萌芽率最高，且驗證結果表明，此方法有利于菠蘿蜜莖尖的增殖。

本試驗對菠蘿蜜外植體組培過程中褐化的抑制進行了研究，初步探索了菠蘿蜜外植體在組培過程中影響褐化的一些外部因素，且對部分影響較大的因素如總酚、總黃酮及多酚氧化酶進行了指標的測定，菠蘿蜜褐變的研究是一項長期而又艱巨的任務，菠蘿蜜組織培養(yǎng)技術還不夠成熟，其增殖及生根體系等有待進一步研究，希望今后可以進行深入的研究，加大對醌類物質(zhì)的鑒定分析。