雷帕霉素對脫氫表雄酮誘導PCOS大鼠卵巢組織的影響及作用機制探討

陳文莉?王慧玲?楊君

【摘要】目的 探討雷帕霉素對脫氫表雄酮（DHEA）誘導的多囊卵巢綜合征（PCOS）大鼠卵巢組織的影響及作用機制。方法 55只SD雌性大鼠適應性喂養1周后隨機分為空白組（13只）、對照組（13只）及PCOS組（29只），其中PCOS組大鼠皮下注射DHEA誘導建立PCOS大鼠模型，對照組大鼠給予皮下注射大豆油，空白組全程不做任何處理。造模成功后分為空白組、對照組（腹腔注射等體積生理鹽水），將PCOS大鼠分為模型對照組（腹腔注射等體積生理鹽水）、低劑量組（腹腔注射雷帕霉素1 mg/kg）及高劑量組（腹腔注射雷帕霉素10 mg/kg），每組各8只大鼠，共干預28 d，給藥結束后檢測各組大鼠血糖、性激素水平，并進行HE、Masson、免疫組織化學染色，檢測并比較組間mTOR、p-mTOR及p-P70S6蛋白表達，TUNEL法檢測卵巢組織凋亡情況。結果 PCOS大鼠動情周期出現紊亂，卵巢組織中卵泡呈現多囊樣變化，PCOS大鼠體重、卵巢質量、體積、相對質量、性激素水平、纖維化陽性范圍均高于對照組（P均< 0.05），而低劑量組和高劑量組大鼠的上述指標均低于模型對照組（P均< 0.05），且卵巢組織多囊樣變化明顯減輕。低劑量組與高劑量組的纖維化陽性范圍較空白組及對照組增加、高劑量組較模型對照組增加（P均< 0.05）。模型對照組大鼠卵巢中p-mTOR蛋白的光密度（OD）值高于其他4組（P均< 0.05）、卵巢中p-P70S6蛋白的OD值與對照組相近（P > 0.05），而高劑量組低于空白組、對照組及低劑量組（P均< 0.05）。卵巢組織TUNEL染色結果分析，模型對照組高于空白組、對照組和高劑量組（P均< 0.005），空白組低于低劑量組（P < 0.005）。結論 雷帕霉素使DHEA誘導的PCOS大鼠模型體重、卵巢質量減輕，卵巢體積減少，性激素水平降低，卵泡組織中多囊樣改變減輕及卵巢組織細胞凋亡減少，這可能與雷帕霉素抑制mTOR信號通路的異常激活有關；但其也可能導致PCOS大鼠卵巢間質纖維化增加，大鼠體重、卵巢質量與體積低于正常水平。

【關鍵詞】多囊卵巢綜合征；大鼠卵巢；脫氫表雄酮；雷帕霉素；絲氨酸/蘇氨酸激酶

The effect and mechanism of rapamycin on the ovarian tissue of rats with PCOS induced by dehydroepiandrosteroneChen Wenli△， Wang Huiling， Yang Jun. △Obstetrics and Gynecology， the First Affiliated Hospital of Xinxiang Medical College， Weihui 453100， China

Corresponding author，Yang Jun，E-mail： 13937335562@163.com

【Abstract】Objective To evaluate the effect and unravel the mechanism of rapamycin on the ovarian tissues in rat models with polycystic ovary syndrome （PCOS） induced by dehydroepiandrosterone （DHEA）. Methods After 1-week accustomed feeding， 55 rats were randomly divided into the blank （n=13）， control （n=13） and model groups （n=29）. PCOS rat models were established by subcutaneous injection of DHEA solution. In the control group， rats were subcutaneously injected with soybean oil， while those in the blank group were not treated throughout the whole experiment. After the model was successfully established， all rats were divided into the blank group， control group （intraperitoneal injection of an equivalent volume of normal saline）， the model group， low-dose group （intraperitoneal injection of 1 mg/kg rapamycin） and high-dose group （intraperitoneal injection of 10 mg/kg rapamycin） for 28 d，

8 rats in each group. Blood glucose and hormone levels were detected， and HE， Masson and immunohistochemical staining was performed after corresponding interventions. The changes of the expression levels of mTOR， p-mTOR and p-P70S6 were assessed among different groups. TUNEL assay was used to detect the apoptosis of ovarian tissues among different groups. Results PCOS rats showed irregular estrous cycle， and the follicles were manifested with polycystic changes. The body weight， ovarian weight， volume， relative weight， sex hormone levels and positive area of ovarian fibrosis of PCOS rats were all higher than those in the control group （all P < 0.05）， whereas these parameters in the low- and high-dose groups were lower than those in the model control group （all P < 0.05）， and the polycystic changes of ovarian tissues were significantly mitigated. The positive area of ovarian fibrosis in the low- and high-dose groups was increased than those in the blank and control groups （all P < 0.05）. The positive area of ovarian fibrosis in the high-dose group was increased than that in the control group （P < 0.05）. No significant difference was noted in the OD value of mTOR protein among five groups （all P > 0.05）. The OD value of mTOR protein in the model control group was higher compared with those in the remaining four groups （all P < 0.05）. The OD value of mp-P70S6 protein in the model control group was similar to that in the control group （P > 0.05）， whereas the OD value of mp-P70S6 protein in the high-dose group was lower compared with those in the blank， control and low-dose groups （all P < 0.05）. TUNEL staining revealed that the apoptosis rate of ovarian tissues in the model control group was higher than those in the blank， control and high-dose groups （all P < 0.005）， whereas the apoptosis rate in the blank group was lower than that in the low-dose group （P < 0.005）. Conclusions Rapamycin can reduce body weight， decrease ovarian mass and volume， lower hormone levels， mitigate polycystic changes in follicular tissues and alleviate apoptosis of ovarian tissues in DHEA-induced PCOS rat models， which may be related to the inhibition of abnormal activation of mTOR signaling pathway by rapamycin. However， rapamycin may aggravate ovarian interstitial fibrosis in PCOS rats. The body weight， ovarian mass and volume of PCOS rats are lower than the normal levels.

【Key words】PCOS； Ovary of rat； DHEA； Rapamycin； mTOR； Serine/threonine kinase

多囊卵巢綜合征（PCOS）是婦科最常見的生殖內分泌代謝性疾病之一，臨床表現各不相同，其主要特征為高雄激素血癥、肥胖、月經稀發、月經紊亂、不孕或彩色多普勒超聲（彩超）下呈多囊卵巢等［1］。PCOS可增加糖尿病、心血管疾病及子宮內膜癌等疾病的風險［2］。目前PCOS的病因及發病機制尚未闡明，近年有研究表明PCOS的發生可能與mTOR信號通路有關［3］。哺乳動物雷帕霉素靶標（mTOR）是一種絲氨酸/蘇氨酸激酶，參與控制不同的應激源、激素、營養物質和生長因子，并在細胞增殖、代謝、生長和分化過程中發揮重要作用。Roa等（2009年）研究表明，mTOR信號在控制雌性大鼠青春期開始、減少黃體生成素分泌和促性腺激素分泌等方面起著重要作用。近年來，有報道雷帕霉素可能通過抑制mTOR信號通路異常激活，抑制始基卵泡的激活，從而保護卵泡儲備功能［4］。但目前有關雷帕霉素對PCOS大鼠模型的影響鮮有報道，故本研究構建PCOS大鼠模型，并給予不同劑量雷帕霉素處理，探討雷帕霉素對PCOS大鼠模型卵巢組織的影響及作用機制。

材料與方法

一、實驗對象

清潔級SD雌性大鼠，6周齡，體重（180±10）g，購自山西醫科大學實驗動物中心。根據預實驗模型構建及實驗所需標本量的情況，確定樣本量為55。大鼠分籠飼養，自由飲水、自由進食，飼養溫度為20～24 ℃，飼養環境濕度為40%～60%，每日光照及黑暗時間各12 h。本研究經新鄉醫學院第一附屬醫院倫理委員會批準（批件號：2021009），并根據國家衛生研究院實驗動物使用指南進行相關操作。

二、試劑與儀器

脫氫表雄酮（DHEA）和雷帕霉素購自上海麥克林生化科技股份有限公司，醫用大豆油購自浙江田雨山藥用油有限公司，生理鹽水購自石家莊四藥有限公司，血糖儀購自三諾生物傳感股份有限公司，血清睪酮、雌二醇、孕激素ELISA試劑盒購自上海酶聯生物科技有限公司，革蘭染色試劑（快速法）購自珠海貝索生物技術有限公司，HE和Masson染色劑試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司，一抗mTOR抗體、二抗辣根過氧化物酶（HRP）標記的山羊抗兔購自武漢賽維爾生物科技有限公司，p-mTOR抗體購自英國Abcam公司，p-P70S6抗體購自美國Santa Cruz公司。

三、實驗方法

1.分組、構建PCOS大鼠模型及給藥

55只大鼠適應性喂養1周后稱重，采用隨機區組法分組，即首先將大鼠根據體重分為3個區間，然后每個區間隨機分為空白組（13只）、對照組（13只）及模型組（29只）。空白組不做處理，每天上午8∶00～10∶00對照組給予皮下注射0.2 mL大豆油溶劑，模型組同一時間予頸背部按60 mg/kg

的劑量皮下注射DHEA 0.2 mL，連續注射28 d，

構建PCOS大鼠模型［5］。造模期間每日取大鼠陰道分泌物進行陰道涂片，觀察大鼠動情周期的變化。造模結束后，分別從空白組、對照組及模型組中隨機抽取5只大鼠，測定體重，檢測血清性激素水平，并于麻醉下取雙側卵巢組織觀察卵巢形態的變化，評價造模效果。造模成功定義為體重增加，動情周期紊亂（大鼠動情周期4個階段未按照順序進行，或處于非動情期），血清睪酮水平升高，卵巢質量及體積增加，卵巢組織中幾乎無正常卵泡，并且卵泡呈現多囊樣改變。造模成功后將模型組剩余24只大鼠分為模型對照組、低劑量組、高劑量組各8只。低劑量組每日給予腹腔注射生理鹽水和雷帕霉素1 mg/kg，高劑量組每日給予腹腔注射生理鹽水和雷帕霉素10 mg/kg，模型對照組及對照組予腹腔注射等體積生理鹽水。

2. 觀察各組大鼠動情周期的變化

每日清晨取大鼠陰道分泌物涂抹于酒精擦拭的載玻片上，待自然風干后，進行快速革蘭染色，在顯微鏡下觀察陰道涂片的細胞類型：動情前期主要是白細胞為主，動情期主要是有核上皮細胞為主，動情后期主要是無核角化細胞為主，動情間期以上3種細胞均存在［6］。

3. 監測大鼠血糖及血清激素水平的變化

造模28 d后及給藥結束后，禁食水12 h后于大鼠尾靜脈取血后采用血糖儀檢測血糖，麻醉后開腹暴露腹主動脈，抽取2～4 mL動脈血，離心分離血清后分裝于EP管內-20℃冰箱保存備用。采用ELISA法按試劑盒說明書步驟測定血清孕激素、睪酮、雌二醇水平。

4. 監測大鼠體重及卵巢質量、體積及相對質量的變化

研究過程中每3 d清晨監測1次大鼠體重并記錄，根據數值變化繪制體重變化圖。研究結束時麻醉大鼠，腹主動脈取血后處死，摘取雙側卵巢，稱重，放置于冰面上測量卵巢的長度、寬度及厚度，計算卵巢體積（長度×寬度×厚度）及卵巢相對質量［質量（mg）/體積（mm3）］，置于4%甲醛中以備后續制作石蠟切片［7］。

5. HE染色法觀察卵巢形態學變化

卵巢組織經常規固定、脫水、浸蠟、包埋，制作石蠟標本，然后以4 μm厚度切片，脫蠟后進行HE染色，操作按照試劑說明書進行。

6. Masson染色法檢測卵巢組織纖維化情況

卵巢組織切片后脫蠟，根據試劑盒的操作流程依次進行染色，在光學顯微鏡下觀察各組卵巢組織纖維化的情況，采用Image J軟件對病理圖片進行分析及定量，計算纖維化陽性范圍（陽性面積/總面積×100%）。

7. 免疫組織化學染色法檢測卵巢組織中mTOR、p-mTOR及p-P70S6表達情況

卵巢組織切片后脫蠟，然后根據試劑盒說明書進行免疫組織化學（免疫組化）染色，并于光學顯微鏡下觀察各組染色的情況，采用Image J軟件對病理圖片進行分析并計算光密度（OD）值。

8. TUNEL法檢測卵巢組織中細胞凋亡情況

卵巢組織切片后脫蠟，根據試劑盒說明書進行抗體修復、破膜、復染等，于熒光顯微鏡下觀察各組大鼠卵巢組織中細胞凋亡情況，采用Image J軟件對病理圖片進行分析及定量。

四、統計學處理

采用GraphPad 8.0進行畫圖及統計學處理。其中符合正態分布的計量資料以? 表示，多組間比較采用方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗；不符合正態分布的計量資料以M（P25，P75）表示，多組間比較采用Kruskal-Wallis H檢驗，兩兩比較時調整α水平，即α′ = 0.05 / 10 = 0.005；大鼠體重采用重復測量數據方差分析。α = 0.05。

結果

一、大鼠動情周期的變化

空白組及對照組大鼠基本都存在正常動情周期，模型組及低劑量組大鼠動情周期紊亂，且大部分大鼠處于無動情期或動情周期紊亂，但小部分高劑量組大鼠恢復為正常動情周期。見圖1。

二、大鼠血糖和血清性激素水平的變化

造模28 d后，PCOS組、空白組和對照組大鼠的血糖、血清睪酮及雌二醇水平比較差異均有統計學意義（F值分別為12.200、8.404及24.650，P均< 0.05）。其中PCOS組大鼠的血糖、血清雌二醇及睪酮值均高于空白組及對照組（P均< 0.05）；空白組與對照組的上述指標間比較差異均無統計學意義（P均> 0.05）；3組血清孕激素水平比較差異無統計學意義（F = 3.690，P > 0.05）。見圖2A～D。

給藥28 d后，空白組、對照組、模型對照組、低劑量組及高劑量組大鼠的血糖、血清孕激素、睪酮及雌二醇水平比較差異均有統計學意義（F值分別為15.860、2.892、33.042及4940.000，P均<

0.001）。其中模型對照組大鼠的血糖、血清睪酮及雌二醇水平均高于其他各組（P均< 0.001）；其他4組中除低劑量組大鼠的血糖低于對照組（P < 0.05）外，血糖、血清睪酮及雌二醇水平組間比較差異均無統計學意義（P均> 0.05）；高劑量組血清孕激素水平低于空白組（P < 0.05），其他4組血清孕激素水平組間比較差異均無統計學意義（P均> 0.05）。見圖2E～H。

三、大鼠體重、卵巢質量、體積及相對質量的變化

1. 大鼠體重的變化

在重復測量方差分析中，大鼠體重與造模時間或給藥時間存在交互效應（F值分別為23.620、11.490，P均< 0.001），故組間比較采用t檢驗。隨著造模時間增加，空白組與對照組大鼠的體重相近（P > 0.05），從第13日起PCOS組大鼠的體重高于對照組（P均< 0.05）。造模成功后，給藥后第13日起低劑量組和高劑量組大鼠體重均比模型組減少（P均< 0.05），其中高劑量組從給藥第13日起體重減輕且在第16日體重低于低劑量組（P < 0.05）。見圖3。

2. 大鼠卵巢質量、體積及相對質量的變化

造模28 d后，PCOS組、空白組和對照組大鼠的卵巢質量、體積及相對質量比較差異均有統計學意義（F值分別為21.216、25.803及20.080，P均< 0.05）。其中PCOS組卵巢質量、體積及相對質量均比空白組及對照組增加（P均< 0.05）；空白組與對照組的上述指標組間比較差異均無統計學意義（P均> 0.05）。

給藥28 d后，空白組、對照組、模型對照組、低劑量組及高劑量組大鼠的卵巢質量、體積及相對質量比較差異均有統計學意義（F值分別為141.700、9.802、64.901，P均< 0.05）。其中模型對照組的卵巢質量、體積及相對質量均大于其他各組（P均< 0.05）；低劑量及高劑量組的卵巢質量及相對質量均低于空白組和對照組；空白組與對照組組間、低劑量組與高劑量組組間比較差異均無統計學意義（P均> 0.05）。造模后及給藥后大鼠卵巢質量、體積及相對質量比較和卵巢組織外觀見圖4。

四、大鼠卵巢組織的HE染色情況

空白組及對照組大鼠的卵巢組織形態完整、結構緊密，卵巢中各級卵泡及黃體均存在；而PCOS組及模型對照組的卵巢組織結構相對松散，偶見正常卵泡存在，卵泡多數呈囊性擴張，2組相比示PCOS大鼠模型在腹腔注射雷帕霉素過程中卵巢組織仍是多囊樣改變；低劑量組卵巢中卵泡仍呈囊性擴張，但部分擴張的卵泡體積稍縮小，卵巢皮質中可見少量原始卵泡；高劑量組卵巢可見呈囊性擴張的卵泡明顯減少，且卵泡皮質中可見原始卵泡存在。見圖5。

五、大鼠卵巢組織的Masson染色情況

各組大鼠卵巢Masson染色顯示，組織纖維化主要存在于卵泡膜、萎縮的黃體與組織間質內。空白組、對照組、模型對照組、低劑量組及高劑量組大鼠卵巢組織的纖維化陽性范圍組間比較差異有統計學意義（F = 9.338，P < 0.001），其中低劑量組與高劑量組的纖維化陽性范圍較空白組及對照組增加，高劑量組較模型對照組增加（P均< 0.05）。見圖6。

六、大鼠卵巢組織的免疫組化染色情況

免疫組化切片可見mTOR蛋白廣泛表達于卵巢組織各細胞中。各組大鼠卵巢組織的mTOR蛋白OD值比較差異無統計學意義（F = 0.232，P = 0.918）。p-mTOR蛋白主要表達于卵泡、萎縮的黃體與組織間質內。空白組、對照組、模型對照組、低劑量組及高劑量組大鼠卵巢組織的p-mTOR蛋白OD值比較差異有統計學意義（F = 4.991，P =

0.003），其中模型對照組高于其他4組（P均< 0.05）。5組大鼠卵巢組織的p-P70S6蛋白OD值組間比較差異也有統計學意義（F = 4.708，P = 0.004），其中高劑量組低于空白組、對照組及低劑量組（P均< 0.05）。見圖7。

七、大鼠卵巢組織的TUNEL檢測結果

5組大鼠卵巢組織的TUNEL檢測熒光強度組間比較差異有統計學意義（H = 57.351，P < 0.001），其中模型對照組高于空白組、對照組和高劑量組（P均< 0.005），空白組低于低劑量組（P <

0.005），高劑量組與空白組、對照組比較差異均無統計學意義（P均> 0.005）。見圖8。

討論

PCOS是育齡期女性的常見疾病，但其病因及發病機制仍不清楚［8］。有研究認為PCOS的發生可能與PCOS患者卵巢顆粒細胞不正常的細胞凋亡調控有關［9］。相關研究表明，mTOR信號通路的參與是PCOS的重要病理生理學基礎［10］。mTOR信號通路蛋白的過度表達可損害卵丘細胞的相互作用，導致胰島素抵抗，并直接影響卵泡的生長［11］。

本研究通過應用DHEA誘導大鼠體重、卵巢質量增加，卵巢體積增大，月經周期紊亂，血清睪酮水平升高，卵泡呈多囊樣改變，從而成功建立PCOS大鼠模型［12］。造模后PCOS組大鼠血糖、睪酮及雌二醇水平升高，體重、卵巢質量、體積及相對質量增加，且HE染色示卵巢組織均存在多囊樣改變，說明PCOS大鼠卵巢組織在短期內無法自行恢復排卵。本研究還顯示，PCOS大鼠卵巢組織mTOR的磷酸化增多及卵巢細胞凋亡增加， PCOS的發生、發展可能與mTOR通路異常激活導致卵巢組織細胞凋亡有關。高劑量組mTOR的磷酸化減少，下游蛋白P70S6的磷酸化水平下調及卵巢細胞凋亡接近正常，其多囊樣卵泡明顯縮小，出現少數始基卵泡相結合，提示高劑量雷帕霉素通過抑制mTOR信號通路的異常激活，可能緩解PCOS大鼠卵巢組織中的多囊樣改變。這一結論也與近年來相關研究一致［4， 13］。但有研究表明，雷帕霉素可能阻礙卵泡發育，進一步加劇DHEA誘導的PCOS小鼠生殖失衡［14］。而且動物的種屬不同、雷帕霉素劑量不同以及給予雷帕霉素時期不同，雷帕霉素對卵巢的作用可能有所不同，對PCOS患者卵巢的作用可能也不同，故雷帕霉素對PCOS的影響仍然需要進一步研究。本研究Masson染色中，雷帕霉素可能加重PCOS大鼠卵巢組織的纖維化，其對后續卵泡的發育、排卵、受孕及后代發病情況仍需要進一步研究。

綜上所述，雷帕霉素可以抑制mTOR信號通路的異常激活，緩解PCOS大鼠卵巢多囊樣改變，但雷帕霉素加重卵巢組織纖維化，且大鼠體重、卵巢質量與體積低于正常水平，可能對PCOS大鼠后續卵泡發育及排卵產生不良影響，故應用雷帕霉素治療PCOS，需綜合考慮其利弊，且應結合目前臨床常用藥物對PCOS的療效及不良反應綜合判斷。

參 考 文 獻

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（收稿日期：2022-03-01）

（本文編輯：林燕薇）