加味丹參飲預防心肌缺血再灌注損傷作用機制的網絡藥理學分析與實驗驗證研究

胡旭東 彭木子 陳銘 廖菁 陳聰

〔摘要〕 目的 基于網絡藥理學預測加味丹參飲預防心肌缺血再灌注損傷（myocardial ischemia reperfusion injury， MIRI）的活性成分、作用靶點及信號通路，并進行實驗驗證研究。方法 通過TCMSP、UniProt等數據庫搜集加味丹參飲相關成分及靶點；通過GeneCards、OMIM以及DRUGBANK數據庫獲取MIRI疾病相關靶點；利用STRING平臺分析構建蛋白互作網絡模型；通過Metascape平臺分析“藥物-成分-靶點”及其參與的生物學過程及信號通路，而后采用Cytoscape 3.7.1軟件構建“加味丹參飲成分-MIRI靶點-通路”網絡。加味丹參飲預防性給藥灌胃1周后，采用結扎大鼠左前降支的方法，建立實驗性MIRI大鼠模型。通過ELISA觀察MIRI大鼠血清丙二醛（malonic dialdehyde， MDA）、肌酸激酶同工酶MB（creatinekinase-MB， CK-MB）、乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase， LDH）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase， SOD）水平，HE染色觀測心肌病理改變，qRT-PCR、Western blot檢測大鼠血清心肌組織環氧合酶2（prostaglandin-endoperoxide synthase 2， PTGS2）、蛋白激酶B1（akt serine/threonine kinase 1， Akt1）表達水平。結果 初步篩選獲得加味丹參飲中的活性成分102個，藥物疾病交集基因140個，核心靶點54個；其中，Akt1、原癌基因JUN（Jun proto-oncogene， JUN）、信號轉導與轉錄激活因子3（signal transducer and activator of transcription 3， STAT3）、PTGS2等靶點可能與MIRI密切相關，富集分析預測加味丹參飲預防MIRI主要涉及調節癌癥相關通路等20條通路，并且其中5條通路中Akt1處于PTGS2上游。動物實驗結果顯示，加味丹參飲能夠顯著提高MIRI大鼠血清MDA、CK-MB、LDH水平（P<0.05），同時降低SOD水平（P<0.05），抑制心肌組織中Akt1、PTGS2表達水平（P<0.05），減輕心肌組織壞死。結論 加味丹參飲可能同時抑制Akt1、PTGS2兩個靶點，緩解過度心肌損傷，發揮預防MIRI作用。

〔關鍵詞〕 心肌缺血再灌注損傷；加味丹參飲；網絡藥理學；MIRI大鼠模型；作用機制；蛋白激酶B1；環氧合酶2

〔中圖分類號〕R285.5 ? ? ? 〔文獻標志碼〕A ? ? ? ?〔文章編號〕doi：10.3969/j.issn.1674－070X.２０23.03.016

Network pharmacology analysis and experimental verification of mechanism of Jiawei Danshen Decoction in preventing myocardial ischemia-reperfusion injury

HU Xudong1， PENG Muzi2， CHEN Ming1， LIAO Jing1， CHEN Cong1*

1. College of Chinese Medicine， Hunan University of Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410208， China; 2. Institute of Innovation and Applied Research in Chinese Medicine， Hunan University of Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410208， China

〔Ａｂｓｔｒａｃｔ〕 Objective To predict active constituents， drug targets， and signaling pathways of Jiawei Danshen Decoction （JWDSD） in the prevention of myocardial ischemia-reperfusion injury （MIRI） based on network pharmacology and to perform experimental validation. Methods The related constituents and targets of JWDSD were obtained from the Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform （TCMSP） and UniProt; the MIRI-related targets were obtained from GeneCards， OMIM and DrugBank databases; the protein-protein interaction （PPI） network model was analyzed and constructed by String platform; the “drug-component-target” and the involved biological processes and signaling pathways were analyzed by the Metascape platform， and then the “JWDSD component-MIRI target-pathway” network was constructed by Cytoscape 3.7.1 software. The MIRI rat model was established by ligating the left anterior descending artery of rats one week after preventive gavage administration of JWDSD. The serum malonic dialdehyde （MDA）， creatinekinase-MB （CK-MB）， lactate dehydrogenase （LDH） and superoxide dismutase （SOD） level of MIRI rats were observed with ELISA， the pathological change of myocardium of the rats was observed by HE staining， and the serum prostaglandin-endoperoxide synthase 2 （PTGS2） of rats myocardium and the expression level of akt serine/threonine kinase 1 （Akt1） were detected by qRT-PCR and Western blot. Results The total of 102 active constituents in JWDSD， 140 drug-disease intersection genes and 54 core targets were obtained by preliminary screening. Akt1， Jun proto-oncogene （JUN）， signal transducer and activator of transcription 3 （STAT3）， PTGS2 and other targets may be closely related to MIRI. KEGG enrichment analysis predicted that the prevention of MIRI by JWDSD mainly by the regulation of 20 pathways， including cancer-related pathways， and Akt1 is upstream of PTGS2 in 5 pathways. Animal experiment showed： JWDSD could significantly increase the serum levels of malondialdehyde （MDA）， creatine kinase isoenzyme MB （CK-MB）， and lactate dehydrogenase （LDH）; meanwhile， it could decrease the level of superoxide dismutase （SOD） （P<0.05）， inhibit the expression levels of Akt1 and PTGS2 in myocardial tissue and reduce myocardial tissue necrosis in MIRI rats （P<0.05）. Conclusion JWDSD may inhibit Akt1 and PTGS2 targets at the same time， thereby alleviating excessive myocardial damage and preventing MIRI.

〔Ｋｅｙｗｏｒｄｓ〕 myocardial ischemia-reperfusion injury; Jiawei Danshen Decoction; network pharmacology; MIRI rat model; mechanism of action; akt serine/threonine kinase 1; prostaglandin-endoperoxide synthase 2

在心血管疾病中，急性心肌梗死致死率一直居高不下，目前，雖然可以通過擴張冠脈和溶栓等手段進行有效治療，但血液重新灌注后進一步加劇心肌損傷，導致梗死面積擴大并引發嚴重的心律失常，這種梗死后再灌注引起不可逆嚴重損傷的現象被稱為心肌缺血再灌注損傷（myocardial ischemia reperfusion injury， MIRI），是臨床上常見且亟須解決的問題[1-4]。

中藥復方調治冠心病的優勢日漸突出，加味丹參飲化裁于陳修園所著《時方歌括》中的丹參飲，由丹參、黃芪、檀香、赤芍、川芎、當歸、紅花和生地黃組成，具有益氣健脾、活血化瘀的功效，臨床應用療效顯著[5-7]。研究證實，該方通過多環節、多靶點、多層次調控細胞凋亡、抗炎等途徑減輕MIRI，尤其是在改善癥狀方面潛力巨大，但其多環節、多靶點作用的確切機制尚未清晰[5-8]。

網絡藥理學是醫學、生物學、信息學等多學科理論與研究手段整合的結果，能夠系統綜合地反映藥物對疾病網絡的干預機制[9-10]。這與中醫藥論治的整體動態性原則及復方多成分、多靶點、多途徑互相作用的特點有很強的趨同性。為此，網絡藥理學成為研究中藥復方作用機制嶄新而有效的技術支持，進一步幫助揭示中藥復方科學內涵，傳承、發展和完善中醫藥理論[11-12]。

故本研究基于網絡藥理學技術方法，探究加味丹參飲預防MIRI的分子機制，并進行動物實驗驗證，為后續更進一步研究提供必要的理論與實驗基礎。

1 方法

1.1 ?加味丹參飲成分靶點搜集及藥物-成分-靶點網絡圖的構建

使用TCMSP數據庫（http：//lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php）檢索加味丹參飲復方組成藥物的活性成分。根據中藥成分藥代動力學參數篩選活性成分，以口服生物利用度≥30%和類藥性≥0.18為限定條件。從TCMSP數據庫收集該藥對的潛在作用靶點，通過SWISS數據庫（http：//www.gpmaw.com/html/swissprot.html）篩選P≥0.6的靶點進行補充，并通過文獻檢索補充，全面搜集，并使用UniProt數據庫（http：//www.uniprot.org/uniprot/）將靶點蛋白英文名統一規范為基因名稱。

運用Cytoscape 3.7.1構建加味丹參飲組成藥物-藥物成分-靶點網絡圖，利用Cytoscape 3.7.1內置分析工具計算有效成分及靶點的網絡拓撲參數，獲取包括連接度、介度及緊密度等數據，最終篩選獲取重要靶點及發揮藥效的主要活性成分。

1.2 ?MIRI相關靶點獲取

以“myocardial ischemia reperfusion injury”和“coronary heart disease”為關鍵詞，挖掘GeneCards數據庫（https：//www.genecards.org）、OMIM數據庫（http：//www.omim.org）中調治MIRI的潛在靶點，進入DRUGBANK數據庫（https：//www.drugbank.ca）尋找調治MIRI的臨床一線西藥作用靶點予以補充。合并3個疾病數據庫靶點后，刪除重復值得到MIRI相關靶點。

1.3 ?加味丹參飲成分-MIRI靶點網絡構建及核心靶點篩選

為明確加味丹參飲藥物與MIRI兩者靶點之間的交互作用，取兩者交集并繪制韋恩圖。進而將交集靶點輸入至STRING 11.0數據庫（https：//string-db.org）構建蛋白質-蛋白質相互作用（protein-protein interaction， PPI）網絡模型，并通過Cytoscape 3.7.1對數據進行可視化與數據分析，篩選核心靶點。

1.4 ?加味丹參飲成分-MIRI靶點功能與通路的富集

Metascape平臺（http：//metascape.org/gp/index.html）具有注釋功能且能夠及時更新基因數據資料。將加味丹參飲調治MIRI的靶點輸入Metascape平臺，設置P<0.01，富集分析獲取與其相關的主要信號通路與生物學過程，采用微生信對數據結果進行可視化。

1.5 ?加味丹參飲成分-MIRI靶點-通路網絡圖的構建

運用Cytoscape 3.7.1構建加味丹參飲成分-MIRI靶點-通路網絡圖，利用Cytoscape 3.7.1內置分析工具計算有效成分及靶點參數，并根據結果獲取核心靶點及發揮藥效的主要活性成分。

2 動物實驗驗證

2.1 ?實驗藥物

加味丹參飲：黃芪20 g（廣州工業制藥有限公司，批號：2106211）；丹參20 g、川芎6 g、紅花6 g、當歸6 g（安徽普仁中藥飲片有限公司，批號：21072031B、2108221、2111253、2107122）；檀香6 g（湖南仁上正元中藥飲片有限公司，批號：2021092702）；赤芍10 g（長沙新林制藥有限公司，批號：220101）；生地黃12 g（江蘇龍鳳堂中藥有限公司，批號：21121441C），飲片由湖南中醫藥大學第一附屬醫院提供，經湖南中醫藥大學中藥鑒定教研室龔力民主任鑒定均為正品。煎煮后去渣，濃縮至藥液濃度為2 g/mL（含生藥），于4 ℃冰箱保存備用。

2.2 ?實驗動物

湖南斯萊克景達實驗動物有限公司購進36只雄性SD大鼠，SPF級，體質量（150±20） g，動物合格證號430727211102830068，許可證號SCXK（湘）2019-0004。飼養于湖南中醫藥大學實驗動物中心標準化動物房（相對濕度50%～70%，溫度23～25 ℃，晝夜交替），普通飼料，自由飲水。本實驗由湖南中醫藥大學倫理委員會批準，動物實驗倫理編號LLBH202108250004。

2.3 ?試劑及儀器

PTGS2抗體、Akt1抗體、GAPDH抗體、β-actin（肌動蛋白）（武漢博士德生物工程有限公司，批號分別為A00084、BM1612、BM0627、BM1623）；三氯甲烷、異丙醇、無水乙醇（上海國藥集團化學試劑有限公司，批號分別為10006818、80109218、10009218）；大鼠肌酸激酶同工酶MB、乳酸脫氫酶、丙二醛、超氧化物歧化酶ELISA試劑盒（江蘇菲亞生物科技有限公司，批號分別為FY3500、FY3480、FY8503、FY3262）。

352型酶標儀、AC8型洗板機（Thermo Labsystems）；TGL-16型臺式高速冷凍離心機（湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司）；TC-XP型基因擴增儀（杭州博日科技有限公司）；DYY-7C型電泳儀（北京六一生物科技有限公司）；VE-180型電泳槽（上海天能科技有限公司）；SH01D型高速離心機（上海知信實驗儀器有限公司）；SCIENTZ-24型組織勻漿器、SCIENTZ-1500F型超聲破碎儀（寧波新芝生物科技有限公司）。

2.4 ?動物分組、模型制備及給藥

將所購SPF級雄性SD大鼠，于實驗室飼養籠內適應性飼養1周，按照隨機數字表法分為空白組、假手術組、模型組、加味丹參飲組，每組9只大鼠。空白組動物術前連續7日給予生理鹽水灌胃，每天1次；假手術組動物術前同空白組，術中繞冠狀動脈左前降支穿線，但不結扎；模型組動物術前同空白組，術中繞冠狀動脈左前降支穿線，結扎30 min后進行再灌注90 min；加味丹參飲組動物術前連續7日給予加味丹參飲6.19 g/kg生藥量灌胃，缺血再灌注時間同模型組。參照本課題組前期造模方案[6]制備MIRI實驗大鼠模型，手術造模前，禁食12 h，禁水4 h，進行稱重，3%濃度的戊巴比妥鈉按照0.04 g/kg體質量對大鼠進行腹腔注射麻醉，麻醉成功后，固定，氣管切開，于切口處接小動物呼吸機，暴露胸腔，在左心耳根部1～2 mm處進針，結扎大鼠左冠狀動脈前降支。心電圖顯示ST段弓背向上抬高，QRS波群改變，J點偏移超過0.1 mV，缺血區心肌組織顏色變白為結扎成功標志。結扎一段時間后松開扎線實現再灌注，ST段出現回落，可見梗死區心肌充血，表明再灌注成功，再灌注90 min后，腹主動脈取血，離心機分離上清用于指標檢測；完成腹主動脈取血后，立即取心，沖洗凈血液后，每組6只切取左半心，放入凍存管中后快速放置于液氮罐內，后轉移至-80 ℃冰箱凍存用于qRT-PCR、Western blot檢測，再將每組剩余3只大鼠取全心，用4%的多聚甲醛液進行固定，用于病理染色觀察。

2.5 ?指標檢測

2.5.1 ?ELISA檢測大鼠血清MDA、SOD、CK-MB、LDH水平 ?采用ELISA法檢測各組大鼠血清中MDA、SOD、CK-MB、LDH表達水平，實驗步驟按照試劑盒方法進行操作。

2.5.2 ?HE染色觀察大鼠心肌病理變化 ?沿左心室冠狀面中部切取環狀心肌組織塊，使用4%多聚甲醛固定，乙醇梯度脫水后進行石蠟包埋，進行HE染色，光學顯微鏡下拍照。

2.5.3 ?qRT-PCR檢測心肌組織PTGS2、Akt1基因表達 ?收集各組心肌組織，取適量凍存大鼠左心室心肌組織，采用Trizol法提取心肌組織中總RNA。將總RNA逆轉錄為cDNA后，進行qRT-PCR擴增，反應結束后，觀察擴增曲線、溶解曲線及CT值，以2-ΔΔCt數據分析法對各基因表達進行相對定量計算，再將結果用于統計分析。引物序列為PTGS2正向5'-CTGATGACTGCCCAACTCCC-3'，反向5'-CTGGGCAAAGAATGCGAACA-3'，長度143 bp；Akt1正向5'-CGACGTAGCCATTGTGAAGGAG-3'，反向5'-ATTGTGCCACTGAGAAGTTGTTG-3'，長度173 bp；GAPDH正向5'-CTGGAGAAACCTGCCAAGTATG-3'，反向5'-GGTGGAAGAATGGGAGTTGCT-3'，長度138 bp。PCR擴增條件為：95 ℃預變性5 min，95 ℃5 s，56 ℃ 10 s，72 ℃ 25 s循環40次。

2.5.4 ?Western blot檢測心肌組織PTGS2、Akt1蛋白表達 ?大鼠心肌組織約100 mg，剪碎后置入盛有2.0 mL RIPA蛋白裂解液（含磷酸酶抑制劑）的勻漿器中充分勻漿；于冰上靜置60 min，使其充分裂解。將裂解后的組織勻漿轉移至1.5 mL的離心管中，以4 ℃、12 000 r/min離心15 min（離心半徑6 cm）；取上清，采用BCA法測定各樣本蛋白濃度，并調整至一致；加入等體積蛋白上樣緩沖液，煮沸5 min使其變性。取10 μL蛋白樣品上樣，依次進行SDS凝膠電泳、轉膜、抗原封閉、加入一抗PTGS2（1∶500）、Akt1（1∶500）、GAPDH（1∶1000）孵育過夜、加入羊抗兔二抗（1∶2000）室溫孵育2 h等步驟。最后，采用ECL顯色液顯色，于凝膠成像儀下顯影、拍照；以GAPDH蛋白條帶灰度值為內參，采用Quantity One軟件分析目的蛋白的相對表達水平。

2.6 ?統計學分析

所有數據以SPSS 13.0進行統計，Graphpad Prism 7軟件進行分析。結果以“ｘ±s”表示，組間比較以one-way ANOVA單因素方差分析及q檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

3 結果

3.1 ?加味丹參飲成分靶點篩選及藥物-成分-靶點網絡圖的構建

使用TCMSP數據庫檢索加味丹參飲復方組成藥物的活性成分，根據中藥成分藥代動力學參數篩選活性成分，獲得活性成分102種。通過TCMSP數據庫和SWISS數據庫收集該藥對的潛在作用靶點，并使用UniProt數據庫將靶點蛋白英文名統一規范為基因名稱，獲得對應靶點279個。

運用Cytoscape 3.7.1構建加味丹參飲藥物-成分-靶點網絡圖，見圖1。網絡分析表明，槲皮素Degree為306，介度為0.429 0，緊密度為0.509 0，預測槲皮素為復方的主要活性成分，其次為木犀草素（連接度為174，介度為0.097 9，緊密度為0.404 7）、山柰酚（連接度為124，介度為0.079 2，緊密度為0.409 7）、β-谷甾醇（連接度為79，介度為0.042 3，緊密度為0.388 0）。PTGS2在網絡中的連接度為89，介度為0.118 9，緊密度為0.519 7，預測PTGS2為加味丹參飲復方的最主要靶點，PTGS1與NOCA2亦為相對重要的靶點。

3.2 ?加味丹參飲成分-MIRI靶點PPI網絡構建及核心靶點篩選

通過GeneCards數據庫獲得MIRI靶點1454個，從OMIM數據庫與DRUGBANK數據庫分別補充獲得靶點226個和97個，合并后刪除重復值，最終得到1591個MIRI疾病靶點。

將篩選的加味丹參飲靶點與MIRI疾病靶點取交集，并繪制韋恩圖，得到交集靶點140個，見圖2。隨后將交集靶點輸入至STRING 11.0平臺，得到加味丹參飲-MIRI靶點PPI網絡，網絡圖包括128個節點，635條邊。為進一步篩選獲取核心靶點，將STRING數據庫獲得的結果文件導入Cytoscape 3.7.1中的內置分析工具，對網絡進行分析，篩選條件按degree排列，degree中位數為9.9，篩選大于中位數的靶點進行可視化處理，見圖3，其中Akt1、JUN、STAT3、MAPK1、TNF等在網絡中連接程度較高，說明這些靶點屬于核心靶點。

3.3 ?加味丹參飲成分-MIRI靶點功能與通路的富集

通過Metascape數據平臺對加味丹參飲調治MIRI核心靶點進行富集分析，借助微生信平臺對結果可視化。結果表明，加味丹參飲主要參與的生物學過程包括生物對創傷反應（response to wounding）、炎癥反應（inflammatory response）、對無機物的反應（response to inorganic substance）等；相關靶點調治冠心病的功能主要富集于蛋白結構域特異性結合（protein domain specific binding）、DNA結合轉錄因子結合（DNA-binding transcription factor binding）、蛋白同源二聚體化活性（protien homodimerization activity）、蛋白激酶活性（protein kinase activity）等，見圖4。相關通路主要有pathways in cancer信號通路、AGE-RAGE 信號通路、proteoglycans in cancer信號通路以及PI3K-AKT通路等。詳見圖5。

3.4 ?加味丹參飲成分-MIRI靶點-通路網絡圖的構建

運用Cytoscape 3.7.1構建加味丹參飲成分-MIRI靶點-通路網絡，見圖6。通過Cytoscape 3.7.1內置的NetworkAnalyzer分析加味丹參飲預防MIRI網絡拓撲學參數，得到核心成分及作用靶點。Cytoscape網絡分析表明，PTGS2在網絡中的連接度為86，介度為0.267 8，緊密度為0.550 1，預測PTGS2為加味丹參飲調治MIRI的重要靶點。與此同時，結果顯示PTGS2與Akt1同時在排名20條通路網絡中的pathways in cancer等5條通路中同時出現，Akt1均處于PTGS2上游。

3.5 ?動物實驗驗證

3.5.1 ?大鼠血清MDA、SOD、CK-MB、LDH表達水平

與空白組相比，模型組大鼠血清中MDA、CK-MB、LDH含量明顯升高，SOD含量明顯降低（P<0.01）；與模型組相比，加味丹參飲組大鼠血清中MDA、CK-MA、LDH明顯含量下降（P<0.01），其中加味丹參飲組表達高于假手術組；與模型組相比，加味丹參飲組與假手術組大鼠血清中SOD含量明顯升高（P<0.01）。詳見表1。

3.5.2 ?HE染色觀察大鼠心肌病理變化 ?HE染色結果顯示，與空白組相比，模型組大鼠心肌組織局部壞死，細胞結構模糊，心肌細胞走形紊亂。與模型組相比，加味丹參飲組大鼠心肌組織結構明顯改善，細胞走形規律，輪廓完整，壞死減少。詳見圖7。

3.5.3 ?心肌組織PTGS2、Akt1基因表達 ?與空白組大鼠相比，模型組大鼠PTGS2 、Akt1 mRNA表達增強（P<0.01）；與模型組大鼠相比，加味丹參飲組與假手術組大鼠Akt1、PTGS2 mRNA表達顯著減弱（P<0.01）。詳見表2。

3.5.4 ?心肌組織PTGS2、Akt1蛋白表達 ?與空白組大鼠比較，模型組大鼠PTGS2蛋白表達顯著上調，Akt1蛋白表達顯著下調（P<0.01）；與模型組大鼠比較，加味丹參飲組大鼠PTGS2蛋白表達明顯減少（P<0.01），其中加味丹參飲組蛋白表達高于假手術組；與模型組大鼠比較，加味丹參飲組大鼠Akt1蛋白表達顯著上調（P<0.01），其中加味丹參飲組蛋白表達高于假手術組。詳見圖8和表3。

4 討論

急性心肌梗死是危害廣大人民群眾生命健康的主要疾病之一，再灌注治療是標準治療方案。然而，在強化內科治療基礎上，無論采用介入治療還是外科血運重建策略，仍然有相當一部分患者無法從中完全獲益，中醫藥的介入為臨床診治MIRI提供了廣闊空間[13-14]。陳欣等[15]使用丹參通絡解毒湯干預MIRI模型大鼠，證明該方可通過抑制自噬減輕損傷，其作用機制可能與下調肺癌轉移相關轉錄本1（MALAT1）基因表達和抑制Toll樣受體4/核轉錄因子-κ（BTLR4/NF-κB）信號通路有關。李澤華等[16]發現黃芪的主要成分黃芪甲苷，可通過上調核因子E2相關因子2/血紅素加氧酶1（NRF2/HO-1）信號通路緩解心肌損傷和抑制細胞凋亡。蕭閔等[17]觀察金香丹預處理對MIRI大鼠模型的影響，結果表明NOD樣受體熱蛋白結構域3（NLRP3）表達受到抑制，白細胞介素-1β（IL-1β）表達降低，從而保護心肌細胞，緩解MIRI。

MIRI與冠心病同屬于中醫學“胸痹”的范疇[18]，而近年來我國冠心病患病人群中，中醫辨證以氣虛血瘀型最常見[19]，其病理性質為本虛標實，以氣虛為本，以血瘀為標。益氣活血法在胸痹治療上即補已虛之心氣，化停滯之瘀血，是針對氣虛血瘀病因病機特有的治療法則。加味丹參飲全方由丹參、黃芪、檀香、赤芍、川芎、當歸、紅花、生地黃組成，具有益氣活血、通絡止痛的功效。丹參、黃芪為君藥，益氣活血；臣以赤芍、紅花活血祛瘀；佐以當歸、生地黃養血活血通經；川芎活血行氣止痛，檀香能理氣止痛，兼散寒共為佐使。加味丹參飲預處理可通過抑制P38絲裂原活化蛋白激酶（p38MAPK）信號通路，降低其下游基因環氧合酶-2（COX-2）和細胞間黏附分子-1（ICAM-1）的表達，減輕心肌損傷[7]。亦有研究顯示其減輕心肌損傷的機制與其促進內源性硫化氫生成，上調心肌組織胱硫醚-γ-裂解酶（CSE）mRNA及蛋白表達有關[6]。亦或通過下調Beclin1、LC3A/B、p62和ATG5等基因的表達，抑制自噬信號通路，發揮緩解MIRI的作用[8]。

本研究通過網絡藥理學初步篩選出加味丹參飲調治MIRI的主要靶點為Akt1、PTGS2等，Akt1是影響心肌細胞活性與功能的主要決定因素之一，激活Akt1可以調控下游的因子影響細胞的增殖、凋亡、自噬等過程[20-21]。研究表明[22]，治療高膽固醇血癥的藥物阿托伐他汀可以保護高糖環境下心肌微血管內皮細胞免受氧化應激和凋亡，這種保護作用部分可能與Akt1相關。轉染Akt1基因能夠減輕心肌I/R損傷，其作用機制可能與Akt1抑制心肌缺血再灌注誘導的線粒體膜通透性轉換，從而具有保護線粒體的功能相關[23]。COX-2由基因PTGS2表達而產生，在正常生理條件下表達量極低，而在心血管疾病過程中，其過度表達與炎癥反應的發生密切相關[24]；鄭嫵媚等[25]研究表明，COX-2的高表達可引發過度炎癥反應，在誘導心肌損傷的過程中起到重要作用。本研究證明，網絡藥理學預測的PTGS2、Akt1確實為加味丹參飲調節MIRI的作用靶點，KEGG分析顯示在相關性靠前的pathways in cancer等5條通路中，Akt1均處于PTGS2上游。

本研究網絡藥理學預測Akt1與PTGS2為加味丹參飲預防MIRI重要靶點，且Akt1作用于PTGS2上游。動物實驗結果表明，加味丹參飲干預MIRI大鼠與模型組大鼠相比，血清中MDA、CK-MB、LDH含量明顯升高，SOD含量明顯降低，Akt1和PTGS2 mRNA表達下降，Akt1蛋白表達提升，并且心肌細胞壞死和纖維化程度較低。以上結果證實，加味丹參飲可能同時抑制Akt1、PTGS2兩個靶點，進而緩解過度心肌損傷，發揮預防MIRI作用。

參考文獻

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〔收稿日期〕2022-09-02

〔基金項目〕國家自然科學基金青年項目（81704065）；寧夏自治區重點研發項目（2020BFH02003）；湖南省教育廳科學研究項目（20C1392、20C1416、

19B415）；湖南省衛生健康委科研計劃項目（202202084742）；湖南中醫藥大學科研基金重點項目（2021XJJJ003）；黃政德全國名老中醫藥專家傳承工作室資助項目。

〔第一作者〕胡旭東，男，碩士研究生，研究方向：藏象理論與心血管。

〔通信作者〕*陳 ?聰，女，碩士，副教授，碩士研究生導師，E-mail：50634383@qq.com。