劍麻均一化文庫構建及PnRXLR5863靶蛋白篩選

楊子平　楊倩　汪詢　柯智　鹿志偉　張燕梅　諶惠邦　周文釗

關鍵詞：RXLR 效應蛋白；劍麻；均一化文庫；蛋白質相互作用；斑馬紋病

中圖分類號：S432.1 文獻標識碼：A

效應蛋白是病原微生物產(chǎn)生的一類有利于病原微生物侵染的蛋白質。卵菌中存在數(shù)量龐大的效應蛋白基因，其中RXLR 類效應蛋白的數(shù)量最多。大豆疫霉約含有396 個編碼RXLR 效應蛋白的基因，擬南芥霜霉菌有134 個，橡樹疫霉菌有374 個，馬鈴薯疫霉菌有563 個，葡萄霜霉菌有100 個，煙草疫霉存在超過300 個[1-2]。RXLR 效應蛋白的N端含有約20 個氨基酸的信號肽，在第40～90 位氨基酸處含有一個保RXLR 基序，之后為序列多態(tài)性的效應分子功能區(qū)域，存在數(shù)量不等的W、Y 或者L 基序[3]。RXLR 為胞內效應蛋白，可以抑制植物ROS 的產(chǎn)生、胼胝的沉淀和SA 的含量等基礎防衛(wèi)反應。進一步研究發(fā)現(xiàn)，RXLR 效應蛋白能通過C端功能域結合寄主內靶蛋白，調節(jié)寄主靶蛋白功能， 抑制或者干擾寄主多個生理事件。例如Hyaloperonospora arabidopsidisd 的HaRxLL470 與HY5 相互作用并抑制防御相關基因的轉錄[4]；大豆疫霉（Phytophthora sojae）的PsAvr3c 與剪切體SKRP 蛋白互作，導致防衛(wèi)相關蛋白的Pre-mRNA剪切異常[5]；致病疫霉（Phytophthora infestans）的PITG20303 靶向并穩(wěn)定馬鈴薯免疫負調控因子絲裂原活化蛋白激酶StMKK1，影響水楊酸信號通路[6-7]；大豆疫霉（P. sojae）的PsAvh262 穩(wěn)定內質網(wǎng)蛋白BiPs，引起細胞壞死[8-9]。

卵菌屬煙草疫霉引起的斑馬紋病，是劍麻生產(chǎn)中的主要病害。煙草疫霉通過游動孢子侵染劍麻的葉片，初期引起斑馬紋的病癥，之后逐步引起葉腐和莖腐[10]。目前關于劍麻斑馬紋病的研究還處在病原物的分離鑒定、病原流行性方面，而對煙草疫霉侵染劍麻的致病機制缺乏深入研究。

本課題組已對侵染劍麻不同時間的煙草疫霉進行了轉錄組測序，轉錄組檢測到214 個編碼RXLR的基因。其中PnRXLR5863 表達水平高且表達水平變化顯著，其編碼的蛋白N 端含有信號肽和RXLR-EER 結構域，C 端含有W 和Y 功能結構域。在煙草葉片中瞬時表達PnRXLR5863，能引起細胞死亡，推測PnRXLR5863 是侵染劍麻的關鍵RXLR 效應蛋白，但是PnRXLR5863 作用劍麻的靶蛋白和作用分子機制還不清楚。因此，本研究構建了劍麻酵母雙雜交均一化cDNA 表達文庫，篩選了與PnRXLR5863 相互作用的靶蛋白。結果為深入研究PnRXLR5863 的致病機制奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

劍麻（Agave hybrid No.11648）采自中國熱帶農(nóng)業(yè)科學院南亞熱帶作物研究所劍麻種質保存圃；Trizol 購自Invitrogen 公司；Oligo（dT）、DNA cleanbeads 和PCR mix 磁珠購自諾唯贊公司；均一化試劑盒購自Evrogen 公司； 反轉錄試劑盒、Hi-Fusion 試劑盒、EcoR I、雙鏈cDNA 純化、酵母轉化和文庫構建試劑盒購自Clontech 公司；用于配制酵母培養(yǎng)基的試劑和其他試劑購自Sigma-Aldrich 公司。引物合成與DNA 測序委托廣州艾基生物技術有限公司。

1.2 方法

1.2.1 總RNA 的提取 采集Agave hybrid No.11648植株葉片，液氮速凍。將樣品研磨成粉，Trizol 法提取其總RNA。采用Oligo（dT）磁珠純化mRNA。

1.2.2 RNA 的反轉錄 反應體系中加入1.0 μLCDS Ⅲ和1.0 μL SMART Ⅲ引物，1～500 ng 的mRNA，DEPC H2O 補齊到5 μL，72℃ 3 min，立即置于冰上。之后依次加入1.0 μL DTT，1.0 μLdNTP，1.0 μL MMLV Reverse Transcriptase，2.0 μL5×First-Strand buffer，42℃ 90 min，然后70℃15 min 終止，冷卻至室溫，加入1 μL RNase H，37℃ 30 min，產(chǎn)物存放于?80℃保存。CDS Ⅲ引物和SMART Ⅲ引物序列見表1。

1.2.3 雙鏈cDNA 的合成 2.0 μL 單鏈cDNA，2.0 μL 5' PCR 和3' PCR 引物，25 μL Advantage 2Polymerase Mix 合成雙鏈cDNA，加水補齊到50 μL。PCR 擴增條件為：95℃ 3 min；95℃ 15 s；60℃ 15 s；72℃ 6 min，72℃ 10 min，30 個循環(huán)。5' PCR 引物和3' PCR 引物序列見表1。

1.2.4 雙鏈cDNA 的純化 將1.2 倍樣品體積的磁珠液與雙鏈cDNA 混勻，室溫孵育10 min，轉移到磁力架上，待溶液澄清后（約5 min），小心移除上清。200 μL 新鮮配制的80%乙醇漂洗磁珠（不要攪動磁珠），室溫孵育30 s，小心移除上清；室溫下開蓋干燥磁珠5～10 min，加入30～50 μL 無核酸酶ddH2O，室溫靜置2 min，小心吸取上清至一個新的無核酸酶EP 管中。

1.2.5 cDNA 均一化 按照以下體系進行雜交：1 g ds cDNA，8 μL 2×Hybridization buffer，水補齊到16 μL，將上述溶液平均分成4 份，置于0.2 mLPCR 管中；PCR 儀上98℃放置2 min，迅速轉移到準備好的68℃ PCR 儀中5 h。按照以下體系進行DSN 消化：4 μL 雜交后的cDNA，5 μL 2×DSNmaster buffer （68℃預熱），1 μL DSN solution （分別為DSN，1/2 DSN，1/4 DSN，control），水補齊到16 μL，68℃反應25 min。按照以下體系進行PCR 放大：10 μL 2×DSN stop buffer，室溫放置5 min。5 μL 10×Advantage 2 PCR buffer，1 μL50×dNTP Mix，1.5 μL Primer M1，1 μL 50× Advantage2 Polymerase Mix，1 μL 消化后產(chǎn)物（即DSN，1/2 DSN，1/4 DSN，control），水補齊到50 μL。PCR 擴增條件為：95℃ 1 min；95℃ 15 s；66℃20 s；72℃ 3 min，11 個循環(huán)。

1.2.6 cDNA 小片段去除 預先將CHROMASPINTM TE-400 純化柱中膠體和緩沖液混合均勻，瞬時離心棄液體。將93 μL 雙鏈cDNA 加入純化柱膠體，700 g 離心5 min。向收集液中加入2.5倍體積無水乙醇和1/10 體積的3 mol/L 乙酸鈉（NaAc），置于?20℃沉淀DNA。用20 μL 無菌水溶解沉淀物，并測定雙鏈cDNA 濃度。

1.2.7 雙鏈cDNA 與pGADT7（lineared）同源重組 按照以下體系進行同源重組：2 L ds cDNA，50～200 ng pGADT7，4 μL 5×CE II buffer，2 μLExnase II，水補齊到20 μL，在37℃反應30 min，置于冰上。按照以下體系進行產(chǎn)物純化：20 μL重組產(chǎn)物，2 μL 核酸助沉劑，55 μL 100%乙醇，混勻后于?20℃放置30 min，13 000 r/min 離心15 min，棄上清；加入1 mL 75%乙醇洗滌沉淀，8000 r/min 離心2 min ， 棄上清； 室溫下晾5～10 min，加入10 μL TE buffer 溶解沉淀。

1.2.8 文庫構建 將10 μL 重組產(chǎn)物電擊轉化至50 μL 電轉感受態(tài)中，取10 μL 菌液稀釋10 000倍后，從中取100 μL 涂布于含Amp 抗生素的LB平板，37℃倒置過夜培養(yǎng)。剩余菌液加入甘油至終濃度為20%即為文庫菌液。

1.2.9 文庫質量檢測 文庫庫容（CFU/mL）=克隆數(shù)/涂布體積稀釋倍數(shù)。總克隆數(shù)（CFU）=庫容菌液總體積。PCR 克隆鑒定體系如下，10 μL2× PCR Mix，1 μL T7-F，1 μL 3AD，水補齊到20 μL。PCR 擴增條件為：95℃ 3min；95℃ 15 s；55℃ 15s；72℃ 5 min，72℃ 5 min，25 個循環(huán)。

1.2.10 誘餌載體構建 設計攜帶EcoR I 酶切位點的特異引物（表1），擴增PnRXLR5863 編碼框。將PnRXLR5863 編碼框插入pGBKT7 載體，構建誘餌載體。

1.2.11 誘餌載體自激活檢測 將pGBKT7-PnRXLR5863 載體轉化AH109 酵母菌株，轉化液涂布于不含色氨酸的培養(yǎng)基（SD/-Trp），30℃恒溫培養(yǎng)3～4 d。隨機挑取6 個點，用pGBKT7 的載體引物進行PCR 驗證，隨機取3 個正確克隆點板至SD/-Trp、SD/-Trp/-His、SD/-Trp/-His/-Ade、SD/-Trp/-His/-Ade+X-α-gal 板上，30℃培養(yǎng)3～5 d。其中pGBKT7 為陰性對照。

1.2.12 互作蛋白篩選 制備AH109 酵母感受態(tài)，將文庫質粒和誘餌質粒pGBKT7-PnRXLR5863共轉化AH109 酵母菌，轉化液涂布于SD/-Trp/-His/-Ade 篩選平板。

2 結果與分析

2.1 總RNA的提取

為了鑒定所提取的RNA 是否能用于下游建庫，從中吸取2 μL 進行瓊脂糖電泳檢測和分光光度計測量。結果顯示，能清晰地看到28S 和18S兩條帶，5S 條帶很弱甚至無，表明所提RNA 完整性好，無降解（圖1A）。OD260/OD280 在1.8～2.2之間，表明RNA 純度高；OD260/OD230 大于2，表明糖類、鹽類、有機溶劑等去除干凈。因此，所提取RNA 可用于下游建庫。

2.2 cDNA 的合成

為了判斷所獲得的ds cDNA 是否合成，PCR結束后取5 μL 進行瓊脂糖電泳檢測。結果顯示ds cDNA 呈現(xiàn)彌散條帶（圖1B），表示各種大小的條帶都有，合成的cDNA 質量較好。

2.3 cDNA的純化

為了檢測小片段是否去除，從純化后的溶液里邊吸取5 μL 進行瓊脂糖電泳檢測。結果顯示ds cDNA 呈彌散條帶，500 bp 以下幾乎看不到條帶，表明小片段去除干凈（圖1C）。

2.4 克隆計數(shù)

為了確定文庫庫容，對電轉化液稀釋10 000倍。經(jīng)培養(yǎng)，平板上克隆約為532 個，根據(jù)公式計算得到庫容為5.32×107 CFU/mL ， 總克隆數(shù)為1.064×108 CFU（圖2）。

2.5 文庫質量鑒定

為了檢測文庫的條帶分布，從平板上隨機挑選24 個克隆進行菌落PCR。檢測結果顯示，文庫條帶在1000 bp 上下出現(xiàn)，說明文庫片段平均大小在1000 bp（圖3）。

2.6 自激活檢測

為了檢測誘餌載體是否有自激活，將含誘餌載體的酵母菌點至SD/-Trp 、SD/-Trp/-His 、SD/-Trp/-His/-Ade、SD/-Trp/-His/-Ade+X-α-gal 平板上。結果顯示，陰性對照pGBKT7 能在SD/-Trp平板上生長，在SD/-Trp/-His、SD/-Trp/-His/-Ade、SD/-Trp/-His/-Ade+X-α-gal 平板上均不能正常生長。實驗組與對照組生長一致（圖4）。結果說明誘餌載體無自激活現(xiàn)象。

2.7 靶蛋白篩選

為了獲得陽性克隆，從SD/-Trp/-Leu/-His 篩庫平板上挑取了96 個克隆（圖5），轉板培養(yǎng)一次，對這96 個克隆進行PCR 擴增并對PCR 產(chǎn)物測序，測序結果與GenBank 數(shù)據(jù)庫中的序列進行BLAST 比對分析，去除重復獲得23 個陽性克隆（表2）。蛋白功能注釋結果顯示，這些蛋白主要參與分子功能和生物過程，涉及泛素化過程、蛋白合成、蛋白翻譯和蛋白修飾等生理事件。

2.8 陽性克隆回轉驗證

將陽性克隆與誘餌載體共轉化AH109 酵母菌，點板至SD/-Trp/-Leu、SD/-Trp/-Leu/-His、SD/-Trp/-Leu/-His/Ade 和SD/-Trp/-Leu/-His/Ade+X-α-gal 缺陷平板，進行陽性克隆的回轉驗證。結果顯示（圖6），陽性對照能在SD/-Trp/-Leu、SD/-Trp/-Leu/-His、SD/-Trp/-Leu/-His/Ade 和SD/-Trp/-Leu/-His/Ade+X-α-gal 缺陷平板上生長，并能在SD/-Trp/-Leu/-His/Ade+X-α-gal 缺陷平板上顯藍色；陰性對照僅在SD/-Trp/-Leu 平板上能生長，而在其他平板均不能生長。

23 個陽性克隆能在SD/-Trp/-Leu 和SD/-Trp/-Leu/-His 缺陷型平板上生長，8 個陽性克隆能在SD/-Trp/-Leu/-His/Ade、SD/-Trp/-Leu/-His/Ade+X-α-gal 平板上生長，并能在SD/-Trp/-Leu/-His/Ade+X-α-gal 缺陷平板上顯藍色。

3 討論

酵母雙雜交是目前能夠進行高通量篩選相互作用蛋白的技術之一，文庫質量直接影響互作蛋白的篩選。通常通過文庫基因的完整性和復雜性來評估cDNA 文庫的質量。cDNA 序列的完整性和豐度決定了文庫的完整性，mRNA 序列的完整直接影響cDNA 系列的完整性。采用SMART 技術構建cDNA 文庫，要求實驗材料少、操作簡單、快速[11]，能夠較真實地反映樣品中轉錄本的表達水平，但是低豐度表達基因容易在文庫構建過程中丟失，且不利于篩選獲得低豐度表達基因，高豐度表達基因也會給篩選帶來一定的困難[12]。而利用DSN 酶處理cDNA，能降低高表達基因的拷貝，增加低豐度基因的拷貝[13]，提高篩庫獲得低豐度表達基因的幾率。文庫的完整性可以通過庫容來進行量化評估，高質量文庫的庫容至少為106 CFU，低于此指標，不利于獲得陽性克隆[11]。文庫片段正確表達可以增加文庫的復雜性，通過合成三框cDNA 來實現(xiàn)文庫復雜性，目的是保證文庫片段都能表達出與樣本體內相同的蛋白[13]。這樣，一方面能增加獲得互作蛋白的概率，另一方面也能減少假陽性。為了構建高質量的劍麻酵母cDNA 表達文庫，本研究從總RNA 中純化了mRNA，采用三框引物合成cDNA，利用DSN 對cDNA進行均一化，SMRT技術構建重組文庫質粒，最后將質粒電擊轉化大腸桿菌，構建了一個文庫片段平均大小在1000 bp、庫容為5.32× 107 CFU/mL、總克隆數(shù)為1.064×108 CFU 的均一化文庫。

在之前的研究中，為了篩選與劍麻AhKNOX2蛋白相互作用的蛋白，以健康劍麻葉片總RNA 反轉錄獲得的cDNA 為材料，采用體內同源重組的方式，在酵母體內構建了一個酵母雙雜交文庫，其文庫總容量為3.9106 CFU，插入片段大小主要分布于0.5～3.0 kb 之間，重組率為92%[14]。與前一個文庫構建不同的是，為了篩選與病原菌效應蛋白互作的劍麻靶蛋白，選用煙草疫霉侵染的劍麻葉片為材料，目的是激發(fā)劍麻抗病基因的表達。為排除文庫編碼核糖體蛋白的cDNA 的插入，以及確保文庫插入cDNA 能正確表達，從總RNA中純化了mRNA，并采用了三框引物對mRNA 進行反轉。為了降低高表達基因的豐度和提高低表達量基因的豐度，本研究對合成的雙鏈cDNA 進行了均一化。此外，為了提高轉化效率，本次采用體外同源重組和電擊轉化，在大腸桿菌中構建表達文庫。由文庫質量評估可知，新文庫的庫容量達到107，比前一個文庫提升一個數(shù)量級。劍麻CDS 平均長度為1087 bp（未公布的基因組數(shù)據(jù)），新老文庫篩選獲得的陽性克隆插入片段平均長度為920 bp 和1050 bp，排除由于誘餌蛋白功能導致的靶蛋白的差異，2 個文庫的插入片段均有較好的完整性。

RXLR 是卵菌中第一大類效應蛋白，能夠通過與寄主防御蛋白結合，在表觀修飾水平抑制抗病基因轉錄[15-16]；在轉錄水平抑制寄主防衛(wèi)基因的轉錄[4， 17-18]；在轉錄后水平干擾寄主防衛(wèi)基因的翻譯[5， 19]；干擾寄主信號轉導[6-7， 20-22]；調控自噬[23]；調控細胞間運輸[24]；介導內質網(wǎng)應激[8-9]；操縱活性氧信號[25]。本研究以PnRXLR5863 為誘餌，通過酵母雙雜交從劍麻文庫中獲得23 個互作蛋白。已知功能的16 個蛋白，涉及泛素化過程、蛋白合成、蛋白翻譯和蛋白修飾等生理事件。推測煙草疫霉侵染劍麻過程，PnRXLR5863 效應蛋白可能作用于劍麻的蛋白代謝。