紅鰭東方鲀體表潰爛病優勢菌的分離、鑒定及治療

彭歡 黃宇希 黎睿君

摘 要：2021年11月，遼寧大連某養殖場紅鰭東方鲀（Takifugu rubripes）出現死亡。通過對患病紅鰭東方鲀病灶部位進行細菌分離培養、細菌革蘭氏染色、以及細菌16S rDNA 序列分析，從患病紅鰭東方鲀中共分離出3株優勢菌且均為弧菌，分別為哈維弧菌（Vibrio harveyi）、大菱鲆源弧菌（V. scophthalmi）、費氏弧菌（Aliivibrio fischeri）。藥敏檢測結果表明，費氏弧菌對復方新諾明、氟苯尼考、多西環素3種抗生素敏感；大菱鲆源弧菌僅對恩諾沙星敏感；哈維弧菌對環丙沙星、復方新諾明、氟苯尼考、多西環素、恩諾沙星5種抗生素敏感。3種優勢菌對16種抗生素的藥物敏感實驗結果表明3種優勢菌均為多重耐藥菌。結合藥敏實驗結果與相關研究，推薦聯合多西環素與山蒼子植物精油對紅鰭東方鲀體表潰爛病進行防治。

關鍵詞：紅鰭東方鲀（Takifugu rubripes）；體表潰爛；優勢菌；分離鑒定

2021年11月，大連地區某養殖場發生紅鰭東方鲀（Takifugu rubripes）病害并有大量死亡，主要癥狀為患病魚體表明顯潰爛，形成圓斑，肌肉暴露。病魚解剖后可見肝臟出血，腸脹氣。筆者對患皮膚潰爛病的紅鰭東方鲀進行了優勢菌分離，并通過形態學觀察、革蘭氏染色、16S rDNA 序列分析對分離菌株進行鑒定，同時通過分離菌株的藥敏檢測結果為該病的防治提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

2021年11月，遼寧省大連市某養殖場養殖的紅鰭東方鲀病魚10尾被送至大連市海珍品疾病防控重點實驗室檢測，送檢魚體長約為15 cm左右。

細菌基因組DNA提取試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司；PCR試劑購自寶生物工程（大連）有限公司；藥敏紙片購自杭州微生物試劑有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 病魚解剖與優勢菌分離 將患病紅鰭東方鲀體表用生理鹽水沖洗3遍后，放置于已消毒的托盤中，無菌條件下解剖魚體。分別在病魚體表潰爛處、腸道內容物、肝臟、鰓、脾臟、腹腔黏液中沾取樣本，于NA固體培養基平板劃線接種，在28 ℃恒溫培養箱中培養24 h。培養后在體表潰爛處、腸道內容物、鰓、腹腔黏液共分離到4株優勢菌，將分離菌落分別在NA固體培養基平板上進一步純化，于28 ℃恒溫培養箱中培養12 h。

1.2.2 細菌鑒定 將純化后的細菌進行革蘭氏染色，置于光學顯微鏡（CX21FS1，奧林巴斯）下觀察。用細菌基因組DNA提取試劑盒提取細菌DNA，使用16s rDNA通用引物，正向引物：5-AGAGTTGATCCTGGCTCAG-3；反向引物：5- TACGGCTACCTTGT TACGACTT-3［1］，擴增16 srDNA基因。

PCR 反應體系25 μL：DNA 模板1 μL，正向、反向引物各1 μL，rTaq DNA Polymerase 0.25 μL，10×PCR Buffer （Mg2+ Plus） 2.5 μL，dNTP Mix 1 μL，無菌純水18.25 μL。

PCR 反應參數：94 ℃ 預變性5 min，94 ℃ 變性30 s，55 ℃ 退火30 s，72? ℃ 延伸1.5 min，35個循環；72? ℃ 延伸10 min；4 ℃ 保存。瓊脂糖凝膠電泳檢測 PCR產物，并將 PCR 產物送至上海生工生物工程股份有限公司進行測序，將測得的16S rDNA 序列信息在NCBI數據庫中通過 Blast 檢索比對分析。

1.2.3 藥敏實驗 采用常規 Kriby‐Bauer 紙片擴散法進行藥敏試驗。將分離菌株菌液涂布于NA平板上，用無菌鑷子將藥敏紙片貼于培養基表面，28 ℃恒溫培養箱中培養12 h。用游標卡尺測量各種藥物的抑菌圈直徑，以判定菌株對抗生素的敏感性。

2 結果與分析

2.1 臨床解剖結果

患病紅鰭東方鲀體表明顯潰爛，形成圓斑，肌肉暴露，鰭條和唇部出現潰爛。解剖后可見肝臟出血，腸脹氣，腸炎較嚴重（見封三圖1）。

2.2 細菌分離鑒定結果

2.2.1 革蘭氏染色結果 革蘭氏染色結果表明從體表潰爛處分離的優勢菌1號、鰓分離的優勢菌2號、腸道內容物分離的優勢菌3號、腹腔黏液分離的優勢菌4號均為革蘭氏陰性菌。菌體為桿狀，彎曲呈弧狀（見封三圖2）。

2.2.2 16S rDNA分離鑒定結果 將病魚體表、鰓、腸、腹部中分離到的細菌進行純化及擴培后，用細菌基因組DNA提取試劑盒提取細菌DNA。以細菌基因組DNA為模板，通過PCR擴增菌株的16S rDNA序列，電泳檢測結果顯示PCR產物在約1 500 bp處有明顯的條帶（圖3）。擴增產物經過序列測定，并經NCBI基因序列比對結果表明，體表和鰓潰爛處分離的優勢菌1號、2號均為哈維弧菌（Vibrio harveyi），腸道內容物分離的優勢菌3號為大菱鲆源弧菌（Vibrio scophthalmi），腹腔黏液分離的優勢菌4號為費氏弧菌（Aliivibrio fischeri）。

2.3 優勢細菌的藥敏實驗

16種抗菌類藥物敏感性實驗結果表明，3種優勢菌均為多重耐藥菌。費氏弧菌對復方新諾明、氟苯尼考、多西環素3種抗菌藥敏感，但對卡那霉素、青霉素、環丙沙星等9種抗生素耐藥；大菱鲆源弧菌對慶大霉素敏感，但對青霉素、復方新諾明、阿莫西林等12種抗生素耐藥；哈維弧菌對環丙沙星、復方新諾明、氟苯尼考、多西環素、四環素、恩諾沙星6種抗菌藥敏感，但對氧氟沙星、慶大霉素、頭孢他啶等10種抗生素耐藥，詳見表1。

3 討論

本研究從患病紅鰭東方鲀中共分離出3株優勢菌且均為弧菌，分別為哈維弧菌（V. harveyi）、大菱鲆源弧菌（V. scophthalmi）、費氏弧菌（A. fischeri），推測紅鰭東方鲀體表潰爛病由3種弧菌混合感染所引起。哈維弧菌是海洋微生物區系中的一員，同時也是海洋動物的致病菌之一。在適宜條件下，哈維弧菌可以大量繁殖，通過傷口和消化道感染，導致動物傷口肌肉潰爛化膿和內臟嚴重病變，引起動物死亡［2-4］。本實驗從紅鰭東方鲀的體表潰爛處和鰓均分離到哈維弧菌，且患病魚體表潰爛形成圓斑，表明了哈維弧菌對養殖紅鰭東方鲀同樣可以引起皮膚潰爛癥狀，這與目前哈維弧菌的致病機制研究一致。本研究中從患有腸脹氣和腸炎的紅鰭東方鲀腸道內容物里分離出大菱鲆源弧菌，大菱鲆源弧菌最早由西班牙學者自養殖大菱鲆仔魚腸道中分離并鑒定為弧菌屬細菌的一個新種，而之前的研究表明，可引發腹水癥、腸炎病等［5-6］。費氏弧菌是一種生長在海洋中的革蘭氏陰性菌，是某些海洋魚類的致病菌［7］，研究發現當菌群密度達到一定閾值時費氏弧菌會產生集體發光現象，任何對細胞代謝機制的抑制作用都會導致其發光的減少，所以費氏弧菌目前被普遍作為環境測試指標［8］。因此，我們推測3種弧菌在紅鰭東方鲀體表潰爛病發病過程中均發揮了重要作用，關于3種優勢菌回歸感染實驗將進一步開展。

根據藥敏實驗結果顯示，費氏弧菌對復方新諾明、氟苯尼考、多西環素3種抗菌藥敏感，對氟苯尼考最敏感，抑菌圈直徑為26 mm；哈維弧菌對環丙沙星、復方新諾明、氟苯尼考、多西環素、四環素、恩諾沙星6種抗菌藥敏感，對環丙沙星最敏感，抑菌圈直徑為26 mm；大菱鲆源弧菌僅對慶大霉素敏感，抑菌圈直徑為19 mm，可以看出大菱鲆源弧菌在3種優勢菌中表現出最強的耐藥性，我們推測大菱鲆源弧菌因分離自腸道，紅鰭東方鲀養殖周期較長，這與養殖過程中抗生素的頻繁使用，造成分離的腸道細菌具有非常強的耐藥性。為了進一步控制該疾病，我們推薦了聯合植物精油進行該病的防治，目前的研究表明富含芳香醛、芳香酚和檸檬醛等成分的植物精油能夠很好地抑制大菱鲆弧菌［9］。關于大菱鲆源弧菌的耐藥機制值得進一步研究，有研究表明大菱鲆源弧菌臨床分離株均能產生生物被膜［1］，這可能也與其耐藥性有關。為此，根據藥敏實驗結果，推薦使用抗菌譜廣、抗全身性感染和安全性較高的鹽酸多西環素粉（水產用）藥物進行拌料投喂來治療紅鰭東方鲀體表潰爛病。具體治療方案為，每1 kg魚體重投喂20 mg鹽酸多西環素粉，每日1次，同時日糧中添加0.1%山蒼子精油，連續用藥5 d。值得一提的是，長期以來，由于基層從業人員對于抗生素的使用缺乏正確認識，導致大量的濫用和誤用抗生素。建議生產部門在緊急使用抗生素前，針對優勢病原開展藥敏實驗，根據藥物敏感實驗結果精準用藥，同時聯合使用中草藥治療相關疾病。

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Isolation，identification and treatment of dominant bacteria of Takifugu rubripes skin ulceration disease

PENG Huan，HUANG Yuxi，LI Ruijun

（ College of Fisheries and Life Science，Liaoning Key Laboratory of Marine Animal Immunology，

Dalian Key Laboratory of Marine Animal Disease Control and Prevention，Dalian Ocean University，Dalian 116023，China）

Abstract：In November 2021，Takifugu rubripes emerged skin ulceration disease in an aquaculture farm located in Dalian，Liaoning Province. After dissection of diseased T. rubripes，hemorrhaging liver ，flatulence intestinal and severe enteritis were observed. By bacterial isolation and culture，Gram staining，and bacterial 16S rDNA sequence analysis，three dominant strains of Vibrio were isolated and identified from infected T. rubripes. They were respectively Vibrio harveyi，Vibrio scophthalmi and Aliivibrio fischeri. The results of drug sensitivity test showed that A. fischeri was sensitive to three antibiotics， including compound sulfamethoxazole，florfenicol and doxycycline，respectively. V. scophthalmi could only be inhibited by enrofloxacin.In addition，ciprofloxacin，cotrimoxazole，florfenicol，doxycycline and enrofloxacin had antibacterial activity against V. harveyi. In the experiment of 16 antibiotics sensitivity test，the three dominant bacteria were all multi-drug resistant bacteria. Based on the results of drug sensitivity experiment and related studies，it is recommended to combine usage with doxycycline and Litsea cubeba plant essential oil to prevent and control the skin ulceration disease of T. rubripes.

Key words：Takifugu rubripes; body surface ulceration; dominant bacteria; isolation and identification

（收稿日期：2022-07-11）