雷公藤甲素對小鼠口腔鱗癌淋巴結轉移的抑制及對HOXC10 的影響

杜雯雯，廖鎮，劉洪建

雷公藤具有消炎、抗腫瘤的作用，并與免疫調節有關[1]。體內外實驗已經證實其抑制卵巢癌、鼻咽癌等惡性腫瘤效果明顯[2]。口腔鱗狀細胞癌在全身惡性腫瘤中排行第六位，且隨著生活壓力的加重與生存環境的惡化，其發病率與致死率逐年上升[3]。口腔鱗狀細胞癌常向淋巴結區域轉移，如舌癌可發生早期淋巴結轉移，且轉移率較高[4]。目前口腔鱗狀細胞癌診斷與治療技術有很大提高，但其機制還未明確，影響口腔鱗癌治療效果[5]。本研究探討雷公藤甲素對口腔鱗狀細胞癌淋巴結轉移的影響及可能作用機制，以期為口腔鱗癌治療提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 SPF 級Balb/c 小鼠120 只，雄性，6 周齡，體質量22～24 g，購自浙江維通利華實驗動物技術有限公司，生產許可SCXK（浙）2019-00015。溫度18～22℃，濕度50%～60%，適應性飼養3 d。

1.1.2 主要試劑與儀器 雷公藤甲素（浙江得恩德制藥股份有限公司），兔抗小鼠沉默同源框C10（Homeobox C10，HOXC10）、鈣黏蛋白（epidermal cadherin，E-cadherin）、神經型鈣黏附蛋白（neural cadherin，N-cadherin）、波形蛋白（Vinmentin）、瘤細胞角蛋白（pancytokeratin，pan-CK）一抗和山羊抗兔二抗（Abcam 公司，英國），反轉錄試劑盒、BCA 試劑盒（Takara 公司，日本）。

1.2 方法

1.2.1 建模與分組 從120 只小鼠中隨機選取105只參照李晶等[6]報道的方法建立口腔鱗癌淋巴結轉移模型，4-硝基喹啉-1-氧化物（4-NQO）用無菌水配成2.0 g/L 的溶液，用自來水稀釋成20 mg/L 的溶液，喂養4-NQO 稀釋液32 周，每只小鼠平均每天飲水量20 mL，剩余15 只為對照組，每天喂養等量自來水。8～10 周后，大部分小鼠舌背根部人字溝附近出現白色斑塊，并逐漸向舌尖部蔓延，并在口底、牙齦、上腭出現；11～18 周后，白色斑塊增大，粗糙，呈顆粒狀或出現裂痕；19～27周后，個別小鼠人字溝附近呈現潰瘍狀生長，在其他小鼠牙齦、腭部、唇部陸續發現潰瘍，且部分小鼠頜下淋巴結腫大；28～32 周，大部分小鼠有原發灶腫瘤以及同側或雙側下頜淋巴結轉移。將建模成功的74 只小鼠隨機分為模型組24 只，低劑量組和高劑量組各25 只。

1.2.2 干預方法 建模成功后24h，參照文獻[7]用量，低劑量組和高劑量組分別按照5、10 mg/kg灌胃雷公藤甲素，模型組和對照組灌胃等量生理鹽水。每天給藥1 次，共2 周。

1.2.3 組織取材 干預結束，所有小鼠處死。取部分舌部組織，PBS 沖洗后放4%多聚甲醛中固定保存，其余-80 ℃冷凍保存；取頜下淋巴結，PBS沖洗后放入凍存管冰盒保存。

1.2.4 HE 染色觀察舌部病理變化 取4% 多聚甲醛固定的舌部組織，脫水，浸蠟，包埋，切片（5 μm），HE 常規染色，光鏡下觀察。

1.2.5 免疫組化染色 取凍存管冰盒內頜下淋巴結，制作冰凍切片（5 μm），丙酮溶液固定15 min，PBS 清洗2 min×3 次；3% H2O2 靜置8 min，PBS 清洗2 min×3 次；每張玻片切片組織處滴加50 μL 一抗E-cadherin（1:100）或pan-CK（1:100），置于濕盒中，室溫孵育2 h，PBS 清洗2 min×3 次；滴加通用二抗100 μL，37 ℃孵育30 min，PBS 清洗2 min×3 次；DAB 顯色2 min，顯微鏡下觀察染色情況。

N-cadherin 蛋白表達于細胞質，呈棕黃色顆粒，若細胞胞質中出現明顯的棕黃色染色則為陽性表達。pan-CK 蛋白陽性染色定位在細胞質、細胞膜內，為棕黃色染色顆粒。鏡下出現pan-CK 陽性染色細胞時，即為播散腫瘤細胞（DTC，disseminate tumor cells）陽性，淋巴細胞單核細胞不著色。

1.2.6 RT-qPCR 檢測mRNA 表達取80 mg 保存于-80 ℃的小鼠舌部組織，冰上研磨，提取總RNA，逆轉錄試劑盒反轉錄為cDNA。進行RT-qPCR，檢測CD44 拼接變異體v6（cell differentiation 44 splice variant v6，CD44v6）和腫瘤轉移抑制基因nm23（non-metastatic 23rd，nm23）mRNA 表達水平。PCR 反應條件為預變性95 ℃ 5 min；變性95 ℃ 15 s；退火57 ℃ 20 s，延伸72 ℃ 20 s，共40 個循環，4℃終止反應。以GAPDH 為內參基因，采用2-△△Ct 法對數據進行相對定量分析。引物序列見表1。

表1 引物序列

1.2.7 Western Blot 檢測蛋白相對表達水平 取100 mg 保存于-80℃的小鼠舌部組織，加入蛋白提取裂解液，冰上裂解，離心取上清用BCA 蛋白定量試劑盒進行定量，95 ℃水浴使蛋白變性，進行SDS-PAGE 凝膠電泳，電轉至PVDF 膜，5%脫脂牛奶室溫封閉2 h，洗膜后分別加入1:1 000 稀釋的HOXC10 多克隆抗體，E-cadherin、N-cadherin和Vinmentin 一抗，4℃孵育過夜，洗膜后加入1:4 000 山羊抗兔二抗，室溫孵育1 h，洗膜后加入ECL 發光液顯影，采用ImageJ 軟件分析圖像，以β-actin 為內參，各蛋白條帶灰度值/β-actin蛋白條帶灰度值表示HOXC10、E-cadherin、N-cadherin 和Vinmentin 蛋白相對表達量。

1.3 統計學方法 采用SPSS24.0 統計學軟件分析數據，計量資料以均數±標準差（x±s）表示，多樣本計量資料比較采用單因素方差分析，兩兩樣本比較采用LSD-t 檢驗。P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 HE 染色觀察舌部病理變化 對照組舌部表面光滑，顏色正常；模型組口腔癌細胞團塊狀排列，中心部分可見角化珠；低劑量組舌部中重度異常增生，上皮釘突明顯增長；高劑量組黏膜上皮基底細胞極性消失，細胞的核漿比例增加，輕度異常增生。見圖1。

圖1 舌部病理變化（HE×200）

2.2 各組小鼠淋巴結N-cadherin 表達比較 對照組在口腔黏膜上皮基底層中可見極少量N-cadherin 陽性染色，染色淺；模型組在淋巴結轉移癌組織中可見大量N-cadherin 陽性染色，染色深；低劑量組在口腔鱗癌組織上皮基底層、癌巢中心的細胞上可見N-cadherin 陽性染色，染色深；高劑量組在口腔異常增生組織有N-cadherin 陽性染色，染色淺。對照組、模型組、低劑量組和高劑量組N-cadherin 陽性率分別為（14.76±4.75）%、（78.95±6.42）%、（53.48±6.13）%、（32.53±5.52）%。與對照組比較，模型組、低劑量組和高劑量組N-cadherin陽性率升高（P＜0.05）；與模型組比較，低劑量組和高劑量組N-cadherin陽性率降低（P＜0.05）；與低劑量組比較，高劑量組N-cadherin 陽性率降低（P＜0.05）。見圖2。

圖2 N-cadherin 在各組小鼠中的表達（×200）

2.3 各組小鼠淋巴結DTC 表達比較 對照組頜下淋巴結中有個別pan-CK 陽性細胞，染色淺；模型組鱗癌轉移頜下淋巴結中有成片分布的pan-CK 陽性細胞，染色深；低劑量組鱗癌未轉移頜下淋巴結中散在分布pan-CK 陽性細胞，染色深；高劑量組在口腔異常增生頜下淋巴結有少量散在分布pan-CK 陽性細胞，染色淺。對照組、模型組、低劑量組和高劑量組pan-CK 陽性率分別為（9.76±3.23）%、（82.25±4.88）%、（48.29±4.16）%、（26.23±3.67）%。與對照組比較，模型組、低劑量組和高劑量組pan-CK 陽性率升高（P＜0.05）；與模型組比較，低劑量組和高劑量組pan-CK 陽性率降低（P＜0.05）；與低劑量組比較，高劑量組pan-CK 陽性率降低（P＜0.05）。見圖3。

圖3 DTC 在各組小鼠中的表達（×200）

2.4 各組小鼠原發灶組織CD44v6、nm23 mRNA表達水平比較 CD44v6、nm23 mRNA 表達水平組間比較，差異有統計學意義（P＜0.05）。與對照組比較，模型組、低劑量組和高劑量組CD44v6 mRNA 表達水平升高，nm23 mRNA 表達水平降低（P＜0.05）；與模型組比較，低劑量組和高劑量組CD44v6 mRNA 表達水平降低，nm23 mRNA 表達水平升高（P＜0.05）；與低劑量組比較，高劑量組CD44v6 mRNA 表達水平降低，nm23 mRNA表達水平升高（P＜0.05）。見表2。

表2 CD44、nm23 相對表達水平（，n=5）

表2 CD44、nm23 相對表達水平（，n=5）

注：與對照組比較，aP ＜0.05；與模型組比較，bP ＜0.05；與低劑量組比較，cP ＜0.05。Note: Compared with the control group,aP ＜0.05;compared with the model group,bP ＜0.05;compared with the low-dose group,cP ＜0.05.

2.5 各組小鼠原發灶組織HOXC10、N-cadherin、Vinmentin 和E-cadherin 蛋白相對表達水平比較HOXC10、N-cadherin、Vinmentin 和E-cadherin 蛋白相對表達水平組間比較，差異有統計學意義（P＜0.05）。與對照組比較，模型組、低劑量組和高劑量組HOXC10、N-cadherin 和Vinmentin 蛋白相對表達水平升高，E-cadherin 蛋白相對表達水平降低（P＜0.05）；與模型組比較，低劑量組和高劑量組HOXC10、N-cadherin 和Vinmentin 蛋白相對表達水平降低，E-cadherin 蛋白相對表達水平升高（P＜0.05）；與低劑量組比較，高劑量組HOXC10、N-cadherin 和Vinmentin 蛋白相對表達水平降低，E-cadherin 蛋白相對表達水平升高（P＜0.05）。見表3，圖4。

圖4 HOXC10、N-cadherin、Vinmentin 和E-cadherin蛋白相對表達水平

表3 HOXC10、N-cadherin、Vinmentin 和E-cadherin蛋白相對表達水平（x±s，n=5）

3 討論

雷公藤甲素是雷公藤的主要活性成分之一，能明顯抑制腫瘤細胞的增殖，低濃度就有明顯抑瘤效果，與其他化療藥物合用能顯著增強化療效果[8]。研究發現，結合雷公藤甲素的治療窗、安全范圍、治療指數等，提示雷公藤內酯醇在頭頸部惡性腫瘤的化療中具有一定的臨床應用價值[9]。口腔鱗狀細胞癌主要經淋巴道向其他部位轉移，淋巴轉移程度是影響患者預后非常重要的因素[10]。因此，探討雷公藤甲素對小鼠口腔鱗癌淋巴結轉移的抑制作用，在臨床上具有一定指導意義。

雷公藤甲素是一個具有多種生物活性的天然產物，研究表明它具有抗氧化，抗類風濕，抗老年性癡呆癥、抗癌等功效，是雷公藤片、雷公藤多甙片等制劑的主要有效成分[11]。研究發現，腫瘤組織黏著斑激酶無論mRNA 水平還是蛋白水平都受到雷公藤甲素的抑制，且雷公藤甲素抑制黏著斑激酶基因的表達對腫瘤細胞的遷移以及腫瘤在動物體內的轉移具有抑制作用，提示雷公藤甲素既能抑制腫瘤細胞體外遷移，又能抑制腫瘤細胞體內轉移[12]。臨床研究證明，雷公藤甲素聯合化療一線治療復發性鼻咽癌具有良好臨床效果[13]。體外實驗研究顯示，雷公藤甲素能抑制人肺癌細胞增殖、侵襲和遷移能力[14]。N-cadherin 屬于鈣黏蛋白家族，在腫瘤侵襲和轉移過程中，上皮組織的鈣黏蛋白向神經組織的鈣黏蛋白轉化，導致上皮細胞失去極性，細胞間黏連喪失，并獲得間充質特性，促進上皮組織發生腫瘤并獲得侵襲和轉移能力。腫瘤細胞間粘附能力下降，是大多數惡性腫瘤細胞入侵周圍組織和遠處轉移的第一步，DTC 是腫瘤轉移和發展過程中的重要環節。本研究中雷公藤甲素高劑量組HE 染色后舌部病理變化顯著改善，N-cadherin 和DTC 陽性細胞率降低，提示雷公藤甲素可抑制小鼠口腔鱗癌淋巴結轉移。CD44 是細胞表面分布較為廣泛的跨膜糖蛋白，主要參與異質性黏附，異質性黏附能夠促進腫瘤細胞侵襲轉移[15]。研究發現CD44 在小細胞肺癌細胞系及組織中表達，且其表達存在異質性，提示CD44 可能與癌浸潤轉移有關[16]。nm23 編碼產物具有抑制腫瘤轉移的功能，其基因表達與淋巴結轉移呈負相關[17]。研究中發現nm23 能夠抑制癌細胞株的運動能力和轉移能力[18]。本研究中雷公藤甲素治療后CD44v6 表達下調，nm23 表達上調，提示雷公藤甲素能夠抑制口腔鱗癌的轉移。Vimentin 和E-cadherin 均與腫瘤轉移密切相關，Vimentin 調節細胞骨架蛋白、細胞粘附分子等蛋白間的相互作用，參與腫瘤細胞和腫瘤相關內皮細胞、巨噬細胞的粘附、遷移和信號轉導，與腫瘤發生、轉移密切相關[19]。E-cadherin 下調會導致細胞粘附功能障礙，且具有高度浸襲性，E-cadherin的表達與癌細胞的浸潤與轉移有關[20]。HOXC10基因異常表達，會導致個體發育和組織器官形成異常，參與胃癌、肝癌等多種惡性腫瘤轉移和侵襲過程[21-22]。HOXC10 表達水平升高可促進頭頸部鱗狀細胞癌細胞遷移和增殖[23]，也可通過調節上皮間質轉化促進口腔鱗狀細胞癌遷移和侵襲，靶向抑制其表達可能是臨床預防鱗狀細胞癌的潛在治療方式[24]。本研究中雷公藤甲素高劑量組HOXC10、N-cadherin 和Vinmentin 蛋白相對表達水平降低，E-cadherin 蛋白相對表達水平升高，提示雷公藤甲素可能通過降低HOXC10 的表達，進而抑制口腔鱗癌淋巴結轉移。

綜上所述，雷公藤甲素對小鼠口腔鱗癌淋巴結轉移具有抑制作用，且可能通過抑制HOXC10表達發揮作用。