日糧中添加不同比例葡萄籽對(duì)多浪羊十二指腸細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)的影響

高 帆,馬忠杰,許貴善,2,王 彥,彭婉婉,馮昕煒,2,袁國(guó)宏

(1.塔里木大學(xué)動(dòng)物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,新疆阿拉爾 843300;2.塔里木畜牧科技兵團(tuán)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,新疆阿拉爾 843300)

0 引 言

【研究意義】新疆南疆植被覆蓋度低、生態(tài)環(huán)境脆弱、飼草料質(zhì)次量少[1-2]。新疆是我國(guó)第一大葡萄產(chǎn)區(qū),2019年新疆水果產(chǎn)量為1 604.75×104t,其中葡萄產(chǎn)量為313.17×104t[3]。葡萄皮渣是釀酒葡萄榨汁后或葡萄酒發(fā)酵后的剩余物,占葡萄漿果的10%左右,其中葡萄籽占葡萄皮渣的50%左右。我國(guó)每年生產(chǎn)的葡萄皮渣在快速增加,但能被用作飼料的皮渣量?jī)H占25%[4]。開(kāi)發(fā)與利用有上升空間[5]。【前人研究進(jìn)展】葡萄皮渣含有較豐富的粗蛋白質(zhì)、粗脂肪、碳水化合物和功能性多酚化合物,在反芻動(dòng)物飼料中可替代一定比例的玉米、豆粕及粗飼料,或作為飼料添加劑應(yīng)用[5]。郝小燕等[6]研究了葡萄皮渣對(duì)綿羊肉品質(zhì)、肌肉抗氧化性的影響結(jié)果顯示,葡萄皮渣可降低背最長(zhǎng)肌剪切力,對(duì)羊肉pH、肉色、蒸煮損失及肌內(nèi)脂肪含量無(wú)顯著影響。腸道微生物在刺激新生動(dòng)物腸道免疫系統(tǒng)的建立[7],以及參與宿主免疫調(diào)節(jié)方面發(fā)揮重要作用[8],另外在動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)降解與利用方面也具有重大意義[9]。細(xì)菌作為腸道菌群數(shù)量最大的一類,其多樣性極高[10]。腸道細(xì)菌菌落受遺傳[11]、季節(jié)[12]、飼料[13,14]和飼養(yǎng)方式[15]等多種因素影響。【本研究切入點(diǎn)】在反芻動(dòng)物腸道中大量微生物之間相互作用從而實(shí)現(xiàn)了對(duì)飼料養(yǎng)分的高效利用。正常穩(wěn)定的腸道菌群是機(jī)體健康的重要保證,在促進(jìn)腸道形態(tài)結(jié)構(gòu)發(fā)育、維持正常免疫功能及抵御外源致病因子侵襲等方面發(fā)揮著重要作用[16]。葡萄籽中含有原花青素單寧,Lee等[17]在研究原花青素對(duì)體外腸道菌群的影響中發(fā)現(xiàn),原花青素能夠有效抑制腸道致病菌,而對(duì)益生菌的影響較小。需研究日糧中添加不同比例葡萄籽對(duì)多浪羊腸道細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)的影響。【擬解決的關(guān)鍵問(wèn)題】選取25只3月齡體重(20±1.5) kg的健康多浪羊?yàn)樵囼?yàn)動(dòng)物,研究在日糧中添加不同比例的葡萄籽對(duì)多浪羊腸道細(xì)菌結(jié)構(gòu)的影響,為葡萄籽在反芻動(dòng)物飼料中的開(kāi)發(fā)與利用提供理論依據(jù)和基礎(chǔ)參數(shù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

試驗(yàn)于2020年7～10月在塔里木大學(xué)動(dòng)物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院實(shí)驗(yàn)站進(jìn)行。

參考美國(guó) NRC(2007)體重30 kg、日增重200 g/d的肉羊營(yíng)養(yǎng)需要,按照“等能等氮”的原則,設(shè)計(jì)5種添加不同比例葡萄籽的日糧:0%,(對(duì)照組,A組)、4%,(B組)、8%(C組)、12%(D組)、16%(E組)。試驗(yàn)所用葡萄籽來(lái)自伊犁某葡萄酒廠,自然干燥后用錘片粉碎機(jī)粉碎,與其他各飼料原料在混合機(jī)內(nèi)攪拌混勻備用。預(yù)混料為每千克全價(jià)料提供維生素A 1 300 IU,維生素D 400 IU,維生素E 7.5 mg,鐵12.0 mg,銅3.6 mg,錳12 mg,鋅12.5 mg,硒0.2 mg,碘1.0 mg,鈷0.4 mg。代謝能為計(jì)算值,葡萄籽單寧參考盧珍珍[18]文獻(xiàn)進(jìn)行估測(cè),其余營(yíng)養(yǎng)均為實(shí)測(cè)值。表1

表1 5種葡萄籽飼糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平(干物質(zhì)基礎(chǔ))

1.2 方 法

1.2.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

采用完全隨機(jī)設(shè)計(jì)。選用3月齡左右、體重(20±1.5) kg的健康多浪羊公羔25只,按照體重相近的原則隨機(jī)分成5組,每組5只羊。預(yù)飼15 d,正飼90 d。試驗(yàn)開(kāi)始前打掃圈舍,并用84消毒液對(duì)羊舍的棚頂、地面、圍欄等設(shè)施噴灑消毒。試驗(yàn)羊打耳號(hào)、剪毛、并用螨凈進(jìn)行藥浴,配合使用口服驅(qū)蟲(chóng)藥阿苯達(dá)唑每只羊半片,外加伊維菌素注射液進(jìn)行驅(qū)蟲(chóng)處理。試驗(yàn)羊單欄飼養(yǎng),日糧按照先精后粗的順序飼喂。在試驗(yàn)過(guò)程中根據(jù)每只多浪羊采食和健康情況及時(shí)調(diào)整飼喂量。每天飼喂2次(10:00和20:00),試驗(yàn)羊自由采食,第2 d飼喂前保證料槽內(nèi)有大于0%小于5%的剩料。每日清晨清理食槽、水槽,更換潔凈的飲水。

1.2.2 樣品采集與指標(biāo)測(cè)定

屠宰后取十二指腸中段食糜兩管,分別用兩個(gè)10mL凍存管儲(chǔ)存,保存于-80℃冰箱。

解凍后使用TGuide S96 DNA 提取試劑盒完成核酸的提取。使用酶標(biāo)儀(基因有限公司GeneCompang Limited,synergy HTX)對(duì)核酸進(jìn)行濃度檢測(cè),根據(jù)檢測(cè)進(jìn)行擴(kuò)增。

檢測(cè)合格后,根據(jù)全長(zhǎng)引物序列合成帶有 Barcode 的特異引物27F_(16S-F) 5'- AGRGTTTGATYNTGGCTCAG-3'和1492R_(16S-R) 5'-TASGGHTACCTTGTTASGACTT-3'(北京百靈克生物科技有限責(zé)任公司)對(duì)十二指腸內(nèi)容物基因組 DNA 中的 16S rDNA全長(zhǎng) PCR 擴(kuò)增。反應(yīng)混合物的總體積為30 μL,由1.5 μL模板 DNA、3 μL引物混合物(10 μM)、15 μL KOD OneTM PCR Master Mix,10.5 μL ddH2O。擴(kuò)增程序如下:在 95℃變性2 min,隨后在 98℃ 10 s,55℃ 30s,72℃ 1 min 30 ses進(jìn)行25個(gè)循環(huán),并在 72℃延長(zhǎng)2 min。擴(kuò)增后 PCR 產(chǎn)物使用濃度1.8%的瓊脂糖進(jìn)行電泳檢測(cè)(廠家:北京博美富鑫科技有限公司)對(duì)完整性進(jìn)行檢測(cè)。最后PacBio Sequel 進(jìn)行測(cè)序。(測(cè)序工作在百邁客公司進(jìn)行)

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)經(jīng)Excel 初步統(tǒng)計(jì)后,采用SPSS23.0軟件進(jìn)行單因素方差分析,使用鄧肯法進(jìn)行多重比較,結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤(SEM)表示,以P<0.05作為差異顯著的判斷標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 Alpha多樣性

研究表明,所有樣品共測(cè)得171 045條CCS序列,每個(gè)樣品至少產(chǎn)生4 517條CCS序列,平均產(chǎn)生6 842條CCS序列。覆蓋指數(shù)結(jié)果顯示,測(cè)序深度已接近飽和狀態(tài),測(cè)序深度可以代表樣品中細(xì)菌的真實(shí)信息。Alpha多樣性差異不顯著,D組的ACE指數(shù)、Shannon指數(shù)均高于其它四組,D組菌群豐富度和多樣性均高于其他組;而D組的Simpson指數(shù)最高,D組菌群多樣性是4組中最低的,C組Shannon最小,C組物種多樣性是4組中最高。表2

表2 5組多浪羊腸道細(xì)菌Alpha多樣性指標(biāo)

2.2 樣品OTU統(tǒng)計(jì)與分析

研究表明,25個(gè)樣品測(cè)共測(cè)出OTU數(shù)量為1 038,統(tǒng)計(jì)分析試驗(yàn)組與對(duì)照組差異均不顯著(P>0.05)。圖1

五組十二指腸食糜樣共有365條相同tags,分別占各組樣品OTU的43.76%(A)、45.17%(B)、54.40%(C)、57.57%(D)、55.39%(E)。A組獨(dú)有44條,B組獨(dú)有23條,C組獨(dú)有13條,D組獨(dú)有17條,E組獨(dú)有14條。與A組對(duì)比,B組有116條tags與A組不同,C組有134條,D組有121條,E組有123條。C組樣品菌群種類變化最大。圖2

圖1 樣品OTU個(gè)數(shù)分布

圖2 樣品維恩圖

2.3 Beta多樣性

研究表明,檢測(cè)到的總微生物的代表性貢獻(xiàn)率為30.04%,主成分2(PC2)為縱坐標(biāo),貢獻(xiàn)率為18.98%。不同顏色點(diǎn)代表不同分組的樣本,兩樣本點(diǎn)越接近,兩樣本物種組成越相似。隨著葡萄籽添加量的升高,各組多浪羊十二指腸腸道菌群相似度逐步提高,D組、E組菌群聚類較好,B組、C組菌群聚類一般,A組菌群聚類較差。圖3

圖3 PCoA分析

2.4 腸道細(xì)菌菌群分類學(xué)統(tǒng)計(jì)

研究表明,門(mén)水平上共測(cè)得22種菌門(mén),屬水平上發(fā)現(xiàn)202種菌屬。在門(mén)水平上對(duì)照組(A)與試驗(yàn)組(B、C、D、E)四組均以厚壁菌門(mén)(Firmicutes)為第1優(yōu)勢(shì)菌門(mén),D組相對(duì)豐度72.27%較其他四組占比最高,組間差異不顯著(P>0.05)。在門(mén)水平上擬桿菌門(mén)(Bacteroidetes)A組顯著高于其他4組(P<0.05),隨著葡萄籽的添加量的增加抑制了擬桿菌門(mén)(Bacteroidetes)的生長(zhǎng)。Kiritimatiellaeota A組顯著高于B組與D組(P<0.05),并與C組E組差異不顯著(P>0.05)。表3

表3 腸道細(xì)菌門(mén)水平

占比最高的10個(gè)菌屬,占屬水平各組:A組(48.19%)、B組(55.51%)、C組(57.08%)、D組(56.97%)、E組(75.09%),總體水平呈上升趨勢(shì),排名前10的優(yōu)勢(shì)均屬豐度較高。在屬水平上Aeriscardovia為A、B、C、E四組第1優(yōu)勢(shì)菌群占比最高,而D組第1優(yōu)勢(shì)菌群為L(zhǎng)achnospiraceae_NK3A20_group(毛螺菌科NK3A20屬)。Christensenellaceae_R-7_group E組顯著高于其他B、C兩組(P<0.05)。Mogibacterium D組顯著高于C、E兩組(P<0.05)。uncultured_bacterium_o_WCHB1-41各組間差異顯著(P<0.05),其中A組顯著高于B、C兩組。表4

3 討 論

3.1 Venn

腸道微生物群落結(jié)構(gòu)主要由宿主遺傳、性別、年齡及外界環(huán)境因素等決定[18,19]。研究結(jié)果表明,在相同品種的試驗(yàn)動(dòng)物以及相同飼養(yǎng)管理?xiàng)l件下,日糧中添加不同比例的葡萄籽對(duì)多浪羊腸道細(xì)菌影響差異不顯著(P>0.05),但通過(guò)維恩圖對(duì)5組腸道內(nèi)容物樣比較發(fā)現(xiàn),5組共有365條相同tags,與對(duì)照組A組相比C組有134條tags不同。在日糧中添加葡萄籽對(duì)多浪羊腸道細(xì)菌菌群有一定的影響。5組總體微生物組成相似,可能與多浪羊本身抗逆性強(qiáng)有關(guān)。

3.2 多樣性

Alpha多樣性反映微生物物種豐度及均勻度。Chao1指數(shù)和Ace指數(shù)側(cè)重于微生物豐度。香農(nóng)指數(shù)和辛普森指數(shù)衡量物種多樣性,受微生物的均勻度和豐度的影響。相同物種豐度的情況下,辛普森指數(shù)值越小,香農(nóng)指數(shù)值越大,樣品的物種多樣性越高[20]。試驗(yàn)數(shù)據(jù)表明,日糧中添加不同比例葡萄籽對(duì)多浪羊細(xì)菌多樣性影響差異不顯著。各組樣品覆蓋率均達(dá)到湖羊瘤胃內(nèi)微生物群落結(jié)構(gòu)的98%以上,各組樣本的測(cè)序數(shù)據(jù)量合理,能較好地反映多浪羊腸道內(nèi)細(xì)菌菌群情況。

3.3 腸道細(xì)菌分類學(xué)統(tǒng)計(jì)

腸道菌群組成的多樣性是由環(huán)境和宿主遺傳因素形成的復(fù)雜的多基因性狀[21]。動(dòng)物的腸道內(nèi)含有數(shù)以萬(wàn)計(jì)的微生物,包括細(xì)菌、真菌、病毒和古生菌等,其中數(shù)量最的多的是細(xì)菌。這些微生物與宿主共代謝、共進(jìn)化,形成互惠共生的復(fù)雜關(guān)系。腸道菌群能夠?yàn)閯?dòng)物機(jī)體提供營(yíng)養(yǎng)和能量、調(diào)節(jié)免疫[22]、拮抗病原微生物、參與代謝、甚至影響宿主行為[23]。十二指腸優(yōu)勢(shì)菌門(mén)主要是厚壁菌門(mén)與放線菌門(mén),與前人研究相似[24]。擬桿菌門(mén)對(duì)纖維以外的其他物質(zhì)降解起到非常重要的作用,厚壁菌門(mén)主要作用是分解纖維物質(zhì)[25]。相比于對(duì)照組,添加葡萄籽顯著降低了擬桿菌門(mén)的豐度,與Sadet-Bourgeteau等[26]研究結(jié)果相似,隨著葡萄籽添加量增大抑制了擬桿菌門(mén)的豐富度,是由于葡萄籽中含有單寧,隨著單寧含量的遞增會(huì)抑制擬桿菌門(mén)的豐度,與趙夢(mèng)迪等[25]研究相似。厚壁菌門(mén)總體差異不顯著,數(shù)據(jù)顯示隨著葡萄籽添加量的增加總體呈現(xiàn)上升趨勢(shì),添加葡萄籽對(duì)厚壁菌門(mén)豐度有一定促進(jìn)作用。放線菌門(mén)是抗生素、酶與酶制劑的重要產(chǎn)生菌[27],試驗(yàn)數(shù)據(jù)表明放線菌門(mén)相對(duì)豐度五組間差異不顯著,添加不同比例葡萄籽B組、C組、E組放線菌門(mén)相對(duì)豐度均大于對(duì)照組,添加葡萄籽對(duì)放線菌門(mén)相對(duì)豐度有一定促進(jìn)作用。A組、B組、C組、E組優(yōu)勢(shì)菌屬為卡多威亞氏菌屬,五組間差異不顯著,Aeriscardovia是一種革蘭氏陽(yáng)性菌[28]。短鏈脂肪酸在腸道發(fā)揮重要作用[29],如抗炎、抗腹瀉和增強(qiáng)胃腸機(jī)能等[30-32],腸道短鏈脂肪酸含量受制于與毛螺菌屬、瘤球菌屬、擬桿菌屬等[33]。研究中發(fā)現(xiàn),隨著葡萄籽添加量的增加毛螺旋菌屬豐度顯著提高,瘤球菌屬、擬桿菌屬豐度也呈現(xiàn)上升趨勢(shì),其中D組優(yōu)勢(shì)均屬為毛螺菌科NK3A20屬,且顯著高于對(duì)照組。適宜的添加葡萄籽對(duì)抵抗炎癥有潛在的促進(jìn)意義,與楊露等[34]研究相似。

4 結(jié) 論

4.1多浪羊十二指腸內(nèi)容物在門(mén)水平上共測(cè)得22種菌門(mén),屬水平上發(fā)現(xiàn)202種菌屬,其中優(yōu)勢(shì)菌門(mén)均為厚壁菌門(mén)與放線菌門(mén),優(yōu)勢(shì)均屬為Aeriscardovia。

4.2隨著葡萄籽添加量的增加顯著提高了毛螺菌屬的豐度,抑制了擬桿菌門(mén)豐度,同時(shí)對(duì)放線菌門(mén)、瘤球菌屬、擬桿菌屬的豐度有促進(jìn)作用。

4.3日糧中添加不同比例葡萄籽不影響多浪羊腸道細(xì)菌多樣性,影響部分菌群豐度。