lncRNA DUXAP8在子宮內膜癌細胞中的作用機制研究

夏建洪 周立慶 嚴研 馬婷婷 蘇欣宇

子宮內膜癌是最常見的婦科腫瘤之一[1-2],發病率和死亡率較高[3]。因此,探究子宮內膜癌的發病機制對提高子宮內膜癌患者的生存率至關重要。研究表明長鏈非編碼RNA(lncRNA)在子宮內膜癌的診斷和治療中具有廣闊的前景。子宮內膜癌中的lncRNA表達與腫瘤分級和患者生存率有關[4-6]。DUXAP8(Double homeobox A pseudogene 8)是來源于假基因的lncRNA[7],越來越多的研究表明DUXAP8在非小細胞肺癌[8]、腎透明細胞癌[9]和膀胱癌[10-11]等多種癌癥中表達顯著上調,發揮促癌作用。然而目前尚未見到有關于lncRNA DUXAP8在子宮內膜癌中的作用及其調控機制的研究報道。因此,本研究旨從生信數據庫挖掘出發,分析lncRNA DUXAP8在子宮內膜癌的表達情況及其與患者預后的關系,探究lncRNA DUXAP8在子宮內膜癌進展中的作用及其潛在分子機制。

1 材料與方法

1.1 生信分析

從TCGA數據庫(https://portal.gdc.cancer.gov/)下載子宮內膜癌相關的RNA-seq數據,對lncRNA DUXAP8表達數據(腫瘤組織:552;配對組織:35)進行統計分析。以DUXAP8在所有樣本(n=541)里面表達量的中位數作為閾值,將樣本分為DUXAP8高表達組(n=270)和DUXAP8低表達組(n=271)。使用R語言繪制DUXAP8高低表達組患者的生存曲線?；跀祿鞌祿?設置20個月生存期結局事件為“死亡”,至10個月時,以結局事件為“死亡”的病例人數出現斷崖式下降,可能是因為除了部分在觀察終點前失去聯系或退出實驗的患者刪失外,由于這些患者均為未接受治療的患者,從觀察開始至10個月時患者已到達結局事件。

1.2 細胞培養及轉染

正常人子宮內膜間質細胞系hESC及人子宮內膜腺癌細胞系HEC-1A、Ishikawa、RL-95-2和JEC均購自北納生物。hESC和Ishikawa細胞系在含10% FBS的EMEM培養基中培養,JEC細胞系在含有10% FBS的RPMI-1640培養基中培養,RL-95-2細胞系在含有10% FBS的D-MEM/F-12培養基中培養,HEC-1A細胞系在含有10% FBS的McCOY′s 5A(添加NaHCO32.2 g/L)的培養基中培養。上述所有細胞系均在95%空氣、5% CO2的37℃培養箱中培養。

使用RNAiMAX(Invitrogen)將靶向DUXAP8(Invitrogen)的小干擾RNA(siRNA)瞬時轉染到HEC-1A細胞中,具體步驟如下:轉染時在50 μL Opti-MEM?Ⅰ培養基中稀釋6 pmol siRNA雙鏈體,之后在50 μL Opti-MEM?Ⅰ培養基中加入1 μL RNAiMAX,然后將siRNA雙鏈體稀釋液和RNAiMAX稀釋液混合,室溫孵育20 min。將上述混合液加入匯合度約為30%～50%的細胞培養孔中(24孔板,2 000～5 000個細胞/孔),搖動培養板輕輕混合。在95%空氣、5% CO2的37℃培養箱中培養48 h,檢測轉染效率。

使用Lipofectamine 2000試劑盒(Invitrogen)將購自銳博的Vector和DUXAP8轉染到HEC-1A細胞系中。具體步驟如下:轉染時在50 μL Opti-MEM?培養基中稀釋1 μg質粒DNA,之后在50 μL Opti-MEM?培養基中加入5 μL Lipofectamine 2000,將DNA質粒稀釋液和Lipofectamine 2000稀釋液混合,室溫孵育5 min。將上述混合液加入匯合度約為70%～90%的細胞培養孔中(24孔板,5 000～20 000個細胞/孔),搖動培養板輕輕混合。在95%空氣、5% CO2的37℃培養箱中培養48 h,檢測轉染效率。

本研究設置了5組,不做任何轉染處理的空白對照組(Control組),DUXAP8過表達對照組(Vector),DUXAP8過表達組(DUXAP8),DUXAP8敲低表達對照組(si-NC),DUXAP8低表達組(si-DUXAP8),所有組別均進行細胞增殖、遷移、侵襲、凋亡檢測。

1.3 實時熒光定量PCR檢測

用TRIzol試劑(Invitrogen)裂解細胞分離總RNA。通過微量分光光度計評估RNA質量和濃度。使用PrimeScript RT試劑盒(TaKaRa),在標準條件下,將總RNA反轉錄為cDNA。按照制造商的說明,使用SYBR Premix Ex Taq(TaKaRa)測定DUXAP8的表達水平?？偡磻w系為25 μL:SYBR Premix Ex Taq(2×)12.5,PCR Forward Primer(10 μM)0.5 μL,PCR Reverse Primer(10 μM)0.5 μL,cDNA(約100 ng)2 μL,水9.5 μL。反應條件為:95℃預變性10 min 1個循環,95℃變性30 s,58℃退火1 min,72℃延伸30 s,共40個循環。將結果用GAPDH的標準化,表達量采用2-ΔΔCt進行計算。具體的引物如下:DUXAP8:正向引物:5′-GAGAAGCAGT GGTGGGTTCC-3′,反向引物:5′-GAGCAACACAGATGAACCGC-3′;GAPDH:正向引物:5′-GAAGAGAGAGACCCTCACGCTG-3′,反向引物:5′-ACTGTGAGGAGGGGAGATTCAGT-3′。

1.4 Western blot實驗

來自細胞裂解液的蛋白質通過10% SDS-PAGE分離,轉移至0.22 μm硝酸纖維素(NC)膜(Sigma),并與特異性一抗孵育過夜。然后與辣根過氧化物酶(HRP)偶聯的IgG H&L(Abcam,稀釋濃度1∶10 000)孵育2 h。室內溫度下使用化學發光底物(ECL)(ThermoFisher)進行定量蛋白質表達。GAPDH用作內參蛋白。所用一抗均購自Abcam(表1)。

表1 Western blot一抗產品信息

1.5 細胞增殖和克隆形成實驗

進行CCK-8分析以評估DUXAP8或干擾的siRNA轉染后子宮內膜癌細胞的生存能力。轉染48 h后,將細胞(2 000個/孔)接種到96孔板中。并在0 h、24 h、48 h、72 h和96 h向每個孔中加入10 μL CCK-8溶液。使用酶標儀測量450 nm處的吸光度值來確定每個孔中的活細胞的相對數量。

為了進行克隆形成測定,將五組子宮內膜癌細胞接種到6孔板中,培養兩周。然后,將細胞用4%多聚甲醛固定并用結晶紫染色。在顯微鏡下計算細胞克隆數目。

1.6 細胞侵襲實驗

為了評估子宮內膜癌細胞的侵襲能力,進行了Transwell測定。將300 μL無血清的5×104個細胞加入有基質膠包被的8 mm膜的上培養室中。然后,將含有10%胎牛血清的700 μL培養基添加到12孔板的下培養室中。溫育24 h后,用棉絨除去室上部膜上的子宮內膜癌細胞,用4%多聚甲醛固定,并用0.1%結晶紫染色。對染色的細胞成像,并選擇6個隨機視野進行計數。

1.7 劃痕愈合實驗

采用劃痕愈合試驗評估子宮內膜癌細胞的遷移能力。將細胞鋪在6孔板上,并用移液器吸頭刮擦,以產生均勻的傷口。每個孔用PBS洗滌3次以除去漂浮細胞。對于每組,以40倍的放大倍率在顯微鏡下檢測初始距離(0 h)和細胞在刮擦24 h后的距離。

1.8 流式細胞術實驗

轉染后48 h,通過胰蛋白酶消化收獲細胞,并使用FITC Annexin V細胞凋亡檢測試劑盒中FITC-Annexin V和碘化丙啶(PI)雙重染色。然后,用配備有CellQuest軟件的流式細胞儀分析細胞。按照制造商的規程,使用CycleTEST PLUS DNA試劑盒中PI對細胞周期分析的細胞進行PI染色,然后通過FACScan進行分析。確定并比較了G0/G1、S和G2/M相中的細胞比例。

1.9 統計學分析

采用GraphPad Prism 5.0軟件進行數據分析。所有實驗獨立重復3次。計量資料以均數±標準差表示,采用t檢驗進行兩組間比較,單因素方差分析進行多組間比較,重復測量資料使用重復測量方差分析,兩兩比較采用SNK-q檢驗。數據不滿足正態分布,則采用Wilcoxon秩和檢驗。采用Kaplan-Meier方法繪制生存曲線,Log-rank檢驗進行比較,P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 DUXAP8在子宮內膜癌細胞中顯著高表達

通過TCGA數據庫中子宮內膜癌相關轉錄組數據分析,發現DUXAP8在子宮內膜癌組織中明顯上調(P<0.001)(圖1A)。結合TCGA數據庫的臨床數據,發現DUXAP8高表達患者(n=270)總生存率明顯低于低表達患者(n=271)(P=0.0054)(圖1B),并且DUXAP8隨著腫瘤的進展表達量逐漸增加(stage Ⅰ～Ⅳ的患者分別為339例、51例、124例、29例,P=0.0045)(圖1C)。qRT-PCR檢測結果顯示與正常細胞系(hESC)相比,DUXAP8在子宮內膜癌細胞系(HEC-1A、Ishikawa、RL-95-2、JEC)中高表達(4.50±0.40,3.58±0.35,2.29±0.23,2.83±0.28vs.1.00±0.10)(P<0.001)(圖1D),本研究選擇表達水平最高的HEC-1A細胞進行后續實驗。

圖1 DUXAP8在子宮內膜癌組織及細胞系中表達水平

2.2 DUXAP8促進子宮內膜癌細胞的增殖

對子宮內膜癌細胞系HEC-1A中的lncRNA DUXAP8進行過表達處理及沉默處理,并用qRT-PCR檢測其表達效率,結果顯示各組lncRNA DUXAP8表達水平符合預期(2.20±0.22vs.1.10±0.12,0.45±0.06vs.1.08±0.11,P<0.01)(圖2A),可用于后續實驗。細胞增殖及克隆形成實驗表明,過表達DUXAP8能夠增強HEC-1A細胞的增殖和克隆形成能力,而抑制DUXAP8表達的結果則相反(P<0.05)(圖2B,圖2C)。

圖2 DUXAP8對子宮內膜癌細胞的增殖的影響

2.3 DUXAP8調節子宮內膜癌細胞的侵襲、遷移和上皮細胞間質轉化過程

Transwell和劃痕愈合分析顯示DUXAP8過表達促進HEC-1A細胞侵襲和遷移,而沉默DUXAP8結果則相反(P<0.01)(圖3A,圖3B)。采用Western blot實驗檢測上皮間質轉化(EMT)相關蛋白表達情況,結果表明DUXAP8過表達能夠抑制E-Cadherin和Claudin-1蛋白的表達,同時上調N-Cadherin和Vimentin蛋白的表達。同樣,若沉默DUXAP8結果則相反(圖3C)。

圖3 LncRNA DUXAP8調節子宮內膜癌細胞的侵襲、遷移和EMT過程

2.4 DUXAP8調控子宮內膜癌細胞周期及其凋亡

流式細胞術測定過表達及沉默lncRNA DUXAP8對子宮內膜癌細胞系HEC-1A的細胞周期分布及細胞凋亡的影響,發現lncRNA DUXAP8的表達量影響了子宮內膜癌細胞的細胞周期,過表達組細胞多處在S期,而沉默lncRNA DUXAP8將子宮內膜癌細胞阻滯于G0/G1期,差異具有統計學意義(圖4A,圖4B)。此外,細胞凋亡實驗表明,過表達lncRNA DUXAP8抑制了細胞凋亡(P<0.05),而沉默lncRNA DUXAP8促進了細胞凋亡(P<0.05),差異具有統計學意義(圖4C,圖4D)。

圖4 DUXAP8調控子宮內膜癌細胞周期及其凋亡

3 討論

目前,已有研究表明lncRNA的表達失調與許多癌癥的發生密切相關。其中在子宮內膜癌中,許多表達失調的lncRNA參與一些重要的生物學和病理學過程。比如lncRNA CHL1-AS1通過吸附miR-6076調節子宮內膜癌中的CHL1表達來促進細胞增殖和遷移[13];lncRNA FER1L4通過提高子宮內膜癌中的PTEN表達并抑制Akt信號通路的磷酸化發揮抑癌作用等[14],但是lncRNA DUXAP8在子宮內膜癌中的生物功能目前尚不清楚。已有研究證明,lncRNA DUXAP8常在惡性腫瘤中表達上調,并促進腫瘤的惡性進展[12]。為了探究其在子宮內膜癌中的生物學功能,本研究通過生信分析發現lncRNA DUXAP8在子宮內膜癌中表達顯著上調,與Stage分期呈正相關,而與總體生存率呈負相關,這與Lin等[11]報道lncRNA DUXAP8在膀胱癌中表達上調且與TNM分期正相關,與總體生存率負相關一致。

一般來說,lncRNA DUXAP8被認為是促癌因子[15],在包括食管鱗癌[16]在內的大多數癌癥中表達上調,比如高表達的lncRNA DUXAP8通過與組蛋白甲基轉移酶(EZH2)或組蛋白脫甲基酶(LSD1)互作來抑制KLF2,EGR1、RHOB和PLEKHO等抑癌因子的轉錄,從而促進腫瘤細胞的增殖和轉移[8,17]。本研究通過一系列細胞生物學實驗探尋lncRNA DUXAP8在子宮內膜癌發展中的作用。實驗結果表明過表達lncRNA DUXAP8后,子宮內膜癌細胞的增殖、侵襲和遷移能力顯著增強,上皮表型相關蛋白表達明顯下調、間質表型相關蛋白表達明顯上調,這說明lncRNA DUXAP8能促進子宮內膜癌的惡性進程。沉默lncRNA DUXAP8則和Du等[18]報道一致,癌細胞的增殖、侵襲和遷移能力受到了顯著抑制。Ji等[19]發現lncRNA DUXAP8在非小細胞肺癌中表達上調,發揮促進非小細胞肺癌細胞增殖、轉移和EMT進程的作用,此外也有研究證實lncRNA DUXAP8能夠誘導結直腸癌細胞的EMT進程[20],這與本研究結果相一致,說明lncRNA DUXAP8能在多種癌癥中促進EMT進程的發展。Wang等[21]發現lncRNA MIR31HG通過靶向HIF1A和P21,促進細胞周期進程進而促進頭頸癌細胞增殖和腫瘤發生。Hu等[22]也報道了PLAC2通過調節RPL36表達誘導膠質瘤細胞的G1/S期阻滯。這表明lncRNA可能通過影響細胞周期對細胞功能產生影響。我們在沉默lncRNA DUXAP8后,發現分布在G0/G1期的子宮內膜癌細胞顯著增加、在S期的細胞顯著減少并且細胞凋亡率顯著上升,這表明沉默lncRNA DUXAP8很可能將腫瘤細胞阻滯在G0/G1期,誘導細胞周期停滯,從而抑制子宮內膜癌細胞的增殖并促進其凋亡。本文首次研究了lncRNA DUXAP8對子宮內膜癌細胞周期及細胞凋亡的影響,豐富了子宮內膜癌中細胞周期網絡的研究。

綜上所述,本研究發現lncRNA DUXAP8在子宮內膜癌組織及細胞系中高表達,并與子宮內膜癌患者的預后及腫瘤進展有關,有潛力成為子宮內膜癌患者生存的獨立預測因素。此外,本研究揭示了lncRNA DUXAP8具有促進腫瘤細胞增殖、侵襲和遷移的作用。這可能是通過促進腫瘤細胞EMT過程、促進細胞進入S期并且抑制細胞凋亡實現的。這些分析數據可以為子宮內膜癌的診斷或靶向治療提供有價值的lncRNA候選物。但是,本研究存在一些局限性,僅對lncRNA DUXAP8功能進行了驗證,并未研究其潛在的分子機制,這將在我們的未來研究中進一步探討。