潮灘濕地硝化螺菌的代謝潛力和環境適應機制

陳國浩, 毛鐵墻, 董宏坡, 歐亞飛, 張家偉

（華東師范大學 河口海岸學國家重點實驗室, 上海 200241）

0 引言

硝化過程是氮素轉化的重要環節, 包括氨氧化作用和亞硝酸鹽氧化作用, 主要是由微生物主導[1-2].氨氧化古菌(ammonia-oxidizing archaea, AOA)和氨氧化細菌(ammonia-oxidizing bacteria, AOB)主要負責將氨氧化為亞硝酸鹽[3-4], 而亞硝酸鹽氧化細菌(nitrite-oxidizing bacteria, NOB)主要負責將亞硝酸鹽氧化為硝酸鹽[5]. 盡管最近發現了能夠直接將氨氧化為硝酸鹽的細菌[6], 即全程氨氧化細菌(complete ammonia oxidizer, Comammox), 但至今仍未在海洋環境中發現Comammox的基因組序列[7],故NOB對于亞硝酸鹽的氧化仍為硝酸鹽的主要來源之一[8-9].

硝化螺菌(Nitrospira)是NOB中多樣性最為豐富的屬, 至今已發現至少有6個世系(lineages)[10],然而, 僅5個lineages的亞硝酸鹽氧化還原酶(nitrite oxidoreductase, NXR)基因序列[11]和3個lineages的基因組被揭示. 特別地, lineage Ⅲ的培養代表和基因組至今未被發現, 這意味著Nitrospira仍然存在較多未知的類群. 其中, Comammox在進化上屬于Nitrospiralineage Ⅱ, 是近年來氮循環中的一個重大發現, 該細菌可以獨立地完成兩步硝化過程[6].Nitrospira廣泛分布在土壤、淡水、熱泉、地下水、人工系統和海洋中[10-12]. 根據調查和生理實驗,Nitrospira的分布和多樣性受到鹽度、溫度和底物濃度等因素的影響[13-15].

近年來, 發現Nitrospira不僅存在全球分布的特征, 還有著多樣的代謝功能和生存方式. 有的Nitrospira編碼著脲酶和氰酸酶基因[16-17], 能將這些有機氮素降解為氨, 為氨氧化微生物提供能源. 特別地, 部分ComammoxNitrospira能直接利用尿素和氰酸鹽作為能源[6,18-19], 拓寬了對Nitrospira利用氮素的認識. 另外,Nitrospira還可利用氫氣、甲酸鹽和硫化物作為電子供體驅動生長[16,19-20]. 這些功能潛力對氮循環和Nitrospira自身生長均至關重要. 然而, 目前從潮灘濕地獲得的Nitrospira基因組及培養樣品較為缺乏, 對其在潮灘濕地中的功能認識非常有限. 因此, 利用一些新技術獲取更多基因組對Nitrospira進行研究很必要.

潮灘濕地是陸地和海洋的交界地帶, 其在全球的生物地球化學循環中發揮著重要作用. 大量富含氮的生活污水和農業肥料通過徑流作用在潮灘濕地富集, 經過一系列的轉化作用后, 部分流入海洋.根據已有的報道,Nitrospira在人工污水處理系統中發揮著關鍵的作用, 具有較高的功能多樣性[18-19,21].天然的潮灘濕地, 包括紅樹林濕地、鹽沼濕地和河口等, 是龐大而重要的污水處理系統, 含有豐富多樣的Nitrospira物種[22-25]. 為了進一步認識Nitrospira在潮灘濕地中的功能, 本研究選取了中國沿海5個跨不同緯度的潮灘濕地, 從沉積物樣品中恢復了14個Nitrospira基因組. 通過對系統發育、代謝通路和環境適應等方面的分析, 深入研究了這些基因組, 以期為理解Nitrospira在潮灘濕地中的重要生態功能提供更多的科學依據.

1 材料與方法

1.1 研究站位和采樣

本研究從中國沿海的3個潮灘濕地獲得12個沉積物樣品, 包括遼河口鹽沼濕地(LH01和LH02)、崇明島東灘濕地(CM01和CM02)、三亞青梅港紅樹林自然保護區(QM). 使用重力柱采集器,在崇明島東灘濕地和三亞青梅港紅樹林自然保護區獲得3個1 m深的沉積物柱, 且每個沉積柱樣品被平均分割成3 ～ 4份; 在遼河口鹽沼濕地獲得兩個表層(0 ～ 5 cm)沉積物樣品(LH01和LH02). 所有樣品采集完后立即裝進密封的無菌樣品盒, 并放入裝有干冰的儲物箱中運送至實驗室, 將樣品儲藏在 –80℃冰箱中用于測序和理化分析. 另外, 兩個潮灘濕地的宏基因組樣品數據(表1)從開放的公共數據庫美國國家生物技術信息中心(the national center for biotechnology information, NCBI, https://www.ncbi.nlm.nih.gov)中獲得.

表1 樣品的物理和化學性質Tab. 1 Physical and chemical properties of the samples

1.2 DNA提取和測序

使用DNA提取試劑盒 (MoBio Laboratories, Carlsbad, CA, USA), 從5 ～ 10 g沉積物中提取基因組DNA, 使用Qubit 2.0和Nanodrop One (Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA)檢測DNA提取質量. 檢測合格的 DNA 樣品被用于文庫構建和測序. 宏基因組測序數據由Illumina HiSeq 2500儀器生成, 每個樣品大約獲得60 G雙端原始測序序列數據.

1.3 宏基因組組裝和基因組重構

本研究共獲得15個宏基因組數據(表1), 包括從NCBI下載的3個數據 (YD、ZN01 和 ZN02) ,其中, YD由2個較小的宏基因組混合組成. 宏基因組拼接與分箱步驟包括: 先使用Trimmomatic軟件[26]對原始序列進行質量裁剪, 再使用MEGAHIT軟件[27]進行組裝, 參數為(--k-min 27, --k-max 127,--k-step 10), 然后將拼接得到的序列使用MetaBAT軟件[28]進行分箱, 最后使用CheckM軟件[29]將分箱得到的基因組進行完整度和污染度的質量分析. 多樣的基因組組裝參數通過QUAST[30]進行評估.基因組的分類使用GTDB-TK工具[31]獲得, 僅屬于Nitrospirae門的基因組被關注. 序列分類通過CAT軟件 (https://github.com/dutilh/CAT/releases/tag/v5.2.3)識別, 分類成其他門的序列被移除;同時, 不一致的序列被CheckM軟件[29]基于單拷貝基因進行識別和手動移除. 最后, 對候選的基因組基于GC (guanine and cytosine)含量、覆蓋度和四核苷酸頻率使用RefineM[32]進行檢查和校正, 完整度大于70%和污染度小于5%的基因組會被進一步分析.

1.4 系統發育分析和基因組注釋

為確定重構基因組的系統發育地位, 本研究從NCBI數據庫下載了Nitrospirae門的基因組. 通過使用GTDB-TK軟件[31]對細菌的120個標記蛋白進行串聯, 并使用IQ-TREE軟件[34]構建最大似然樹, 利用iTOL[35]對進化樹進行可視化. 為進一步識別基因組的進化地位, 使用Barrnap軟件(https://github.com/tseemann/barrnap)預測基因組的16S rRNA基因. 同時, 從NCBI數據庫中下載了其他的16S rRNA基因, 使用MAFFT軟件[36]對這些序列進行比對, 并使用BMGE軟件[37]進行切邊處理. 最后, 使用IQ-TREE軟件[34]構建最大似然樹和利用iTOL[35]對進化樹進行可視化.

為探究氰酸酯酶基因的進化地位, 從NCBI中下載已知的NOB和AOA的氰酸酶基因的氨基酸序列及相似的部分序列, 并利用HMMER3[38]識別公共數據庫及本研究獲得的Nitrospira屬基因組中的氰酸酶基因. 比對所有這些氨基酸序列, 對所得結果使用IQ-TREE軟件[35]進行最大似然樹的構建.

使用Prodigal軟件[39]對基因組的開放閱讀框(open reading frame, ORF)進行預測, 并將核酸序列翻譯為蛋白序列. 然后, 使用BlastP工具[40]比對COG和NCBI 非冗余蛋白數據庫, 進行蛋白功能的注釋(E-value 閾值 < 1 × 10–5). 同時, 通過在線的KASS[41]工具進行注釋.

2 結果與討論

2.1 Nitrospira基因組的恢復

從5個跨越溫帶和熱帶的潮灘濕地沉積物中, 使用宏基因組測序的方法拼接與組裝得到14個較高質量(完整度>70%、污染度<5%)的Nitrospira基因組 (metagenome-aassembled genomes, MAGs)(表2). 依據大于95%的種間平均核酸相似度 (average nucleotide identity, ANI)閾值[42], 這些MAGs可被劃分為10個新物種. 同時, 基因組系統發育樹(圖1)顯示, 這些MAGs位于3個不同lineages中, 包括lineage Ⅱ、lineage Ⅳ和一個未被定義的系統發育分支. 其中, 3個MAGs與clade A comammoxNitrospira聚在一起. 依據已有的研究, lineage Ⅱ和lineage Ⅳ分別來自兩個完全不同的生態環境系統, 分別為陸地和海洋[10], 這意味著潮灘濕地的Nitrospira有更高的物種多樣性. 有趣的是,基因組進化樹顯示, QMm6和QMb135這兩個Nitrospira物種形成獨立的一簇(圖1), 且不屬于任何已知的世系, 可能為新的Nitrospira物種.

圖1 基于120個保守串聯蛋白構建的Nitrospira基因組最大似然樹Fig. 1 Nitrospira genomic maximum likelihood tree based on 120 conserved proteins

表2 從潮灘濕地宏基因組組裝中提取的14個硝化螺旋菌的基因組特征Tab. 2 Genomic features of 14 Nitrospira MAGs recovered from metagenomic assembly in tidal flat wetlands

為了進一步揭示由QMm6和QMb135聚類成的這一未知的系統發育分支, 基于Nitrospira16S rRNA 基因構建系統發育樹(圖2). 本研究發現16S rRNA 基因樹與Nitrospira基因組樹有著近乎一致的拓撲結構, 且QMm6和QMb135這兩個未曾被揭示的基因組所含的16S rRNA基因序列與前人報道的lineage Ⅲ中的16S rRNA序列聚類成一簇, 這意味著這兩個MAGs隸屬于此前被劃分的lineage Ⅲ[12]. 這一獨特的lineage從發現至今已超過20年, 但只有相應的16S rRNA基因被揭示, 而該分支的培養樣品和基因組均未被獲得[11-12], 因此, 其生理功能和代謝潛力仍有著很大的未知. 本研究首次發現的這兩個隸屬于lineage Ⅲ的MAGs有著較高的恢復質量(完整度分別為95.91%和96.82%),在中國三亞青梅港紅樹林沉積物中獲得. 同時, 對16S rRNA序列的分析發現, 該lineage的成員分布在深海沉積物[43-44]、陸地喀斯特巖洞[45-46]和鹽堿土環境中 (圖2). 而本研究在紅樹林沉積物中首次發現了lineage Ⅲ, 擴大了它們的生境分布范圍.

圖2 基于Nitrospira 16S rRNA序列構建的最大似然樹Fig. 2 Maximum likelihood tree based on Nitrospira 16S rRNA sequences

2.2 代謝潛力分析

本研究重構了14個NitrospiraMAGs的代謝途徑(圖3), 結果表明, 這些MAGs有著典型的Nitrospira所具備的中心碳代謝和能量傳遞系統, 如還原型三羧酸循環、糖酵解/糖質新生及磷酸戊糖途徑等. 盡管少部分MAGs缺失亞硝酸鹽氧化還原酶alpha亞基和亞硝酸鹽氧化還原酶beta亞基, 但有多個拷貝的亞硝酸鹽氧化還原酶gamma亞基存在于這些基因組中. 在3個Comammox的基因組中, 僅CM01m262含有氨單加氧酶gamma亞基和CM01s42含有羥胺氧化還原酶(hydroxylamine oxidoreductase, HAO), 但它們均含有區別于嚴格亞硝酸鹽氧化Nitrospira的Rh類型氨轉運體[18,47],意味著這3個MAGs為典型的ComammoxNitrospira. 這些MAGs除具有進行亞硝酸鹽氧化或全程氨氧化的作用外, 還具有更多的代謝潛力.

圖3 重構14個Nitrospira基因組的代謝途徑Fig. 3 Metabolic pathways of 14 Nitrospira MAGs

近年來, 研究者們發現Nitrospira可將尿素或氰酸鹽降解為銨鹽, 通過“互喂作用”為氨氧化微生物和Comammox 提供底物[16-18,48]. 尿素的裂解已經在一些富集培養的Comammox菌株(Ca.Nitrospira nitrosa,Ca.Nitrospira nitrificans和Ca.Nitrospira inopinata) 中被觀察到[6,47]. 在本研究中, 脲酶基因在兩個Comammox MAGs(CM01m262 和 YD_bin17)中被識別(圖3), 其中YD_bin17含有部分相應的ABC轉運系統, 這意味著尿素也可以被這些來自潮灘濕地的Comammox所利用. 這些Comammox主要存在于鹽度較低的CM01和YD站位中. 最近的研究表明, 有機肥的使用和工廠產生了大量的尿素, 這些尿素通過徑流進入水生生態系統中, 并在河口濕地中積累[45], 導致河口濕地富營養化[49]和水體缺氧[50], 而本文獲得的這些Comammox可以直接轉化尿素并減緩尿素的積累. 盡管尿素的利用已經在一些富集培養的典型Nitrospira中被觀察到[16,51], 然而, 本研究獲得的所有11個典型的Nitrospira基因組均沒有包含脲酶基因, 這意味著典型的Nitrospira與氨氧化微生物通過降解尿素進行互惠生長的過程在潮灘濕地中可能并不普遍. 研究表明, 尿素可自發地裂解為氰酸鹽, 廣泛存在于環境中并參與氮循環[52-53]. 本研究獲得的6個NitrospiraMAGs中含有氰酸酯酶基因(圖3), 其中3個來自CM02和QM站位的NitrospiraMAGs編碼著相應的氰酸鹽轉運體, 表明這些Nitrospira可分解潮灘濕地環境中的氰酸鹽為銨鹽, 并為硝化微生物提供能源, 對氮素循環發揮著重要的作用.本研究中的3個Comammox MAGs均不含有氰酸酯酶基因, 這些基因僅在污水處理系統的幾個ComammoxNitrospira成員中被發現[18-19]. 令人意外的是, 從lineage Ⅲ兩個基因組中發現的氰酸酯酶與此前在其他Nitrospira成員中發現的有著不同的進化關系(圖4(a)), 它們之間有著較低的氨基酸相似度(<40%); 前人發現的Nitrospira中的氰酸酯酶與AOA 菌株Nitrososphaera gargensis的氰酸酯酶有著更近的發育關系(圖4(b)), 而本研究獲得的這些序列與Nitrospinae門和厭氧氨氧化細菌(anaerobic ammonium oxidation, anammox)的氰酸酯酶有著更近的進化關系(圖4(c)). 在AOA 菌株Nitrososphaera gargensis中, 氰酸酯酶可分解氰酸鹽產生氨作為單一能源[17]; 而海洋中的anammox和Nitrospina細菌也表現出降解氰酸鹽的潛力, 可以使用氰酸鹽作為氮源, 或基于對氨氧化微生物的“互喂” 機制作為間接能源[54-56]. 在潮灘濕地MAGs中發現的這些氰酸酯酶氨基酸序列均含有保守的Arg96、Glu99、Ser122活性位點殘基[57](圖5), 這意味著Nitrospira成員中發現的這兩種有著不同親緣關系的氰酸酯酶均具有裂解氰酸鹽的潛力. 這些新發育分支的氰酸酯酶氨基酸序列與Nitrospinasp.(MBM14886.1)有著較高的氨基酸相似度(75% ～ 82%), 意味著它們之間可能發生了水平基因轉移事件. 在Nitrospira中新的氰酸酯酶進化分支的這一發現, 拓展了研究人員對Nitrospira成員中氰酸酯酶的認知, 表明該酶在Nitrospira中的分布可能更為多樣化. 這兩個進化分支的氰酸酯酶基因廣泛存在于Nitrospira不同的lineage基因組中, 而這些不同lineage的Nitrospira廣泛分布于全球的各種生態系統, 包括開闊大洋和陸地生態系統, 意味著氰酸鹽在全球廣泛被Nitrospira作為有機氮降解的底物, 并為氨氧化微生物提供能源.

圖4 氰酸酯酶氨基酸序列的系統發育分析Fig. 4 Phylogenetic analysis of cyanase amino acid sequences

圖5 氰酸酯酶氨基酸位點的比對Fig. 5 Alignment of cyanase amino acid sites

特別地, 這些NitrospiraMAGs可能在參與有機氮轉化方面具有更大的功能潛力. 本研究中獲得的9個NitrospiraMAGs中注釋有“nitrilase/cyanide hydratase and apolipoprotein N-acyltransferase”或“carbon-nitrogen hydrolase family protein”, 它們屬于氮-碳裂解酶或腈水解酶超家族蛋白, 所有這些蛋白質似乎都參與了有機氮化合物的還原和氨的產生[58-59](圖3). 另外, 本文還注意到多個站位的NitrospiraMAGs含有將一些氨基化合物降解產生氨的酶, 包括煙酰胺酶、酰胺酶和胺氧化酶, 這意味著Nitrospira可能有更多未被揭示的與氨氧化微生物耦合生長的機制, 這些酶可能對潮灘濕地有機氮的去除發揮著關鍵的作用.

在本研究中,NitrospiraMAGs含有多種潛在的替代能源, 暗示著Nitrospira在潮灘濕地環境中有更廣泛的生存策略. 甲酸已被發現作為一些Nitrospiralineage Ⅰ、Ⅱ和Ⅵ菌株的電子供體和碳源[16,21,60].僅4個來自CM01、ZN02和QM站位的NitrospiraMAGs含有甲酸脫氫酶, 意味著這些Nitrospira可能有著利用甲酸鹽作為生長能源的潛力. 盡管NitrospiraMAGs被識別出含有多種有機物利用途徑,但大多數有機物被驗證并不能維持Nitrospira的持續生長[15,61-62]. 有研究表明,Nitrospira在混合營養中能更好地生長[12,60-61], 意味著其可能利用部分有機物作為碳源, 這些過程可能對潮灘濕地中有機物的去除有著重要作用. 10個NitrospiraMAGs含有周質的亞硫酸鹽脫氫酶(sulfite oxidoreductase,SOR)和4個lineage Ⅱ MAGs 含有硫化氫氧化還原酶(sulfide/quinone oxidoreductase, SQR) (圖3),這兩種酶可催化亞硫酸鹽(SO3–)或硫化氫 (H2S)的氧化, 并產生電子[63-65]; 盡管這兩種酶也存在于Nitrococcus和Nitrotoga中[66-67], 但仍缺乏相關的生理實驗證實NOB能夠利用這兩種酶催化相應硫化物作為生長能源. 另外,NitrospiraMAGs含有不同類型的氫氣氧化酶, 其中11個MAGs編碼著Group 3b鎳鐵硫還原氫化酶(group 3b [Ni-Fe] sulfur-reducing hydrogenase, HYD), 該酶能將氫氣氧化并產生NADPH, 同時能消耗NADPH將硫還原[55,66-68]. 3個Comammox MAGs和來自CM02站位的CM02s178 (圖3) 中含有假定的Group 4氫化酶 (putative group 4 hydrogenase, HYF). 但該酶的大亞基缺失兩對在鎳鐵類型氫化酶中均存在的鎳鐵中心的半胱氨酸配體[69], 這一特征在其他典型Nitrospira中也被揭示[16,70], 暗示著該酶發揮著未知的功能. 來自QM站位的QMb347和QMm174中含有Group 2a鎳鐵氫化酶(group 2a [Ni-Fe] hydrogenase, HUP), 該酶在Nitrospira moscoviensis菌株中被證實能夠催化氫氣氧化, 從而獲得能量用于碳的固定和生長[16].

2.3 Nitrospira在潮灘濕地環境的適應

許多研究表明, 潮灘濕地是重金屬和污染物積累的區域[71-73], 并且有著較大范圍的鹽度和底物濃度的變化[74]. 本研究獲得的Nitrospira基因組編碼著次氯酸鹽歧化酶、砷酸鹽還原酶和汞還原酶, 這或許能消除細胞對來自潮灘中的毒性[75-77]. 我們還發現, 這些基因組編碼著超過氧化物歧化酶和過氧化物酶，這些酶能抵抗高濃度的活性氧(reactive oxygen species, ROS)[78]. 大部分的Nitrospira還編碼著碳酸酐酶(carbonic anhydrase, CA), 可以將進入細胞的轉化為CO2[79], 為還原型的三羧酸循環提供碳源. 根據報道, 大部分培養的Nitrospira含有鞭毛[51], 而我們獲得的14個基因組中僅QM、ZN02和LH01站位中的3個編碼著較完整的鞭毛系統, 這意味著潮灘濕地中的Nitrospira可能有著獨立的生態位.

由于潮灘濕地有著較大的鹽度差, 故Nitrospira可能需要有特殊的代謝途徑來適應鹽度變化較大的潮灘環境. 有研究表明,Nitrospira編碼著調節滲透壓的重要物質轉運通道, 包括水通道 (aquaporin Z, AqpZ)、機械離子感應通道 (mechanosensitive ion channel, MSC)和甜菜堿ABC轉運蛋白等[80-82].值得注意的是, 本研究獲得的MAGs中, 僅隸屬于lineage Ⅳ和lineage Ⅲ的MAGs編碼有H+/Na+逆向轉運體和甘氨酸/甜菜堿ABC轉運體, 這些基因組主要來自鹽度更高(9‰ ～ 27‰)的QM和LH站位. 水通道蛋白僅在隸屬于lineage Ⅱ的3個MAGs中被發現(圖3), 這些基因組來自鹽度更低(<5‰)的CM02和ZN01站位. 有研究表明, 許多生活在低營養海洋環境中的細菌通常存在一些有機滲透物(甜菜堿、脯氨酸和甘露糖醇等)的ABC轉運體[83], 使得這些細菌能夠更好地適應高鹽度的海洋環境[84]. 這意味著在潮灘濕地中, 不同鹽度站位的Nitrospira成員有著不同的滲透壓調控機制, 高鹽度站位的Nitrospira可通過編碼有機滲透物的ATP轉運體來適應高鹽度的脅迫.

令人驚訝的是, 本研究獲得的這些NitrospiraMAGs的抗病毒系統有著較高的多樣性(圖3), 大部分MAGs編碼CRISPR (clustered regularly interspaced short palindromic repeats) 相關蛋白. 然而,由于一個完整的CRISPR防御系統至少含有一個核心的cas基因[85], 而本研究獲得的MAGs中僅QMb347和QMb135含有核心的cas基因, 故而暗示著其他MAGs可能不能利用CRISPR系統進行病毒的防御. 但有研究表明, 細菌的限制-修飾 (restriction-modification, R-M) 病毒免疫系統廣泛存在于原核生物中, 能攻擊進入細胞的外來DNA[86]. 本研究獲得的NitrospiraMAGs中注釋有Type Ⅰ -ⅢR-M系統的關鍵基因 (Restriction endonuclease和DNA methylase), 意味著該免疫系統可能在這些NitrospraMAGs中發揮著重要的病毒防御作用. 此外, 毒素抗毒素系統(toxin-antitoxin, TA) 和流產感染系統(abortive infection system, Abi)的相關基因也普遍存在于這些MAGs中, 這兩種免疫系統均采用自殺方式進行病毒的抵抗[87-88]. 另外, QMm125基因組中包含噬菌體排斥系統 (bacteriophage exclusion, BREX) 的大部分基因, 也可能發揮著相應的病毒防御功能[89]. 盡管噬菌體讓大量細菌感染致死并影響著微生物群落結構, 但同時也是驅動基因進化和生物遺傳多樣性的重要動力[90]. 特別地,NitrospiraMAGs中發現含有大量噬菌體組裝和侵染相關基因, 這表明噬菌體介導的水平基因轉移(horizontal gene transfer, HGT) 可能廣泛發生在Nitrospira群體中[91-92], 并推動Nitrospira基因組趨于多樣化和適應全球廣泛的生態環境.

本研究中從潮灘濕地恢復的NitrospiraMAGs分布在較寬的緯度范圍 (18.22°N ～ 40.78°N), 這些長期棲息在不同緯度位置的Nitrospira可能受到不同溫度的脅迫. 研究表明, 極端嗜熱蛋白需要更多的帶正電荷的殘基及通過犧牲極性氨基酸殘基來保持蛋白質的穩定性[93]. 因此, 帶電氨基酸和極性氨基酸的百分比差異(difference between the proportions of charged versus polar (non-charged) amino acids, CvP-bias)常被用來研究微生物的熱適應能力[94-95]. 我們計算了14個Nitrospira基因組的CvPbias值, 將每個站位基因組的CvP-bias平均值與緯度位置進行線性回歸. 結果顯示, CvP-bias平均值與緯度之間有一定負相關性, 但并不顯著 (y= – 5.708x+ 46.58,R2= 0.2038,p= 0.4454; 圖6(a)).最小和最大的平均基因組CvP-bias值分別對應最高緯度和最低緯度. 這意味著, 在有更高溫度的較低緯度位置,NitrospiraMAGs可能有更高的CvP-bias值, 即需要使用更多的帶電氨基酸以適應更高的溫度. 但這一結果并不顯著, 這可能與基因組和站位數量有關. 為進一步驗證緯度及溫度與Nitrospira基因組CvP-bias值關系的顯著性, 所有含緯度信息(1°N ～ 82°N)的99個Nitrospira基因組的CvP-bias值被計算. 為克服不同生境差異帶來的偏差, 取每10° 緯度間的基因組CvP-bias值的平均值, 且熱泉基因組被假定為赤道樣品(0°), 并與緯度位置進行線性回歸. 線性擬合結果顯示, 基因組的CvP-bias與緯度呈現顯著的負相關性 (y= – 67.99x+ 227.7,R2= 0.7739,p< 0.005; 圖6(b)).這表明, 生活在較低緯度和熱環境的Nitrospira在一定程度上擁有更多帶電氨基酸來維持蛋白質的熱穩定性, 而在高緯度位置的Nitrospira普遍有更低的CvP-bias值.

圖6 緯度與平均CvP-bias值的線性關系Fig. 6 Linear relationship between latitude and CvP-bias

3 結論

本研究獲得了不同緯度位置潮灘濕地的宏基因組樣品, 并分析了14個從中恢復的NitrospiraMAGs的系統發育、功能潛力和潮灘環境適應機制. 結果顯示, 這些NitrospiraMAGs有著豐富的物種多樣性和生態功能潛力. 本研究首次獲得了兩個隸屬于Nitrospiralineage Ⅲ的基因組, 暗示潮灘濕地含有未被揭示的類群. 代謝通路分析發現, 這些NitrospiraMAGs有多種可選擇能源利用途徑、壓力防御方式和病毒抵抗機制. Comammox 和典型的Nitrospira在尿素和氰酸酶的利用上存在明顯差異. 此外, 更多含氮有機化合物可能被這些Nitrospira作為硝化作用的能源, 這對潮灘濕地有機氮素的去除起著重要作用. 同時, 這些Nitrospira來自不同的緯度位置, 研究表明了它們在不同的站位應對鹽度、溫度和含氮化合物等展現出不同的適應策略. 這些研究結果加深了對Nitrospira在代謝潛力和環境適應機制上的認識, 為深入理解潮灘濕地的氮循環過程提供了重要的依據。