發酵改性黑米渣膳食纖維工藝及功能特性研究

關玉婷 張瑞 柴燃 田振揚 常世敏

摘要：為提升黑米渣的利用率，該研究以黑米渣為原料，探究發酵改性黑米渣膳食纖維（fermented modified black rice residue dietary fiber，FBD）的最優工藝，并對其持水力、持油力和體外吸附能力進行研究；采用粗糙脈孢菌對黑米渣發酵改性，以纖維素酶活力為評價指標，通過單因素試驗和響應面試驗對發酵改性工藝參數進行優化；通過測定發酵前后黑米渣膳食纖維的組成成分、吸附能力和微觀結構，研究發酵改性對FBD功能特性的影響。在發酵時間6 d、料液比1∶0.6 （g/mL）、發酵溫度29 ℃的條件下效果最優，纖維素酶活力為2.399 U；相比未發酵改性黑米渣膳食纖維（unfermented modified black rice residue dietary fiber，UFBD），FBD的可溶性膳食纖維含量提升了71.68%，纖維素含量降低了22.83%。膨脹力、持水力和持油力分別增加了1.9，2.3，2.6倍。膽固醇吸附能力、葡萄糖吸附能力和膽酸鈉吸附能力均極顯著提升。掃描電鏡、紅外光譜和X射線衍射分析表明，FBD具有疏松多孔的結構，結晶度降低。該研究確定了發酵改性黑米渣膳食纖維的最優工藝，得出了發酵改性對黑米渣膳食纖維功能特性的影響，為黑米渣的綜合開發利用奠定了理論基礎。

關鍵詞：黑米渣；膳食纖維；發酵；改性；響應面法；功能特性

中圖分類號：TS201.1? ? ? 文獻標志碼：A? ? ?文章編號：1000-9973（2023）05-0010-07

Abstract： In order to improve the utilization rate of black rice residues， in the study， with black rice residues as the raw materials， the optimal process of fermented modified black rice residue dietary fiber （FBD） is explored， and its water holding capacity， oil holding capacity and in vitro adsorption capacity are studied. Black rice residues are fermented and modified by Neurospora crassa. With cellulase activity as the evaluation index， the fermentation and modification process parameters are optimized by single factor test and response surface test. The effects of fermentation and modification on the functional characteristics of FBD are studied by determining the components， adsorption capacity and microstructure of dietary fiber from black rice residues before and after fermentation. Under the conditions of fermentation time of 6 d， solid-liquid ratio of 1∶0.6 （g/mL） and fermentation temperature of 29 ℃， the effect is the best and the cellulase activity is 2.399 U. Compared with unfermented modified black rice residue dietary fiber （UFBD）， the soluble dietary fiber content of FBD increases by 71.68%， and the cellulose content decreases by 22.83%. The expansion capacity， water holding capacity and oil holding capacity increase by 1.9， 2.3， 2.6 times respectively. The adsorption capacity of cholesterol， glucose and sodium cholate is significantly improved. Scanning electron microscopy， FT-IR spectra and X-ray diffraction analysis show that FBD has a loose porous structure and the crystallinity? decreases. In this? study， the optimal fermentation and modification process of black rice residue dietary fiber is determined， and the effects of fermentation and modification on the functional characteristics of black rice residue dietary fiber are found out， which has laid a theoretical foundation for the comprehensive development and utilization of black rice residues.

Key words： black rice residue; dietary fiber; fermentation; modification; response surface methodology; functional characteristics

黑米中含有豐富的花色苷，食品工業中提取花青素后的黑米渣通常被作為廢料處理，而黑米渣中仍含有膳食纖維、蛋白質和脂肪等物質，其中膳食纖維含量可達22.40%[1]，大部分為不溶性膳食纖維，不易與其他營養物質結合，口感較差，使其在食品工業中的應用受到極大限制。因此，可通過對黑米渣膳食纖維改性，改善其功能特性，提升黑米渣的利用價值。

發酵法改性膳食纖維是通過微生物發酵產生大量生物活性物質，如有機酸、纖維素酶等，使不溶性膳食纖維轉化為可溶性膳食纖維，改善其結構、功能特性。朱妞[2]利用綠色木霉發酵改性蘋果渣膳食纖維，有效地提升了可溶性膳食纖維的含量，并改善了膳食纖維的理化性質，提升了蘋果的附加值。徐靈芝等[3]比較了發酵及化學法改性雷竹筍渣的理化性質，發現發酵法改性后，持水力及吸附能力均優于化學法。張艷莉等[4]發現發酵改性后豆渣膳食纖維的持水力、持油力均得到明顯改善，且抗氧化能力顯著提升。

粗糙脈孢菌（Neurospora crassa）可在纖維素含量高的培養基中生長旺盛，產生較高活性的纖維素酶系[5]。目前關于粗糙脈孢菌產纖維素酶系的研究多集中在產酶條件的探究方面，而少見將其應用于膳食纖維改性方面的研究。同時，有關黑米渣膳食纖維改性及其化學成分、結構、功能性的研究目前未見文獻報道。因此，本研究采用粗糙脈孢菌發酵改性黑米渣膳食纖維，以纖維素酶活力為指標，探究最優發酵改性工藝，對發酵改性黑米渣膳食纖維的成分、物理性質及功能特性進行研究，為提升黑米渣的利用率奠定了理論基礎。

1 材料和方法

1.1 材料與儀器

黑米渣：來源于提取花色苷后的黑米渣；粗糙脈孢菌：上海保藏生物技術中心；葡萄糖、酒石酸鉀鈉、苯酚、無水亞硫酸鈉、一水檸檬酸、硫酸銨、磷酸二氫鉀：均為分析純，天津歐博凱化工有限公司；膽固醇標準品（純度99.5%）、膽酸鈉標準品（純度98%）：上海麥克林生化科技有限公司；熱穩定α-淀粉酶（10 000 U）、堿性蛋白酶（400 U）、淀粉葡萄糖苷酶（2 000 U）：上海瑞楚生物科技有限公司。

Hitachi SU-8220掃描電子顯微鏡 日本株式會社日立制作所；D/Max-2200 X-射線粉末衍射儀 日本理學株式會社；Avatar 370傅里葉變換紅外光譜儀 美國Nicolet公司；UV-6000紫外分光光度計 上海元析儀器有限公司；MJ-1608BSH-Ⅱ霉菌培養箱 上海新苗醫療器械制造有限公司；SW-CJ-2F雙人雙面凈化工作臺 蘇州凈化設備有限公司；電子分析天平 奧豪斯儀器（常州）有限公司；多功能粉碎機 永康市珀歐五金制品有限公司。

1.2 方法

1.2.1 發酵改性黑米渣膳食纖維制備工藝

將研磨后的黑米渣過40目篩，精確稱取30.00 g加入錐形瓶中，按料液比1∶0.5 （g/mL）加入蒸餾水，搖勻，121 ℃滅菌20 min，得到黑米渣固態培養基。

將長有孢子的粗糙脈孢菌斜面置于超凈工作臺中，倒入10 mL 無菌水，振蕩，使無菌水將孢子洗脫，使用4層無菌紗布過濾除去菌絲，獲得孢子懸液。取 1 mL 孢子懸液梯度稀釋后測得吸光值，使最終接種濃度為 OD600=0.08，將其接入黑米渣固態培養基中，27 ℃培養4 d。

發酵完成后，置于105 ℃鼓風干燥箱中過夜，粉碎，稱重。每克樣品加入25 mL石油醚進行脫脂，重復3次，105 ℃干燥過夜；依次經熱穩定α-淀粉酶、堿性蛋白酶和淀粉葡萄糖苷酶處理后，用4倍體積的95%乙醇沉淀過夜，5 000 r/min離心10 min，收集下層固體，冷凍干燥得到FBD。

1.2.2 單因素試驗

精確稱取30.00 g黑米粉加入錐形瓶中，按料液比1∶0.6 （g/mL）制備黑米渣固態培養基，搖勻，121 ℃滅菌20 min，接種1 mL濃度為OD600=0.08的粗糙脈孢菌孢子懸液，于27 ℃分別培養4，5，6，7，8 d，以纖維素酶活力為指標，探究發酵時間對產酶量的影響。

精確稱取30.00 g黑米粉加入錐形瓶中，制備不同料液比1∶0.4、1∶0.6、1∶0.8、1∶1、1∶1.2 （g/mL）的黑米渣固態培養基，搖勻，121 ℃滅菌20 min，接種1 mL濃度為OD600=0.08的粗糙脈孢菌孢子懸液，于27 ℃培養5 d，以纖維素酶活力為指標，探究不同料液比對產酶量的影響。

精確稱取30.00 g黑米粉加入錐形瓶中，按料液比1∶0.6 （g/mL）制備黑米渣固態培養基，搖勻，121 ℃滅菌20 min，接種1 mL濃度為OD600=0.08的粗糙脈孢菌孢子懸液，在不同溫度（26，27，28，29，30 ℃）下培養5 d，以纖維素酶活力為指標，探究不同發酵溫度對產酶量的影響。

1.2.3 響應面優化試驗

1.2.4 纖維素酶活力測定

稱取1 g固體發酵物，加入0.1 mol/L檸檬酸-檸檬酸鈉（pH 5.2）緩沖液10 mL，180 r/min振蕩30 min。4 ℃離心10 min，取上清液即為粗酶提取液。纖維素酶活力測定參考Ghose[6]的方法。

酶活力單位的定義：在45 ℃條件下，每分鐘催化底物水解釋放 1 μmol葡萄糖所需要的酶量，即為1個酶活力單位（U）。

1.2.5 理化特性分析

1.2.5.1 組成成分測定

蛋白質、脂肪、淀粉、灰分、總膳食纖維、可溶性膳食纖維、不溶性膳食纖維含量測定參考GB 5009.88－2014《食品安全國家標準 食品中膳食纖維的測定》，纖維素、半纖維素和木質素含量測定參考Lin等[7]的方法。

1.2.5.2 持水力測定

參考Jia等[8]的方法，在燒杯中加入1.00 g干燥的FBD和50 mL蒸餾水，25 ℃水浴1 h后，3 500 r/min離心15 min，取下層沉淀稱重。

持水力（g/g）=樣品干重（g）-樣品濕重（g）樣品干重（g）。

1.2.5.3 持油力測定

將1.00 g干燥的FBD置于10 mL植物油中，充分混勻后于37 ℃水浴1 h，3 000 r/min離心20 min。離心后，除去樣品上層油和剩余油[8]。

持油力（g/g）=樣品干重（g）-樣品濕重（g）樣品干重（g）。

1.2.5.4 膨脹力測定

向100 mL量筒中加入1.00 g干燥的FBD和50 mL蒸餾水，搖勻，置于室溫下靜置24 h。

膨脹力（mL/g）=溶脹后體積（mL）-初始體積（mL）樣品干重（g）。

1.2.5.5 對葡萄糖吸附能力測定

將1.00 g干燥的FBD和20 mL 50 mmol/L的葡萄糖溶液置于50 mL離心管中，37 ℃水浴2 h后，4 000 r/min離心20 min，采用DNS法（540 nm）測定上清液葡萄糖含量。

對葡萄糖的吸附能力（mmol/g）=

初始葡萄糖含量（mmol） -上清液中葡萄糖含量（mmol）樣品干重（g）。

1.2.5.6 對膽固醇吸附能力測定

將新鮮的蛋黃用9倍質量的蒸餾水制成乳液。取2.00 g干燥的FBD和50.00 g蛋黃乳液加入錐形瓶中混勻，分別將pH值調節至2.0（模擬胃內環境）和7.0（模擬小腸環境），置于37 ℃搖床中180 r/min振搖2 h后，4 000 r/min離心20 min，收集上清液，采用鄰苯二甲醛比色法（560 nm）測定上清液中膽固醇含量。

對膽固醇的吸附能力（mg/g）=

蛋黃中膽固醇含量（mg）-上清液中膽固醇含量（mg）樣品干重（g）。

1.2.5.7 對膽酸鈉吸附能力測定

向錐形瓶中加入0.50 g干燥的FBD和100 mL含有0.20 g膽酸鈉的0.15 mol/L NaCl溶液，混合均勻，置于37 ℃搖床中180 r/min振搖2 h后，4 000 r/min離心20 min，收集上清液，采用糠醛比色法（620 nm）測定膽酸鈉含量。

對膽酸鈉的吸附能力（mg/g）=初始膽酸鈉含量（mg） -上清液中膽酸鈉含量（mg）

樣品干重（g）。

1.2.6 結構表征

1.2.6.1 掃描電鏡分析

取10.00 mg干燥的FBD固定在樣品臺上，進行噴金處理，厚度為10～20 nm，工作電壓逐漸從5 kV升至10 kV，觀察不同倍數（×1 000，×2 000）下的樣品形貌。

1.2.6.2 傅里葉紅外光譜分析

取2.00 mg干燥的FBD和200.00 mg干溴化鉀粉末研磨混合，擠壓制成薄片，迅速放入儀器掃描，掃描范圍500～4 000 cm-1。

1.2.6.3 X射線衍射分析

將干燥的膳食纖維粉末置于涂抹了凡士林的玻璃板上，放入X射線衍射儀中，設定參數為2°/min掃描50°～60°。

1.3 數據處理

試驗數據表示為平均值±標準誤，數據處理采用SPSS 20.0，繪圖采用Origin 2021和GraphPad Prism 8。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

不同發酵時間對纖維素酶活力的影響見圖1中A。隨著發酵時間的增加，纖維素酶活力先增加后保持不變，在發酵6 d時，纖維素酶活力最大，達到1.91 U。隨著發酵時間的增加，培養基中的營養成分被持續消耗，在第6天時纖維素酶活力達到最大值，繼續增加發酵時間，培養基為粗糙脈孢菌提供的營養不足，菌種開始退化，造成纖維素酶活力不再增加。

不同料液比對纖維素酶活力的影響見圖1中B。纖維素酶活力隨著料液比的增加先升高后降低，當料液比為1∶0.6 （g/mL）時，纖維素酶活力達到最大，為1.9 U。過高的料液比使粗糙脈孢菌生長環境水分含量過高，不利于菌種生長及纖維素酶的產生。

不同發酵溫度對纖維素酶活力的影響見圖1中C。纖維素酶活力隨著發酵溫度的升高先升高后降低，在29 ℃時纖維素酶活力達到最大，為1.8 U。發酵溫度超過菌體最適生長溫度會加速菌體的退化，不利于纖維素酶產生，并且使已產生的纖維素酶活力降低。

2.2 響應面優化結果

在單因素試驗的基礎上，以纖維素酶活力為指標，采用Design-Expert 10軟件建立Box-Behnken法進行試驗設計，確定發酵改性黑米渣膳食纖維的最佳工藝，試驗設計及結果見表2。

對表2中試驗數據進行二次多項回歸擬合，獲得纖維素酶活力（Y）對發酵時間（A）、料液比（B）、發酵溫度（C）的多元回歸方程為Y=2.349+0.042A－0.112B+0.038C+6.99E－0.007AB+0.132AC－0.034BC－0.208A2－0.335B2－0.232C2。

該模型的方差分析結果見表3。

以纖維素酶活力為評價指標，對模型進行統計學檢驗并分析，由表3可知，該回歸模型的P<0.01，極顯著，失擬項的P=0.397>0.05，不顯著，回歸模型相關系數R2=0.969 7，RAdj2=0.930 7，擬合程度良好，可用于預測纖維素酶活力。單因素B極顯著（P<0.01），3個因素的F值分別為2.726，19.045，2.236，因此，影響大小排序為B（料液比）>A（發酵時間）>C（發酵溫度）。

由圖2可知，等高線接近圓形，表明發酵時間與料液比的交互作用不明顯，對纖維素酶活力的影響不顯著。由圖3可知，發酵時間與發酵溫度的交互作用對纖維素酶活力具有顯著影響，與表3回歸模型方差分析結果一致。根據軟件回歸模型計算預測當發酵時間（A）為6.97 d、料液比（B）為1∶0.57 （g/mL）、發酵溫度（C）為29.37 ℃時，纖維素酶活力為2.234 U。

2.3 發酵改性對黑米渣膳食纖維組成成分的影響

發酵改性對黑米渣膳食纖維組成成分的影響見表4。

由于FBD樣品是真空冷凍干燥的，因此未進行水分含量的測定。由表4可知，發酵后可溶性膳食纖維含量從17.3%顯著提升至29.7%，纖維素含量從9.2%降低到7.1%，半纖維素含量從45.6%降低到38.2%，木質素含量從7.3%降低到6.7%。這是由于粗糙脈孢菌產生了高活性纖維素酶系，黑米渣中的纖維素、半纖維素和木質素在發酵過程中被分解。

2.4 發酵改性對黑米渣膳食纖維水合特性的影響

發酵改性對黑米渣膳食纖維持水力、持油力及膨脹力的影響見圖5。

發酵改性會使膳食纖維的物理特性改變，如粒度和比表面積等[9]。膳食纖維的粒徑和比表面積與持水力、持油力及膨脹力密切相關[10]。膨脹力表示物質吸收和膨脹水分的能力[11]，由（2.33±0.01） mL/g上升至（4.33±0.12） mL/g。通過發酵改性，黑米渣膳食纖維的持水力極顯著提高（P<0.01）。UFBD的持水力為2.91 g/g，極顯著低于FBD（P<0.01），因為發酵改性破壞了半纖維素和纖維素之間的共價鍵，可溶性膳食纖維的含量增加[12]。持油力從1.30 g/g增加到3.42 g/g，FBD的持油力極顯著高于UFBD（P<0.01），可能是由于發酵改性增加了膳食纖維的網絡結構，從而提升了FBD的持油力。

2.5 發酵改性對黑米渣膳食纖維吸附能力的影響

在pH 2.0和pH 7.0時（模擬胃和腸的酸性環境），UFBD和FBD對膽固醇的吸附能力見圖6。

由圖6可知，FBD對膽固醇的吸附能力極顯著高于UFBD。這是由于發酵改性后黑米渣膳食纖維表面疏松多孔，增強了對膽固醇的吸附能力。同時，FBD在小腸中的吸附能力優于在胃中，這是由于FBD和膽固醇都帶有部分正電荷，相同的電荷在酸性條件下產生排斥力，導致其在胃中對膽固醇的吸附能力較差[13]。

膳食纖維對葡萄糖的吸附可以降低葡萄糖在體內的擴散速率，降低葡萄糖在體內的吸收，從而抑制餐后血糖的升高。由圖7可知，發酵改性極顯著地增強了FBD的葡萄糖吸附能力（P<0.01）。這可能是由于黑米渣膳食纖維的極性和非極性基團在發酵過程中暴露出來，增強了FBD與葡萄糖分子之間的結合[14]。結合掃描電鏡結果，FBD的比表面積和多孔結構都得到了提升。

膽汁酸調節腸道中膽固醇的合成，并在脂肪代謝中起重要作用。膳食纖維與膽汁酸的結合抑制了部分膽固醇的合成，同時降低了體內膽汁酸和膽固醇的濃度[15]。人體膽汁的大部分物質為膽酸鈉。研究比較FBD和UFBD與膽酸鈉的結合能力以評估其體外降膽固醇能力。由圖7可知，FBD對膽酸鈉的吸附能力極顯著高于UFBD（P<0.01），表明發酵增強了黑米渣膳食纖維對膽酸鈉的體外吸附能力。

2.6 發酵改性對黑米渣膳食纖維微觀結構的影響

由圖8可知，UFBD的表面結構緊湊、致密、不規則，而FBD的表面結構疏松，孔隙較多。發酵改性破壞了黑米渣膳食纖維的微觀結構，分解了部分纖維素、半纖維素和木質素，導致FBD形成多孔和疏松結構。FBD的結構有助于吸附能力的提升，因此FBD的理化性質和功能特性優于UFBD。

2.7 發酵改性對黑米渣膳食纖維紅外光譜的影響

FT-IR可以顯示黑米渣膳食纖維在發酵改性前后化學鍵和官能團的變化，大量研究表明，生物改性可導致膳食纖維結構和紅外光譜的變化[16-17]。發酵改性前后黑米渣膳食纖維紅外光譜圖見圖9。

由圖9可知，FBD和UFBD表現出相似的光譜分布和不同強度的吸收峰。FBD和UFBD分別在3 418.3 cm-1和3 389.2 cm-1處有強吸收峰，這是由于纖維素和半纖維素分子的O-H拉伸，導致氫鍵斷裂；在2 927.7 cm-1處的吸收峰是由多糖中的C－H拉伸振動引起的，為多糖的特征吸收峰[18]；在1 621.9 cm-1和1 654.8 cm-1處的吸收峰為CO的拉伸；在1 000～1 200 cm-1之間的吸收峰被認為是碳水化合物的特征區域，主要由木質素中C—O—C拉伸振動引起[19]。上述結果表明，發酵改性未改變黑米渣膳食纖維的基本結構，但分解了部分纖維素、半纖維素和木質素，與成分組成和掃描電鏡結果一致。

2.8 發酵改性對黑米渣膳食纖維晶體結構的影響

由圖10可知，發酵改性前后的衍射峰分別為20.87°和21.48°，表明晶體類型為纖維素Ⅰ，即結晶區和非結晶區共存[15]。FBD的衍射峰比UFBD的衍射峰更尖銳，但FBD的衍射峰低于UFBD的衍射峰，FBD結晶度降低，可能是由于發酵改性分解了纖維素、半纖維素等物質，降低了結晶度，即結晶區域減少和非結晶區域增加，與Li等[20]的研究結果一致。

3 結論

本研究采用粗糙脈孢菌對黑米渣膳食纖維進行發酵改性，探究了發酵改性的最佳工藝條件，并對改性前后的黑米渣膳食纖維結構及功能特性進行了比較。研究表明，當發酵時間為6 d，料液比為1∶0.6 （g/mL），發酵溫度為29 ℃時，纖維素酶活力最高，為2.399 U。FBD基本化學結構未被破壞，持水力、持油力和膨脹力均顯著提升，對膽固醇、葡萄糖和膽酸鈉的吸附能力得到顯著改善，結構疏松多孔，表面由平滑變為粗糙，為黑米渣的利用提供了理論支撐。但本研究的吸附作用均為體外進行，并未對FBD體內代謝機制進行研究，應作為后續研究重點，以滿足相關產品的開發生產需求。

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