交變磁場對植物乳桿菌固態(tài)發(fā)酵花粉蛋白質的影響

董彩文 王明雷 何夢宇 蔡祎珂 胡夢瀟 魏濤

摘要：采用弱交變磁場輔助優(yōu)化植物乳桿菌固態(tài)發(fā)酵油菜蜂花粉，通過單因素試驗分別考察了發(fā)酵溫度、植物乳桿菌菌液濃度、磁場處理時間、磁場強度對蜂花粉固態(tài)發(fā)酵的影響。響應面優(yōu)化結果表明，當發(fā)酵溫度為35 ℃、菌液OD值為1.0、磁場處理時間為4.28 h、磁場強度為3.3 mT時，此條件下發(fā)酵后花粉提取液中的蛋白含量為9.534 mg/g，較空白組提高了44.1%，且與優(yōu)化條件下得到的理論值相差較小，說明優(yōu)化結果可靠。

關鍵詞：交變磁場；固態(tài)發(fā)酵；植物乳桿菌；響應面設計

中圖分類號：TS202.3? ? ? 文獻標志碼：A? ? ?文章編號：1000-9973（2023）05-0189-05

Abstract： Using weak alternating magnetic field as an auxiliary way to optimize the solid-state fermentation of rape bee pollen by Lactobacillus plantarum， the effects of fermentation temperature， solution concentration of Lactobacillus plantarum， magnetic field treatment time and magnetic field intensity on the solid-state fermentation of bee pollen are investigated by single factor test. The results of the response surface optimization show that when the fermentation temperature is 35 ℃， the OD value of the bacterium solution is 1.0， the magnetic field treatment time is 4.28 h， and the magnetic field intensity is 3.3 mT， the protein content in the pollen extract after fermentation under such conditions is 9.534 mg/g， which is 44.1% higher than that in the blank group. The difference between the theoretical value and practical value is small， indicating that the optimized results are reliable.

Key words： alternating magnetic field; solid-state fermentation; Lactobacillus plantarum; respone surface design

收稿日期：2022-11-29

基金項目：2021年度中原科技創(chuàng)新領軍人才項目（224200510017）；鄭州輕工業(yè)大學食品科學與工程特色骨干學科群高水平成果培育項目；鄭州輕工業(yè)大學校第十一批校級大學生創(chuàng)新實驗項目

作者簡介：董彩文（1970-），男，教授，博士，研究方向：食品生物技術。

*通信作者：魏濤（1980-），男，教授，博士，研究方向：食品酶技術開發(fā)與應用。

蜂花粉主要是工蜂在采集花蜜和花粉時，自身攜帶的正電荷與花朵的負電荷產(chǎn)生靜電場，從而能吸附花粉粒，再由蜜蜂唾液分泌物黏結而成的花粉團[1-2]。蜂花粉營養(yǎng)價值高，含有人類必需氨基酸及很多活性成分，如蛋白質、多糖、不飽和脂肪酸、黃酮等，且具有較強的抗氧化活性[3-5]。蜂花粉不僅能為人們提供營養(yǎng)，而且具有預防腫瘤、預防前列腺炎、降血糖、血脂等特性[6-7]。

近年來，以蜂花粉作為食品添加劑的產(chǎn)品層出不窮，如蜂花粉面包、蜂花粉飲料、蜂花粉酸奶、蜂花粉啤酒等。將蜂花粉添加到食品中，既能提高產(chǎn)品的營養(yǎng)價值，又能起到調節(jié)產(chǎn)品風味的作用[8]。但是，蜂花粉的細胞壁堅硬，直接添加在食品中既影響蜂花粉內容物的釋放，又會影響人體對營養(yǎng)成分的吸收[9]。因此，對花粉進行破壁處理能夠提高花粉作為食品添加劑的效率。目前常用的蜂花粉生物破壁的方法是微生物發(fā)酵破壁，微生物發(fā)酵是處理蜂花粉的核心環(huán)節(jié)，發(fā)酵的條件、方式都會直接影響蜂花粉發(fā)酵前后營養(yǎng)物質的變化[10]。目前大多數(shù)蜂花粉發(fā)酵工藝的探究中以蜂花粉的液態(tài)發(fā)酵為主，對蜂花粉進行固態(tài)發(fā)酵的研究鮮有報道。

磁場輔助微生物發(fā)酵技術成為人們日益關注的研究方向，研究表明弱交變磁場應用于生物發(fā)酵過程中能促進生物量及其有益代謝產(chǎn)物的積累[11-13]。低頻磁場輔助釀酒酵母發(fā)酵可使乙醇產(chǎn)量提高17%[14]，也可促進乳酸菌發(fā)酵，使乳酸鏈球菌產(chǎn)量增加[15]。研究發(fā)現(xiàn)弱磁場對微生物酶的作用是確切的，其中弱磁場能夠影響微生物細胞酶活性和離體酶活性進而提高微生物的發(fā)酵效率[16]，是一種極具開發(fā)潛力的輔助發(fā)酵方式。目前文獻中尚未發(fā)現(xiàn)利用弱交變磁場輔助蜂花粉進行固態(tài)發(fā)酵。

因此，本研究通過弱交變磁場輔助植物乳桿菌用于蜂花粉的固態(tài)發(fā)酵，經(jīng)過單因素考察不同因素對發(fā)酵前后花粉提取液中蛋白含量的影響，然后選擇響應面優(yōu)化工藝條件，并對優(yōu)化結果進行了驗證。該試驗通過研究發(fā)酵前后蜂花粉中有益成分的變化，旨在提高花粉作為添加劑的效率，為今后生產(chǎn)蜂花粉產(chǎn)品提供部分理論基礎。

1 材料和方法

1.1 材料

油菜蜂花粉：購于河南省長葛市；植物乳桿菌：實驗室保藏。

1.2 試劑

磷酸（分析純）：天津市永大化工試劑制造廠；考馬斯亮藍試劑G-250（分析純）：鄭州派尼化學試劑廠；牛血清蛋白（生物試劑）：北京索萊寶科技有限公司。

1.3 主要儀器與設備

磁場冷凍冷藏箱 英都斯特（無錫）感應科技有限公司；SW-CJ-2FD型潔凈工作臺 蘇凈集團蘇州安泰空氣技術有限公司；LX-C35L型立式自動電熱壓力蒸汽滅菌器 合肥華泰醫(yī)療設備有限公司；ZHP-250型立式恒溫振蕩培養(yǎng)箱 上海鴻都電子科技有限公司。

1.4 方法

1.4.1 培養(yǎng)基的制備

MRS液態(tài)培養(yǎng)基：按照MRS液態(tài)培養(yǎng)基配方，配好后于121 ℃滅菌20 min，冷卻備用。

1.4.2 菌種的培養(yǎng)

在超凈工作臺上將凍存在甘油中的植物乳桿菌接種于10 mL MRS液態(tài)培養(yǎng)基中，35 ℃恒溫搖床培養(yǎng)12 h。吸取菌懸濁液0.1 mL，將其稀釋后涂布于MRS平板上，置于35 ℃的生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h。然后挑取單菌落到100 mL MRS液體培養(yǎng)基中，35 ℃條件下?lián)u床培養(yǎng)12 h。

1.4.3 蛋白含量的測定

1.4.3.1 蛋白標準曲線的繪制[17]

參照聶昌宏等的方法測粗蛋白，稍作修改。采用考馬斯亮藍G-250比色法，標準品采用牛血清蛋白，制成0.1 mg/mL的標準蛋白質溶液。

1.4.3.2 花粉提取液中蛋白的制備及測定

取1 g發(fā)酵后的花粉，加入10 mL蒸餾水，置于恒溫水浴振蕩器中，35 ℃水浴振蕩1 h。取出樣品溶液8 000 r離心10 min，取0.1 mL上清液，參照1.4.3.1的操作方法測其吸光度，蛋白含量計算見下式：

ρ=m×vm1×v1。

式中：ρ為蛋白含量，mg/g；m為根據(jù)標準曲線求得的蛋白質量，mg；v為提取液的總體積，mL；m1為樣品鮮重，g；v1為測定時取用提取液的體積，mL。

1.4.3.3 發(fā)酵溫度對花粉蛋白含量的影響

在超凈工作臺上取滅菌花粉分別放入12個錐形瓶中，每瓶20 g，然后依次加入菌液2.5 mL，無菌水5 mL，攪勻，分別在31，33，35，37，39 ℃條件下培養(yǎng)8 d。每個條件處理2瓶，作為平行試驗；空白組用MRS液體培養(yǎng)基代替菌懸濁液，其他條件與試驗組一致。按照1.4.3.2的方法進行蛋白含量的測定。

1.4.4 菌液濃度對花粉蛋白含量的影響

在超凈工作臺上取滅菌花粉分別放入12個錐形瓶中，每瓶20 g，分別加入OD值為0.7，1.0，1.3，1.6，1.9的菌液2.5 mL，無菌水5 mL，在35 ℃條件下培養(yǎng)8 d。每個條件處理2瓶，作為平行試驗；空白組處理同上。按照1.4.3.2的方法分別進行蛋白含量的測定。

1.4.5 磁場處理時間對花粉蛋白含量的影響

在超凈工作臺上取滅菌花粉分別放入12個錐形瓶中，每瓶20 g，依次加入OD值為1.0的菌液2.5 mL，加入葡萄糖含量為30%，無菌水5 mL，攪勻。接種完成后，分別在磁場強度為4 mT下處理1，2，3，4，5 h。在35.0 ℃條件下繼續(xù)培養(yǎng)至8 d。每個條件處理2瓶，作為平行試驗；空白組處理同上。按照1.4.3.2的方法進行蛋白含量的測定。

1.4.6 磁場強度對花粉提取液蛋白含量的影響

在超凈工作臺上取滅菌花粉分別放入12個錐形瓶中，每瓶20 g，依次加入OD值為1.0的菌液2.5 mL，加入葡萄糖含量為30%，無菌水5 mL，攪勻。接種完成后分別在1，2，3，4，5 mT的磁場強度下處理4 h。在35.0 ℃條件下繼續(xù)培養(yǎng)至8 d。每個條件處理2瓶，作為平行試驗；空白組處理同上。按照1.4.3.2的方法進行蛋白含量的測定。

1.4.7 響應面法試驗設計

在單因素試驗的基礎上，根據(jù)響應面試驗設計原理，選取3個對花粉蛋白生成影響較大的因素，選擇 Box-Behnken進行三因素三水平試驗設計，見表1。

1.5 數(shù)據(jù)分析

單因素試驗結果用Origin 2018進行分析，利用Design-Expert 10軟件對工藝參數(shù)的組合進行優(yōu)化，確定油菜蜂花粉固態(tài)發(fā)酵的最優(yōu)條件。利用響應面分析法（RSM）得到回歸模型和工藝參數(shù)。試驗數(shù)據(jù)均采用平行試驗的平均值，使用SPSS軟件對所得數(shù)據(jù)進行組與組之間的方差分析，在置信區(qū)間（95%）內分析各組之間是否顯著，用相同或不同字母表示不顯著或顯著。

2 結果與分析

2.1 發(fā)酵溫度對花粉提取液中蛋白含量的影響

發(fā)酵溫度是發(fā)酵過程中植物乳桿菌參與反應的重要因素之一，發(fā)酵溫度對植物乳桿菌發(fā)酵過程中產(chǎn)生的黃酮有一定影響。發(fā)酵溫度與花粉提取液蛋白含量的關系見圖1。

由圖1可知，當發(fā)酵溫度從31 ℃升至35 ℃時，蛋白含量明顯上升。當發(fā)酵溫度從35 ℃升至39 ℃時，蛋白含量顯著下降。原因是發(fā)酵溫度影響了菌種的活性，進而影響發(fā)酵的質量，也可能是一些熱敏蛋白發(fā)生變性導致蛋白含量降低。當發(fā)酵溫度為35 ℃時花粉提取液中的蛋白含量最高，且與其他4組試驗在95%的置信區(qū)間內有顯著性差異。綜上所述，初步確定35 ℃為合適的發(fā)酵溫度。

2.2 菌液濃度對花粉提取液中蛋白含量的影響

發(fā)酵液中植物乳酸菌的濃度會影響花粉發(fā)酵的結果，當菌液濃度過低時，花粉發(fā)酵周期長，花粉營養(yǎng)物質釋放不完全。當菌液濃度過高時，又會使菌體自身過多地消耗花粉的營養(yǎng)物質，造成發(fā)酵后一些營養(yǎng)指標偏低。菌液濃度與花粉提取液蛋白含量的關系見圖2。

由圖2可知，當菌液的OD值為0.7～1.0時，蛋白含量隨著菌液濃度的升高呈上升趨勢，菌液的OD值為1.0～1.6時，蛋白含量下降趨勢明顯，但菌液的OD值在1.6～1.9時蛋白含量又上升，原因可能是菌液過濃，菌體自身溶解釋放了部分蛋白。當菌液的OD值為1.0時花粉提取液中的蛋白含量最高，且與其他組在95%的置信區(qū)間內均有顯著性差異。因此，初步確定最佳的菌液OD值為1.0。

2.3 磁場處理時間對花粉提取液中蛋白含量的影響

交變磁場在一定條件下對微生物生長起到促進作用，但如果處理時間過長，可能有抑制或殺滅作用。磁場處理時間與花粉提取液蛋白含量的關系見圖3。

由圖3可知，隨著處理時間的延長，蛋白含量呈上升趨勢，在4 h之后先上升后下降，下降不顯著；當磁場處理時間為4 h時花粉提取液中的蛋白含量達到最高，并且與其他4組試驗在95%的置信區(qū)間內有顯著性差異。隨著時間的延長，蛋白含量降低，磁場處理時間延長與蛋白含量下降之間的具體作用機理尚不清楚。比較廣泛研究的理論是長時間的磁場處理改變了細胞膜、某些分子（生物大分子等）和自由基的理化性質，對細胞造成損害[18-19]。還有一種原因可能是發(fā)酵環(huán)境中的極性大分子在交變磁場長時間的作用下發(fā)生機械旋轉，內能增加，致使發(fā)酵溫度上升（與微波加熱原理相似），熱效應導致微生物活性降低進而影響發(fā)酵質量。綜上所述，初步確定合適的磁場處理時間為4 h。

2.4 磁場強度對花粉提取液中蛋白含量的影響

磁場強度的強弱對微生物活性的影響具有兩面性，適當?shù)拇艌鰪姸韧ㄟ^影響酶的活性進而可以促進微生物的生長和代謝產(chǎn)物的生成；反之則不利于微生物的生長繁殖。磁場強度與花粉提取液蛋白含量的關系見圖4。

由圖4可知，蛋白含量隨著磁場強度的增強呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，當磁場強度為3 mT時花粉提取液中的蛋白含量最高，且與其他試驗組在95%的置信區(qū)間內差異顯著。3 mT之后蛋白含量隨著磁場強度的增強而減小。作用機理尚不清楚，基于細胞膜信號轉導的磁場作用機制，磁場強度的大小能夠通過調整細胞內鈣離子濃度，導致信號轉導受到干擾[20]，通過影響微生物細胞的活性，進而影響微生物發(fā)酵蜂花粉的質量。綜合考慮，初步確定合適的交變磁場處理強度為3 mT。

2.5 響應面結果分析

2.5.1 響應面試驗結果分析

在單因素試驗的基礎上，通過Design-Expert 8.0.6的Box-Behnken設計原理，對蜂花粉固態(tài)發(fā)酵的條件進行了三因素三水平試驗，由響應面分析得到17組試驗條件，每組做2次平行試驗，結果取平均值，試驗結果見表2。

根據(jù)Design-Expert 8.0.6軟件對表2中數(shù)據(jù)進行回歸擬合，得到蛋白含量（Y）對自變量菌液OD值（A）、磁場強度（B）和磁場處理時間（C）的多元回歸方程：Y=9.24+0.024A+0.54B+0.63C+5.000E－003AB+0.058AC+0.080BC－0.19A2－0.47B2－0.61C2。

由表3可知，模型的F值為415.46，P值小于0.000 1，說明此模型的回歸方程極顯著。失擬項的P=0.085>0.05，說明失擬項不顯著，該模型的模擬性較好，模型選擇合理。模型中變量B、C、A2、B2和C2對蛋白含量的影響均極顯著（P<0.000 1），說明試驗影響因素與響應值不是一般的線性關系，一次項、二次項及B和C的交互作用對響應值均有很大的影響。模型中的復相關系數(shù)R2=0.998 1，修正復相關系數(shù)RAdj2=0.995 7，預測復相關系數(shù)RPred2=0.976 1，修正復相關系數(shù)與預測復相關系數(shù)差值小于0.2，說明二者有很好的相符度。信噪比為64.34＞4，說明本模型的試驗結果可靠。由表3可知，對花粉提取液中蛋白含量的影響因素主次順序為：C（磁場處理時間）＞B（磁場強度）＞A（菌液OD值）。綜上所述，回歸方程為蛋白含量提供了一個合適的回歸模型。

2.5.2 驗證試驗

利用Design-Expert軟件求解該模型，得出最佳菌液的OD值為1.0，磁場強度為3.31 mT，磁場處理時間為4.28 h。為驗證結果的可靠性，采用上述優(yōu)化參數(shù)再次進行蜂花粉固態(tài)發(fā)酵，為滿足實際操作，將菌液OD值調整為1.0，磁場強度調整為3.3 mT，磁場處理時間調整為4.28 h。在此發(fā)酵條件下花粉提取液蛋白含量理論值為9.583 mg/g。對此發(fā)酵工藝條件重復2次進行驗證試驗，最終花粉提取液蛋白含量為9.534 mg/g，實際測定值與預測值相差較小，說明響應面優(yōu)化得到的參數(shù)可靠。

2.5.3 發(fā)酵前后蛋白含量的變化

空白組用MRS液體培養(yǎng)基代替菌懸濁液，其他條件與試驗組一致。得到空白組花粉提取液中蛋白含量的平均值為6.614 mg/g，響應面優(yōu)化條件下花粉提取液中蛋白含量的實際值為9.534 mg/g，較空白組提升了44.1%，這也說明了磁場輔助發(fā)酵是可行的，是一種具有開發(fā)潛力的發(fā)酵方式。

3 結論

本試驗采用弱交變磁場輔助優(yōu)化蜂花粉固態(tài)發(fā)酵，有利于細胞內蛋白物質溶出，提高了花粉提取液中蛋白的含量。通過單因素試驗和響應面分析法，最終確定最優(yōu)條件組合為菌液發(fā)酵溫度35 ℃、菌液OD值1.0、磁場處理時間4.28 h、磁場強度3.3 mT。在此條件下，發(fā)酵后花粉提取液中的蛋白含量9.534 mg/g較空白組的6.614 mg/g提高了44.1%，通過研究可知，交變磁場在輔助油菜蜂花粉固態(tài)發(fā)酵方面有一定的優(yōu)勢，該結果為交變磁場輔助微生物發(fā)酵提供了一定的參考，為蜂花粉固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)品提供了一定的理論基礎。

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