反相高效液相色譜法測(cè)定頭孢地尼及制劑中的聚合物類(lèi)雜質(zhì)

楊倩 張琳 曹曉云 唐素芳

摘要：目的 建立反相高效液相色譜法測(cè)定頭孢地尼及制劑中的聚合物雜質(zhì)。方法 以CAPCELL PAK C18 MGⅡ?yàn)樯V柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），0.25%四甲基氫氧化銨溶液（pH 5.5）[每1000mL中加入0.1 mol/L乙二胺四乙酸二鈉溶液0.4 mL]-甲醇-乙腈為流動(dòng)相系統(tǒng)，梯度洗脫，建立了頭孢地尼聚合物類(lèi)雜質(zhì)的分析方法并進(jìn)行了方法學(xué)驗(yàn)證。采用二維液質(zhì)聯(lián)用法對(duì)檢出的聚合物類(lèi)雜質(zhì)進(jìn)行定性分析。結(jié)果 在該色譜條件下頭孢地尼及已知雜質(zhì)均與頭孢地尼聚合物間分離良好，頭孢地尼檢測(cè)濃度的線性范圍為0.30～30.1 μg/mL（r=1.0000），方法的檢測(cè)限與定量限分別為1.5 ng和4.5 ng。所建立的方法能夠檢出頭孢地尼二聚體，頭孢地尼二聚體的多個(gè)同分異構(gòu)體及頭孢地尼三聚體。結(jié)論 本方法專(zhuān)屬性好，靈敏度高，耐用性好，可用于頭孢地尼及其制劑中聚合物雜質(zhì)的控制。

關(guān)鍵詞：頭孢地尼；聚合物；雜質(zhì)；反相高效液相色譜法；二維液質(zhì)聯(lián)用

中圖分類(lèi)號(hào)：R978.1 ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

Determination of polymer impurities in cefdinir and preparations by RP-HPLC

Yang Qian， Zhang Lin， Cao Xiao-yun， and Tang Su-fang

（Tianjin Institute for Drug Control， Tianjin 300070）

Abstract Objective To establish a reverse high-performance liquid chromatography （HPLC） for the separation and determination of polymers in cefdinir and its preparations. Methods The method was performed by using CAPCELL PAK C18 MG Ⅱ column （250 mm×4.6 mm，5 μm）. The mobile phase was 0.25% tetramethyl ammonium hydroxide （pH5.5） containing 0.1 mol/L disodium EDTA solution （0.4 mL per 1000 mL）-acetonitrile-methanol. The gradient elution was used. The method was validated， and the polymer impurities were analyzed by the two dimensional liquid chromatography-mass spectrometry method. Results Cefdinir， the identified impurities and polymers were separated effectively. The linear range of cefdinir was 0.30～30.1 μg/mL （r=1.0000）. The limit of detection was 1.5 ng and the limit of quantitation was 4.5 ng. Cefdinir dimer， isomers of cefdinir dimer， and cefdinir trimer can be detected by the new method. Conclusion The established RP-HPLC method with good robustness is specific and sensitive. Therefore， it can be used for the control of polymer impurities in the pharmaceutical preparations.

Key words Cefdinir; Polymers; Impurities; RP-HPLC; 2D-LC-MS

頭孢地尼為半合成第三代β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素，由日本藤澤藥品工業(yè)公司研發(fā)，1991年首次在日本上市，2001年國(guó)產(chǎn)仿制藥獲準(zhǔn)上市。頭孢地尼通過(guò)抑制細(xì)菌細(xì)胞壁的合成產(chǎn)生抗菌作用，對(duì)革蘭陽(yáng)性菌和陰性菌均有抗菌活性，在臨床上廣泛應(yīng)用于內(nèi)外科、皮膚科和婦產(chǎn)科等敏感菌導(dǎo)致的感染。不良反應(yīng)輕微，以消化道反應(yīng)和過(guò)敏反應(yīng)最為常見(jiàn)。而過(guò)敏反應(yīng)正是β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素最受關(guān)注的一類(lèi)不良反應(yīng)，引發(fā)過(guò)敏反應(yīng)的過(guò)敏原是β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素中的聚合物雜質(zhì)[1-3]。該類(lèi)雜質(zhì)在藥品的生產(chǎn)、貯藏、運(yùn)輸過(guò)程中均有可能產(chǎn)生，因此《中國(guó)藥典》從2000年版開(kāi)始對(duì)其進(jìn)行控制。

頭孢地尼分子結(jié)構(gòu)7位側(cè)鏈存在氨基活性基團(tuán)，理論上可以發(fā)生L型和N型聚合反應(yīng)生成聚合物類(lèi)雜質(zhì)。《中國(guó)藥典》2020年版、USP2021、《日本藥局方》XVⅡ均收載了頭孢地尼，但標(biāo)準(zhǔn)中均未設(shè)定聚合物類(lèi)雜質(zhì)檢查項(xiàng)。有文獻(xiàn)報(bào)道采用葡聚糖凝膠G10法和高效凝膠色譜法測(cè)定頭孢地尼中的高分子雜質(zhì)[4-5]，這也是目前對(duì)β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素中聚合物類(lèi)雜質(zhì)進(jìn)行控制的主要方法。但上述方法對(duì)聚合物的分離分析能力有限，專(zhuān)屬性差，一般無(wú)法滿足準(zhǔn)確控制該類(lèi)雜質(zhì)的要求。研究表明，通過(guò)色譜條件的優(yōu)化，很多β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素中的聚合物類(lèi)雜質(zhì)可以在反相高效液相色譜系統(tǒng)中被測(cè)定[6-8]。本研究參考文獻(xiàn)[9]建立了頭孢地尼原料和制劑中聚合物雜質(zhì)的分析方法并利用二維液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)對(duì)檢出的聚合物類(lèi)雜質(zhì)進(jìn)行了定性研究。

1 儀器與試藥

LC-20AD高效液相色譜儀（日本島津公司），1260高效液相色譜儀（美國(guó)Agilent公司），Waters ACQUITY UPLCTM2D色譜儀及Xevo G2-S QTof質(zhì)譜系統(tǒng)（美國(guó)Waters公司），Mettler Toledo XS 205型電子分析天平（瑞士Mettler公司）。

頭孢地尼（3家生產(chǎn)企業(yè)，7批樣品），頭孢地尼膠囊（6家生產(chǎn)企業(yè)，17批樣品），頭孢地尼分散片（7家生產(chǎn)企業(yè)，21批樣品），頭孢地尼片（1家生產(chǎn)企業(yè)，3批樣品），頭孢地尼對(duì)照品（批號(hào)130502-201904，純度98.1%）購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院，頭孢地尼已知雜質(zhì)對(duì)照品A～U由廠家提供；甲酸（LCMS級(jí)）購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；乙腈、甲醇（色譜純）購(gòu)自美國(guó)Merck公司；其他試劑（分析純）均購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑公司；水為屈臣氏純凈水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

2.1.1 ? ?反相液相色譜條件（一維色譜）

色譜柱：CAPCELL PAK C18 MGⅡ（250 mm×4.6 mm，5 μm）。流動(dòng)相A：0.25%四甲基氫氧化銨溶液（用磷酸調(diào)節(jié)pH值至5.5），每1000 mL中加入0.1 mol/L乙二胺四乙酸二鈉溶液0.4 mL；流動(dòng)相B：0.25%四甲基氫氧化銨溶液（用磷酸調(diào)節(jié)pH值至5.5）-乙腈-甲醇（500：300：200），每1000 mL中加入0.1 mol/L乙二胺四乙酸二鈉溶液0.4 mL，線性梯度洗脫。洗脫梯度：0～10 min（20%～50% B）→10～1 5 min（50%～75% B）→15～20 min（75% B）→20～21 min（75%～20% B）→21～30 min（20% B）。流速：1.1 mL/min；柱溫：40℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：254 nm；進(jìn)樣量：20 μL。

2.1.2 ? ?二維液相色譜條件

色譜柱：Waters HSS T3 C18（100 mm×2.1 mm，1.8 μm）。流動(dòng)相A ：0.1%甲酸溶液；流動(dòng)相B：乙腈；在線除鹽后，線性梯度洗脫：0～5 min（2%～95% B）。柱溫：35℃；流速：0.4 ?mL/min。

2.1.3 ? ?質(zhì)譜條件

離子源為ESI源，正離子模式，掃描范圍：m/z 50～1500；離子源溫度：110℃；毛細(xì)管電壓 3.0 kV；霧化器溫度：450℃；霧化器流速800 L/h。

2.2 溶液的配制

溶劑：0.l mol/L磷酸鹽緩沖液[0.l mol/L磷酸氫二鈉溶液-0.l mol/L磷酸二氫鉀溶液（2：1）]。

系統(tǒng)適用性溶液：取頭孢地尼原料（批號(hào)Ap006-2011-009）約500 mg，加入三氯甲烷8 mL，三乙胺2 mL，振搖5 min，密封，室溫避光放置48 h。旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去除三氯甲烷和三乙胺，制成固體粉末作為堿破壞樣品[9]。稱(chēng)取上述堿破壞樣品約15 mg，置于10 mL量瓶中，加溶劑2 mL溶解，再用流動(dòng)相A（一維）稀釋至刻度，搖勻，即得。

供試品溶液：取頭孢地尼約37.5 mg（制劑：取重量差異項(xiàng)下細(xì)粉或裝量差異項(xiàng)下內(nèi)容物適量，約相當(dāng)于頭孢地尼37.5 mg），精密稱(chēng)定，置25 mL量瓶中，加溶劑4 mL溶解后，用流動(dòng)相A（一維）稀釋至刻度，搖勻，作為供試品溶液。制劑過(guò)濾后，取續(xù)濾液作為供試品溶液。

對(duì)照品溶液：取頭孢地尼對(duì)照品約37.5 mg，精密稱(chēng)定，置25 mL量瓶中，加溶劑4 mL溶解后，用流動(dòng)相A（一維）稀釋至刻度，搖勻。精密量取該溶液1 mL置100 mL量瓶中，用流動(dòng)相A（一維）稀釋至刻度，搖勻，作為對(duì)照品溶液。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 專(zhuān)屬性試驗(yàn)試驗(yàn)

考察了系統(tǒng)適用性試驗(yàn)溶液、頭孢地尼已知雜質(zhì)對(duì)照品混合溶液及頭孢地尼原料（批號(hào)Ap006-2011-009）在酸、堿、氧化、高溫和光照條件下產(chǎn)生雜質(zhì)的分離情況。結(jié)果表明，在新建立的色譜系統(tǒng)中，已知雜質(zhì)、破壞所產(chǎn)生的降解雜質(zhì)均能與頭孢地尼實(shí)現(xiàn)良好分離。除系統(tǒng)適用性試驗(yàn)溶液中的相對(duì)保留時(shí)間為2.1特定雜質(zhì)外，已知雜質(zhì)和主要降解雜質(zhì)的相對(duì)保留時(shí)間均小于2.0，該方法專(zhuān)屬性良好，見(jiàn)圖1～3。

2.3.2 線性范圍

取頭孢地尼對(duì)照品按逐步稀釋法制成不同濃度的對(duì)照品溶液進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果表明頭孢地尼在0.30～30.1 μg/mL范圍內(nèi)，濃度與峰面積呈線性相關(guān)y=37014x-612.84（r=1.0000）。對(duì)照品溶液濃度在供試品溶液濃度的0.02%到2%范圍內(nèi)線性良好。

2.3.3 檢測(cè)限和定量限

以頭孢地尼對(duì)照品溶液（約15 μg/mL）標(biāo)化堿破壞樣品中頭孢地尼二聚體的含量，頭孢地尼二聚體的檢測(cè)限（按S/N=3計(jì)）為1.5 ng，相當(dāng)于0.005%；定量限（按S/N=10計(jì)）為4.5 ng，相當(dāng)于0.015%。

2.3.4 溶液穩(wěn)定性試驗(yàn)

取供試品溶液（頭孢地尼分散片，批號(hào)10201103）分別于4℃放置0、1、2、4、8和12 h后進(jìn)樣分析，該供試品溶液中檢出雜質(zhì)個(gè)數(shù)相同，聚合物類(lèi)雜質(zhì)均小于定量限，聚合物類(lèi)雜質(zhì)低溫放置12 h未見(jiàn)明顯增多。

2.3.5 耐用性試驗(yàn)

試驗(yàn)考察了不同儀器、不同色譜柱在不同流速下對(duì)聚合物類(lèi)雜質(zhì)的檢出能力，結(jié)果表明色譜條件的變化對(duì)測(cè)定結(jié)果影響不大，見(jiàn)表1。

2.4 聚合物類(lèi)雜質(zhì)定性分析

取系統(tǒng)適用性溶液注入二維液質(zhì)聯(lián)用儀，記錄色譜圖，對(duì)圖3中檢出的雜質(zhì)1～9進(jìn)行定性研究，結(jié)果見(jiàn)表2，聚合物特征質(zhì)譜圖見(jiàn)圖4～5。研究表明，堿破壞樣品中含有多個(gè)頭孢地尼二聚體和頭孢地尼三聚體，互為同分異構(gòu)體，存在優(yōu)勢(shì)聚合，以雜質(zhì)2（相對(duì)保留時(shí)間為2.12）的二聚體雜質(zhì)為主。專(zhuān)屬性試驗(yàn)顯示出峰時(shí)間最晚的雜質(zhì)U的相對(duì)保留時(shí)間為2.0（圖2），而頭孢地尼聚合物類(lèi)雜質(zhì)的相對(duì)保留時(shí)間均大于2.0，考慮到該保留時(shí)間范圍內(nèi)檢出的雜質(zhì)除聚合物雜質(zhì)外還存在少量的小分子雜質(zhì)，故將相對(duì)保留時(shí)間大于2.0的雜質(zhì)作為有關(guān)物質(zhì)Ⅱ，對(duì)其總量進(jìn)行控制。

2.5 樣品測(cè)定結(jié)果

取頭孢地尼原料、頭孢地尼膠囊、頭孢地尼分散片及頭孢地尼片，照“2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，特征色譜圖見(jiàn)圖6，結(jié)果見(jiàn)表3。

3 討論

3.1 系統(tǒng)適用性溶液的選擇

頭孢地尼分子結(jié)構(gòu)7位側(cè)鏈存在氨基活性基團(tuán)，在堿性條件下，氨基活性基團(tuán)更易進(jìn)攻β-內(nèi)酰胺環(huán)發(fā)生L型反應(yīng)；酸性條件下，更易發(fā)生N型聚合反應(yīng)。試驗(yàn)對(duì)酸加熱破壞破壞樣品和堿破壞樣品進(jìn)行了測(cè)定，結(jié)果表明堿破壞樣品中存在多個(gè)頭孢地尼的二聚體雜質(zhì)和少量的三聚體雜質(zhì)，其中以相對(duì)保留時(shí)間約為“2.1”的頭孢地尼二聚體最多。酸加熱破壞樣品中產(chǎn)生的相對(duì)保留時(shí)間大于“2.1”的雜質(zhì)中經(jīng)質(zhì)譜鑒定均不是聚合物類(lèi)雜質(zhì)。

3.2 梯度洗脫條件的選擇

《中國(guó)藥典》2020年版收載的頭孢地尼有關(guān)物質(zhì)檢查項(xiàng)色譜條件由于有機(jī)相比例較低且變化緩慢（42 min有機(jī)相比例變化為2.5%～25%），無(wú)法在一個(gè)梯度程序內(nèi)將極性較小雜質(zhì)洗脫出色譜柱。試驗(yàn)嘗試了3種梯度程序，15 min內(nèi)有機(jī)相的比例變化分別為10%～37.5%、10%～45%、10%～50%。結(jié)果表明3個(gè)條件均可將系統(tǒng)適用性溶液中破壞生成的極性較小雜質(zhì)有效洗脫，對(duì)樣品中極性較小雜質(zhì)的檢出結(jié)果相同。故最終選擇有機(jī)相比例變化范圍在10%～37.5%的梯度洗脫程序。

3.3 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

頭孢地尼和堿破壞生成的頭孢地尼二聚體的紫外特征圖譜在建立的色譜系統(tǒng)中相似，均在225 nm和280 nm附近存在最大吸收，而《中國(guó)藥典》2020年版收載的頭孢地尼有關(guān)物質(zhì)檢查方法檢測(cè)波長(zhǎng)為254 nm。試驗(yàn)采用頭孢地尼堿破壞樣品（約含頭孢地尼二聚體15 μg/mL）考察了頭孢地尼二聚體在這3個(gè)波長(zhǎng)處的信噪比。結(jié)果顯示雖然該雜質(zhì)在225 nm波長(zhǎng)處的響應(yīng)值最高，但基線波動(dòng)也隨之加大，綜合比較最終選擇254 nm為測(cè)定波長(zhǎng)。

3.4 聚合物雜質(zhì)及未知雜質(zhì)結(jié)構(gòu)分析

由表2可知相對(duì)保留時(shí)間大于2.0的雜質(zhì)包括多個(gè)互為同分異構(gòu)體的頭孢地尼二聚體和頭孢地尼三聚體，這些同分異構(gòu)體的結(jié)合位點(diǎn)和取代位點(diǎn)各異，質(zhì)譜碎片信息相似，僅憑質(zhì)譜信息很難確證其結(jié)構(gòu)，但可以確定其為聚合物類(lèi)雜質(zhì)。另試驗(yàn)還對(duì)[M+H]+為442的雜質(zhì)推斷了可能的結(jié)構(gòu)。雜質(zhì)的可能結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖7。

4 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)所建立的方法能夠在較短分析時(shí)間內(nèi)完成對(duì)頭孢地尼及制劑中存在的微量聚合物雜質(zhì)的測(cè)定。對(duì)不同來(lái)源的原料和3種口服制劑共48批樣品檢測(cè)，結(jié)果表明，僅1個(gè)廠家生產(chǎn)的頭孢地尼分散片（批號(hào)：20033002）有關(guān)物質(zhì)Ⅱ總量超過(guò)0.1%，這說(shuō)明頭孢地尼原料和制劑在生產(chǎn)和貯藏過(guò)程中不易聚合生成聚合物類(lèi)雜質(zhì)。

參 考 文 獻(xiàn)

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收稿日期：2022-02-17

作者簡(jiǎn)介：楊倩，女，生于1982年，碩士，副主任藥師，主要從事抗生素類(lèi)藥品質(zhì)量研究，E-mail： yangqian0111@163.com

通訊作者，E-mail： tsf 90@163.com