一株獼猴源唾液乳桿菌對DSS 誘導的結腸炎小鼠的影響

尚可，楊盛智，劉旭，宋佳蓉，范振鑫，岳碧松，李靜

（四川大學生命科學學院，生物資源與生態環境教育部重點實驗室，成都 610065）

獼猴Macaca mulatta是生物和醫學領域中應用最廣泛的非人靈長類動物，目前已在國內廣泛圈養。腹瀉是一類廣泛發生的威脅圈養獼猴健康的疾病（顧宏偉，2021），其中，炎癥性腸病是最普遍的慢性腹瀉疾病，發病機制復雜，可能與遺傳、環境等因素相關，尤其是腸道菌群被認為可能是腹瀉易感性的主要因素（Fournieret al.，2020）。目前，猴場大多采取投喂廣譜性抗生素的形式治療慢性腹瀉，但臨床發現，該方式的治療效果并不明顯，且長期使用抗生素易使腸道致病菌產生耐藥性，且有引發抗生素相關性腹瀉的風險。因此，尋找抗生素的有效替代品，成為了生命科學與醫學領域的關注焦點。

益生菌是指存在于腸道中的一類擁有維持腸屏障完整性、釋放營養物質、調節免疫系統、平衡促炎因子和抗炎因子等功能的活性微生物（高可染等，2022）。益生菌與各類人類及動物疾病，如腸道疾病、糖尿病、心血管疾病及癌癥等都密切相關（Varshaet al.，2021）。適當補充有益細菌后可使腸炎病情得到不同程度的緩解（張瑛，2010）。乳酸菌是人類和動物腸道菌群的主要組成部分之一，也被認為是一類經典的益生菌，具有調節胃腸道微生物組成、輔助治療胃腸和其他多種疾病的功能。如一株泡菜源乳酸菌對酸誘導的小鼠急性結腸炎具有較強的抗炎活性，解剖學和組織病理學顯示口服補充乳酸菌可改善急性結腸炎的癥狀（Sooet al.，2017）。某些乳酸菌菌株可產生維生素，它們在預防和治療結腸炎、黏膜炎等炎癥性疾病方面顯示出了很好的效果（LeBlancet al.，2020）。

本課題組先前自健康獼猴糞便樣品中分離獲得了一株唾液乳桿菌Lactobacillus salivariusMK0901，本研究一方面探究了其體外益生特性，如溶血性、抗生素抗性、耐酸性、耐膽鹽性、細胞黏附性和抑菌性等；另一方面，采用葡聚糖硫酸鈉（dextran sulphate sodium，DSS）誘導法構建結腸炎小鼠模型，以益生性已被廣泛研究和認可的鼠李糖乳桿菌L.rhamnosusGG（LGG）作為陽性菌株，研究了該菌株對結腸炎癥狀的改善和動物腸道菌群的調節作用，從而全面評價其益生活性。

1 材料

1.1 實驗菌株和細胞系

唾液乳桿菌MK0901 來自本課題組菌種庫。溶血性葡萄球菌Staphylococcus haemolyticusATCC29970、大腸埃希氏菌Escherichia coliCMCC（B）44102、乙型副傷寒沙門氏菌Salmonella enterica serovarParatyphi B CMCC（B）50094、金黃色葡萄球菌Staphylococcus aureusCMCC（B）26003、銅綠假單胞菌Pseudomonas aeruginosaCMCC（B）10104 和鼠李糖乳桿菌Lactobacillus rhamnosusATCC 53103購自益加生物科技成都有限公司。人結腸癌細胞（HT-29）細胞系由本學院細胞室提供。

1.2 實驗動物

由成都達碩實驗動物有限公司提供4 周齡SPF 級雄性昆明小鼠60 只［實驗動物生產許可證號：SCXK（川）2020-030］，平均體重28.86 g，體重間無顯著性差異。飼養于本實驗室動物房中，實驗流程按四川大學生命科學學院倫理委員會相關要求進行。正式實驗前進行1周適應性飼養，飼養條件：濕度50%左右，溫度24 ℃左右，每日光照與黑暗各12 h，及時添加飼料和飲用水，自由飲食飲水。

1.3 主要試劑

無菌DPBS 緩沖液、4%多聚甲醛固定液、氯化鈉（分析純）（白鯊生物），MRS 肉湯培養基、MRS 瓊脂培養基、胰酪胨大豆肉湯培養基、哥倫比亞血平板（環凱生物），人工胃液、人工腸液、抗生素藥敏紙片（四環素、氨芐西林、環丙沙星、頭孢曲松、克林霉素、克拉霉素、慶大霉素、氯霉素）（上海源葉生物），葡聚糖硫酸鈉（翌圣生物），腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細胞介素-1β（IL-1β）、白細胞介素-6（IL-6）檢測試劑盒（江蘇晶美生物），糞便DNA 提取試劑盒（天根生化科技）。

1.4 主要儀器及設備

高壓蒸汽滅菌鍋（上海申安）、生化培養箱（三洋電機）、無菌操作臺（浙江蘇凈）、多功能酶標儀（Bio Tek）、超低溫冰箱（海爾）。

2 方法

2.1 體外益生性評估

2.1.1 溶血性 將復蘇、活化的MK0901 接種于哥倫比亞血平板，培養24 h 后觀察其是否出現溶血環，并以溶血性葡萄球菌作為陽性對照。

2.1.2 耐酸、耐膽鹽性和耐人工胃、腸液能力將單菌接種于pH3.0 和豬膽鹽濃度0.3%的MRS 肉湯培養基中，37 ℃培養18 h后，吸取1 μL菌液點于MRS 瓊脂平板上，37 ℃培養24 h，觀測其是否結菌。確認可結菌后，將單菌接種于人工胃液中，菌液濃度調至約108CFU·mL-1，37 ℃培養3 h，用梯度稀釋法進行活菌計數，同時吸取1 mL 培養的人工胃液于9 mL 的人工腸液中，繼續培養3 h 后，再次進行活菌計數，并計算人工胃、腸液存活率。

2.1.3 抗生素抗性 使用無菌棉花蘸取菌液（濃度108CFU·mL-1）并均勻涂布于MRS 瓊脂平板上。將抗生素藥敏紙片貼于MRS 瓊脂平板上，37 ℃培養24 h后，使用游標卡尺測定藥敏圈直徑。

2.1.4 細胞黏附性 挑單菌落接種于MRS 肉湯培養基中，37 ℃培 養24 h 后5 000 r·min-1離 心10 min，用PBS 緩沖液沖洗，將菌液濃度調至106CFU·mL-1。采用細菌與細胞共培的方法測試MK0901 對HT-29 的黏附性，培養時間為2 h（黏附率=共培后菌液濃度/共培前菌液濃度×100%）。

2.1.5 抑菌性 大腸埃希氏菌、乙型副傷寒沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌分別接種于TSB 培養基，37 ℃培養24 h，備用。配制400 mL 營養瓊脂培養基，滅菌后冷卻至40 ℃左右，加入1 mL病原菌培養液，混勻后倒平板，待其凝固后用6 mm打孔器打孔，每孔加50 μL MK0901 發酵液上清，37 ℃培養24 h后測定抑菌圈直徑。

2.2 對結腸炎小鼠的作用

2.2.1 結腸炎小鼠造模和動物分組 將試驗菌株MK0901 與陽性對照菌株LGG 復蘇并活化。將其置于-4 ℃、6 000 r·min-1離心5 min，棄掉上清液，收集菌泥。使用無菌PBS 緩沖液重懸菌體，調節菌液濃度達109CFU·mL-1，配制為灌胃用菌懸液，備用。60 只昆明雄性小鼠隨機分為4 組：空白對照組（CK 組）、模型組（DSS 組）、LGG 組和MK0901 組。實驗周期共16 d，分為造模期（8 d）和恢復期（8 d）。整個實驗周期中，空白組每日提供正常水，自由飲用，每日每只小鼠灌胃0.2 mL 無菌生理鹽水；實驗組小鼠在造模期每天提供4%DSS自由飲用，在恢復期自由飲用正常水，每日每只DSS 組小鼠灌胃0.2 mL 無菌生理鹽水，其余2 組則分別灌胃0.2 mL上述MK0901或LGG菌懸液。

2.2.2 小鼠體重變化率及免疫器官指數測定每日稱量小鼠體重并繪制其變化曲線。實驗結束日脫頸處死小鼠，迅速取出脾臟并用生理鹽水沖洗，濾紙吸干水分后稱量。脾臟指數=脾臟重量（g）/小鼠體重（g）×100%。

2.2.3 結腸組織病理學表現 取小鼠結直腸，以盲腸為辨識標志測量其長。截取1 cm 結腸并用4%多聚甲醛固定液將其固定24 h。采用HE 染色法進行制片。用光學顯微鏡觀察小鼠結腸組織的病理學表現。

2.2.4 血清炎癥因子測定 采用眼眶取血法獲得小鼠新鮮血樣，將血樣置于3 000 r·min-1離心10 min，收集血清。使用TNF-α、IL-1β 和IL-6 檢測試劑盒，按照說明書測定炎癥因子指標。

2.3 對結腸炎小鼠腸道菌群的影響

使用糞便基因組DNA 試劑盒提取糞便總DNA。使用PCR 擴增細菌16S rRNA基因V3-V4 高變區，擴增引物為338F（ACTCCTACGGGAGGCA GCAG）和806R（GGACTACHVGGGTWTCTAAT）。采用Illumina MiSeq PE250平臺完成16S rRNA基因擴增子測序，使用美吉生信云分析平臺（https：//cloud.majorbio.com/）完成數據質控及分析。以相似度不低于97%為標準對物種序列進行聚類分析，統計各組OTU 數目；采用QIIME 中“diversity alpha-group-significance”計算Alpha 多樣性指數；ggplot2 和vegan 包完成主坐標分析；物種豐度分析由ggplot2完成。

3 結果

3.1 MK0901體外評估結果

MK0901 的單菌落在哥倫比亞血平板上未形成溶血環，可耐受長達18 h 的高酸、高膽鹽環境，且在耐受3 h 人工胃、腸液后的存活率為94.3%和92.7%。抗生素抗性測試結果表明，MK0901 對四環素、氨芐西林、環丙沙星、頭孢曲松、克林霉素、克拉霉素、氯霉素均表現為敏感，僅對慶大霉素表現為耐藥。細胞黏附性結果顯示，MK0901 對HT-29的黏附率達到87.5%。此外，MK0901對大腸桿菌、沙門氏菌和金色葡萄球菌和銅綠假單胞菌均有一定抑制作用（表1）。綜上，唾液乳桿菌MK0901 具有良好的安全性和體外益生特性，具備益生菌開發潛力。

3.2 MK0901對小鼠結腸炎的作用

3.2.1 小鼠體重及免疫器官指數測定結果 經DSS 溶液處理的3 組小鼠平均體重均低于CK 組，尤其是DSS 組，平均體重最低。至恢復期結束（第16 天），MK0901 組和LGG 組的平均體重均比DSS 組高。MK0901 組和LGG 組的平均脾臟指數比DSS 組低，與CK 組相近，但并無統計學差異（P＞0.05）（表2）。

表2 各組小鼠的平均體重和脾臟指數對比Table 2 Comparison of average body weight and spleen index of mice in each group

3.2.2 小鼠結腸組織病理學變化 組織切片顯示，CK 組腸黏膜組織完整，未見潰瘍，黏膜可見淋巴濾泡形成（圖1：a）；DSS組結腸黏膜及肌層變薄，腺體層次減少，腸腔擴張，局部潰瘍形成，表面未見腺上皮被覆，其下出血及小血管增生（圖1：b）；與CK 組相比，LGG 組（圖1：c）和MK0901 組（圖1：d）的黏膜和肌層稍變薄，腺體層次減少，腸腔擴張，但較DSS 組而言，未出現明顯潰瘍，黏膜僅見少許慢性炎癥細胞浸潤。

圖1 小鼠結腸HE染色圖（×400）Fig.1 HE staining diagram of mouse colon （×400）

3.2.3 MK0901 對小鼠血清炎癥因子水平的影響 與CK 組相比，DSS 組的3 種炎癥因子水平都顯著（IL-1β：P＜0.05）或極顯著升高（TNF-α和IL-6：P＜0.01），而LGG 組和MK0901 組的均有所下降，其中，TNF-α 水平的差異不顯著。MK0901 組與LGG 組的TNF-α 和IL-6 水平均極顯著低于DSS 組（P＜0.01），但MK0901 組的IL-1β 水平與CK 組的差異不顯著（P＞0.05）（圖2）。

圖2 小鼠炎癥因子水平Fig.2 Levels of inflammatory factors in mice

3.2.4 MK0901 對結腸炎小鼠腸道菌群的影響MK0901 組的Shannon 指數最高；LGG 組的Ace 和Chao 指數最高；3 個多樣性指數均是DSS 組最低（圖3：A～C）。OTU 聚類結果顯示，4 組樣品的OTU數目為513～617 個，其中，DSS 組的最少（513），MK0901 組的最多（617）；4 組特有的OTU 數目為115～174個，其中，MK0901組最豐富（圖3：D）。

圖3 各組樣品的菌群結構差異Fig.3 Bacterial structure difference of samples from each group

主坐標分析（PCoA）顯示，PC1 與PC2 之和達53.98%（＞50%），DSS 組的菌群結構與其余3 組的差異最大，而LGG 組和MK0901 組則趨近于CK 組（圖3：E）。

物種堆積圖顯示，在門水平上，擬桿菌門Bacteroidota和厚壁菌門Firmicutes是各組主要菌群門類。DSS 組中，擬桿菌門占據明顯優勢（P=70.98%），而厚壁菌門的比例最低（P=25.24%）（圖3：F）。在屬水平上，各組優勢的前2 個屬均為乳桿菌屬Lactobacillus和隸屬于Muribaculaceae 的某屬。除CK 組外，其余組均包含較高比例的擬桿菌屬Bacteroides，尤其是DSS 組，比例達到16.34%。與其他組相比，MK0901組含較多的毛螺旋菌科Lachnospiraceae和普雷沃氏菌科Prevotellaceae 成員，豐度分別為7.41%和5.45%（圖3：G）。

4 討論

作為抗生素替代品，益生菌近年來在人類和動物健康領域引起了廣泛關注，其被認為擁有提高免疫力、緩解炎癥、增加營養物質及調整腸道菌群等功效。安全性是篩選益生菌的重要指標，不具備溶血活性及對常見抗生素類型敏感是益生菌可服用的前提（馮程程等，2022）。當益生菌進入宿主體內后，會遭遇胃腸液環境中的高酸和高濃度膽鹽脅迫，極有可能失去活性，因此，具備良好的胃腸環境耐受性才可保證益生菌發揮其益生性能。作為外源性細菌，益生菌對宿主腸道上皮細胞要有一定的黏附能力，才能定植于機體，進而調節微生態環境，并抵抗致病菌的侵襲（魏雪等，2022）。本研究顯示唾液乳桿菌MK0901 在以上評估中均表現良好，還對大腸桿菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌及銅綠假單胞菌等常見的腸道致病菌具有抑菌活性，展示了良好的安全性和益生特性。

MK0901 對結腸炎動物模型也顯示出良好的修復活性。灌胃MK0901 有助于結腸炎小鼠恢復體重，恢復效果與公認的益生菌株LGG 的效果相當。脾是機體重要的免疫器官（吳濤等，2022），脾腫大則脾臟指數上升，表明存在炎癥反應。雖然MK0901 組和LGG 組小鼠的脾臟指數與DSS 模型組的差異不顯著，但DSS 組的平均脾臟指數高于MK0901 組和LGG 組，表明2 個菌株都具有一定緩解脾臟腫大的功效。結腸病理組織切片顯示，MK0901 和LGG 菌在一定程度上保護了腸道組織，抵抗了DSS對結腸組織結構產生的損害作用，降低了潰瘍和炎癥的程度。促炎因子TNF-α、IL-1β 和IL-6 是檢測機體免疫狀態和炎癥反應的重要指標（李青松等，2022）。益生菌可通過抑制炎癥信號通路，從而降低促炎因子的表達量（齊從虎，楊景玉，2017；王呂斌，錢軍，2019；Liet al.，2021）。本研究也發現MK0901 與LGG 對3 種促炎因子均具可極顯著降低TNF-α 和IL-6 水平，而對IL-1β 水平的降低作用不明顯，同時發現MK0901 降低IL-1β炎癥因子的效果要優于LGG菌株。

腸道菌群多樣性和組成的變化與結腸炎等腸道疾病關系密切。4組小鼠糞便微生物的16S rRNA測序分析顯示，MK0901 組的Shannon 指數最高，LGG 組的Ace 和Chao 指數最高，表明灌胃益生菌可緩解由DSS 造成的腸道菌群多樣性的下降。從腸道微生物組成上，MK0901 組具有最高的菌群總數及最多的獨有菌群，這與其最高Shannon指數的結果一致。PCoA 顯示MK0901 組與LGG 組與空白對照組的菌群組成更加相似，而DSS組則表現出較大差異，這表明2株益生菌都可調節宿主腸道微生物結構，使之恢復正常。莫曉瑋等（2022）研究顯示，擬桿菌屬的豐度能反映結腸炎的嚴重程度，且兩者呈正相關。這與本研究結果一致，DSS模型組擬桿菌屬相對豐度高于CK 組，而MK0901 組和LGG組介于CK 組與DSS 組之間，表明2株益生菌都能緩解腸炎癥狀。此外，MK0901 處理后使毛螺旋菌科和普雷沃氏菌科細菌豐度增加。毛螺旋菌科具有水解糖和產生短鏈脂肪酸的作用，而短鏈脂肪酸在維持和修復腸道黏膜結構、保障腸道功能正常運作及防止炎癥和潰瘍發生等方面發揮著關鍵作用（楊立娜等，2022）。普雷沃氏菌科下的諸多成員被認為具有重要的營養功能，其能降解蛋白質和碳水化合物，并在一定程度上改善腸道微環境（Asgharianet al.，2022）。

唾液乳桿菌MK0901 顯示出優良的體外益生特性，同時針對患結腸炎動物，該菌株具有維持體重、降低炎癥水平、保護腸道組織及調節腸道菌群結構等功效，是非常具有開發潛力的益生菌候選菌株，為防治圈養獼猴由炎癥性腸病引起的慢性腹瀉提供了一個潛在的解決方案。

致謝：感謝四川大學生命科學學院張修月教授對本研究的支持和幫助，感謝益生菌團隊成員楊宇、黃飛云、李嘉偉、夏雪及鄭苗苗等對實驗實施的幫助。