結(jié)核分枝桿菌微滴數(shù)字PCR檢測(cè)試劑盒企業(yè)參考品的研制

王 諾,李小紅,周 雪,李俊花,危宏平

(中國科學(xué)院 武漢病毒研究所,武漢 430070)

0 引言

結(jié)核病大多是由結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群(包括結(jié)核分枝桿菌、牛分枝桿菌、田鼠分枝桿菌和非洲分枝桿菌)引起的慢性傳染病,以肺結(jié)核最為多見[1]。結(jié)核分枝桿菌主要經(jīng)空氣傳播,潛伏及感染時(shí)間長(zhǎng)。世界衛(wèi)生組織已將其作為重點(diǎn)控制的傳染病之一。

結(jié)核分枝桿菌檢測(cè)方法主要有培養(yǎng)法、痰涂片法、膠體金抗原檢測(cè)法及核酸檢測(cè)法。培養(yǎng)法是檢測(cè)的金標(biāo)準(zhǔn),但存在培養(yǎng)方法復(fù)雜、檢測(cè)速度慢及培養(yǎng)陽性率低等缺點(diǎn)。非結(jié)核分枝桿菌會(huì)導(dǎo)致痰涂片結(jié)果呈陽性,而膠體金抗原檢測(cè)法靈敏度低,易造成假陰性。熒光PCR法是結(jié)核病檢測(cè)經(jīng)常使用的一種檢測(cè)技術(shù),敏感性及特異性很高,技術(shù)操作也不復(fù)雜,故被廣泛應(yīng)用于臨床篩查及結(jié)核病輔助診斷。微滴數(shù)字PCR法是第三代PCR技術(shù),是基于PCR反應(yīng)的單分子絕對(duì)定量技術(shù),通過對(duì)樣本的微滴化處理,大大提升了檢測(cè)靈敏度及準(zhǔn)確性,只需要很少的模板量就能進(jìn)行檢測(cè),較熒光PCR法有較大的優(yōu)勢(shì)[2]。

為滿足結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群核酸檢測(cè)試劑盒(微滴數(shù)字PCR法)的質(zhì)量評(píng)價(jià)及注冊(cè)申報(bào)需要,研制了結(jié)核分枝桿菌微滴數(shù)字PCR檢測(cè)試劑盒企業(yè)參考品,檢測(cè)項(xiàng)目包括陽性參考品符合率、陰性參考品符合率、最低檢出量及精密性[3-5]。

1 材料與方法

1.1 菌株

結(jié)核分枝桿菌減毒株H37Ra、BCG、恥垢分枝桿菌及海分枝桿菌均來源于中國科學(xué)院武漢病毒研究所保藏中心。

1.2 主要試劑及儀器

7H9液體培養(yǎng)基、7H10固體培養(yǎng)基外購自BD公司(Becton,Dickinson and Company),WK30兩性表面活性劑由德國贏創(chuàng)研發(fā)生產(chǎn)[6],結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群核酸檢測(cè)試劑盒(熒光PCR法)來自武漢賽思銳微生物技術(shù)有限公司,QX200 微滴式數(shù)字PCR系統(tǒng)購自BIO-RAD。

1.3 菌種培養(yǎng)及鑒定

將結(jié)核分枝桿菌減毒株H37Ra與BCG菌株接種于7H9液體培養(yǎng)基上,使用37 ℃、5%的CO2培養(yǎng)3～4周,充分震蕩混勻,制備菌懸液,平均分成2份,其中一份-20 ℃凍存,另一份取0.5 mL均勻涂布在7H10固體培養(yǎng)基上,使用37℃、5%的CO2培養(yǎng)1周,采用平板計(jì)數(shù)法計(jì)算濃度。95 ℃水浴30 min滅活1 mL菌液,使用16S測(cè)序法進(jìn)行鑒定,將經(jīng)鑒別無誤且無污染的合格菌液作為參考品原菌液。

將恥垢分枝桿菌與海分枝桿菌接種于7H9液體培養(yǎng)基上,恥垢使用37 ℃培養(yǎng)3 d,海分枝桿菌使用30 ℃培養(yǎng)6 d。充分震蕩混勻,制備菌懸液,平均分成2份,其中一份-20 ℃凍存,另一份取0.5 mL均勻涂布在7H10固體培養(yǎng)基上,使用相應(yīng)的條件培養(yǎng)1周,采用平板計(jì)數(shù)法計(jì)算濃度。95 ℃水浴30 min滅活1 mL菌液,使用16S測(cè)序法進(jìn)行鑒定,將經(jīng)鑒別無誤且無污染的合格菌液作為參考品原菌液[7]。

1.4 原菌液的制備

陽性與陰性參考品原菌液的制備:-20 ℃凍存的菌液,采用95 ℃水浴30 min滅活,利用平板計(jì)數(shù)法計(jì)算濃度,均用5%WK30稀釋H37Ra、BCG、恥垢分枝桿菌、海分枝桿菌菌液至106CFU/mL,作為滅活的陽性質(zhì)控品與陰性質(zhì)控品菌液,-20 ℃以下保存。

最低檢出量及精密性參考品原菌液的制備:使用滅活的結(jié)核分枝桿菌H37Ra菌液,加入5%WK30稀釋到106CFU/mL,-20 ℃以下保存。

1.5 參考品的制備與分裝

陽性參考品的制備:將2株結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群菌液H37Ra、BCG以5%WK30做10倍系列稀釋至103CFU/mL,定量分裝,1 mL/管,-20℃以下保存,分別記為P1、P2。

陰性參考品的制備:將2株非結(jié)核分枝桿菌恥垢分枝桿菌、海分枝桿菌的菌液以5%WK30做10倍系列稀釋至104CFU/mL,定量分裝,1 mL/管,-20 ℃以下保存,分別記為N1、N2。

最低檢出量參考品的制備:最低檢出量參考品原菌液以5%WK30分別10倍系列稀釋,分別制備103、102、101、100CFU/mL的菌液,定量分裝,1 mL/管,-20 ℃以下保存,依次記為S1、S2、S3、S4。

精密性參考品的制備:按確定的細(xì)菌濃度,將精密性參考品原菌液以5%WK30稀釋,制備102CFU/mL菌液,定量分裝,1 mL/管,-20 ℃以下保存,每10管為一組,分別記為J1～J10。

1.6 參考品的驗(yàn)證

按照熒光PCR試劑盒說明書方法檢測(cè)參考品并對(duì)其進(jìn)行確認(rèn),每份樣品平行檢測(cè)3次。

準(zhǔn)確性:對(duì)陽性參考品(P1,P2)進(jìn)行檢測(cè),要求均為陽性。

特異性:對(duì)陰性參考品(N1,N2)進(jìn)行檢測(cè),要求均為陰性。

精密性:對(duì)精密性參考品進(jìn)行檢測(cè)(J1～J10),應(yīng)全部為陽性,且CV≤5%。

最低檢出量:對(duì)最低檢出量參考品進(jìn)行檢測(cè)(S1～S4),S1與S2要求為陽性,S3與S4不做要求。

1.7 參考品的穩(wěn)定性分析

凍融穩(wěn)定性:將陽性參考品(P1～P2)、精密性參考品、最低檢出限參考品分別于-20 ℃冰箱取出,于室溫放置1 h,再放于20 ℃冰箱,重復(fù)此步驟3次、5次。用微滴數(shù)字PCR檢測(cè)試劑盒進(jìn)行檢測(cè),用-20 ℃保存的參考品進(jìn)行平行測(cè)定。

加速穩(wěn)定性:將陽性參考品(P1～P2)、精密性參考品、最低檢出限參考品分別放置于2 ℃～8 ℃、25 ℃、37 ℃條件3 d及7 d,用微滴數(shù)字PCR檢測(cè)試劑盒進(jìn)行檢測(cè),用-20 ℃保存的參考品進(jìn)行平行測(cè)定。

1.8 參考品的應(yīng)用

使用本參考品對(duì)連續(xù)3個(gè)生產(chǎn)批的結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群核酸檢測(cè)試劑盒(微滴數(shù)字PCR法)進(jìn)行檢驗(yàn),評(píng)價(jià)試劑盒質(zhì)量。

2 結(jié)果

結(jié)果顯示,外購熒光PCR試劑盒的3次重復(fù)檢測(cè)均符合準(zhǔn)確性(陽性參考品符合率2/2)、特異性(陰性參考品符合率2/2)及精密性(均為陽性且CV均≤5%)的要求,最低檢出限達(dá)到1.0*102CFU/mL,詳見表1。

表1 參考品檢驗(yàn)結(jié)果Tab.1 Results of reference test

凍融穩(wěn)定性:經(jīng)反復(fù)凍融3次、5次處理后,與-20 ℃保存的各參考品檢測(cè)結(jié)果相比,陽性微滴數(shù)的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,表明參考品的凍融穩(wěn)定性良好,見表2。

表2 參考品凍融穩(wěn)定性及加速穩(wěn)定性結(jié)果Tab.2 Freeze-thaw and accelerated stability of reference

加速穩(wěn)定性:將各參考品分別于2～8 ℃、25 ℃、37 ℃放置3 d和7 d,與-20 ℃保存的參考品檢測(cè)結(jié)果相比,陽性微滴數(shù)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,表明本參考品在加速破壞條件下具有較好的穩(wěn)定性,見表2。

使用該參考品對(duì)結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群核酸檢測(cè)試劑盒(微滴數(shù)字PCR法)各3批進(jìn)行出廠檢測(cè),檢測(cè)結(jié)果見表3。

表3 微滴數(shù)字PCR檢驗(yàn)結(jié)果Tab.3 Results of microdrop digital PCR test

以上結(jié)果表明,連續(xù)3個(gè)生產(chǎn)批的結(jié)核分枝桿菌微滴數(shù)字PCR試劑盒可通過該參考品作出廠檢測(cè)質(zhì)量評(píng)價(jià)。

3 討論

該參考品選擇了2株結(jié)核分枝桿菌及2株非結(jié)核分枝桿菌,陰性參考品使用了分類學(xué)上與結(jié)核分枝桿菌地位接近的恥垢分枝桿菌屬菌與海分枝桿菌,陽性參考品使用滅活的結(jié)核分枝桿菌菌株減毒株及卡介苗疫苗株,符合法規(guī)需要,降低了生物安全風(fēng)險(xiǎn)。設(shè)置了精密性參考品,來自H37Ra滅活稀釋后的菌懸液將細(xì)菌濃度定為102CFU/mL,略高于國家參考品規(guī)定的102個(gè)菌/mL應(yīng)檢出陽性的標(biāo)準(zhǔn)。設(shè)置了最低檢出量參考品,使用10倍梯度稀釋制備,最低檢出量標(biāo)準(zhǔn)為101CFU/mL,滿足微滴數(shù)字PCR試劑盒的靈敏度要求。對(duì)分裝后的參考品進(jìn)行驗(yàn)證,結(jié)果表明,本參考品具有較好的準(zhǔn)確性、特異性及重復(fù)性。制備參考品的過程中使用WK30代替生理鹽水對(duì)滅活菌液進(jìn)行稀釋,減少了DNA酶對(duì)其的降解,并對(duì)其穩(wěn)定性進(jìn)行驗(yàn)證,結(jié)果顯示,最多凍融5次或37 ℃放置14 d時(shí),本參考品依然可以正常使用,滿足了保存及運(yùn)輸要求。但由于缺乏長(zhǎng)期穩(wěn)定的數(shù)據(jù),需要在后續(xù)研究中持續(xù)監(jiān)測(cè)。該結(jié)核分枝桿菌微滴數(shù)字PCR檢測(cè)試劑盒企業(yè)參考品可用于擬注冊(cè)申報(bào)試劑盒質(zhì)量評(píng)價(jià)及出廠檢驗(yàn)。