微流控芯片技術檢測蝦肝腸胞蟲及其在浙江省對蝦流行病學調查中的應用

孫福英 白斐 祝波 盧先東 錢冬

摘 要 南美白對蝦是浙江省養殖的主要蝦類，蝦肝腸胞蟲感染（Enterocytozoon hepatopenaei，EHP）是南美白對蝦養殖中危害最大的疾病，引起嚴重的生長遲緩，造成極大的損失。蝦肝腸胞蟲個體微小，給顯微鏡檢測造成較大的困難，因此嘗試建立快速、靈敏的定量檢測微流控芯片檢測技術。結果表明，所建立的微流控芯片檢測方法特異性良好，重復性良好，擴增結果穩定可靠，最低檢出限為3.23×100 copies·μL-1。將該檢測技術應用于浙江省對蝦流行病學特點分析中，發現三門縣和舟山市對蝦腸胞蟲感染率比較高，除嘉興市未出現對蝦通用型傳染皮下及造血組織壞死病毒感染，其他地方均有感染。試驗證明，微流控芯片快速檢測技術有望應用于對蝦規模化養殖中蝦肝腸胞蟲感染的快速檢測。

關鍵詞 微流控芯片技術；蝦肝腸胞蟲；流行病學；浙江省

中圖分類號：S945.4 文獻標志碼：A DOI：10.19415/j.cnki.1673-890x.2023.06.063

蝦肝腸胞蟲（Enterocytozoon hepatopenaei，EHP）

屬于真菌界（Fungi）微孢子蟲門（Microsporidia）單倍期綱（Haplophasea）壺孢目（Chytridiopsida）腸胞蟲科（Enterocytozoonidae）腸胞蟲屬（Enterocytozoon），是一種可感染多種真核生物的專性細胞內寄生蟲[1-3]。EHP主要感染對蝦的肝胰腺，感染較嚴重時也感染中腸、血淋巴、腮和肌肉等組織[4]。對蝦感染EHP后，可與急性肝胰腺壞死弧菌共感染，死亡率可明顯上升，兩者具有累加效應[5]。

EHP個體微小，給顯微鏡檢測造成較大困難，EHP傳播迅速，危害大，需要快速、靈敏的檢測技術。常規的PCR檢測耗時較長，熒光定量PCR靈敏度高，但上述檢測技術均需要在實驗室完成。微流控芯片技術也叫芯片實驗室（lab on a chip，LOC），是一種以在微米尺度空間完成對化學或生物樣品的常規化學和生物實驗室功能為主要特征的技術平臺[6]。其把生物、化學、醫學分析過程的樣品制備、反應、分離、檢測等基本操作單元集成到一塊微米尺度的芯片上，自動完成分析全過程。

為建立快速、便捷、定量檢測EHP的方法，方便養殖場現場對EHP的流行規律進行定量評估，本文嘗試建立EHP定量檢測的微流控芯片檢測技術。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

微流控熒光檢測儀，寧波愛基因科技有限公司；熒光定量PCR，瑞士Roche公司；PCR儀，德國Analitik Jena AG公司；NanoDrop微量UV-Vis分光光度計，美國Thermo Fisher公司。

熒光等溫擴增液，寧波愛基因科技有限公司；通用SYBR qPCR預混液，南京諾唯贊生物科技有限公司；瓊脂糖凝膠回收試劑盒和質粒提取試劑盒，美國Omege公司；pMD19-T Vecto專用載體，日本TaKaRa公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 引物設計和篩選

腸胞蟲采用GenBank公布片段，選擇高度保守基因序列片段，PrimerExplorV5 在線軟件設計引物。一共設計4條引物，每條引物中均包含上/下游外引物F3/B3、上/下游內引物FIP/BIP，具體設計情況見表1。引物由杭州有康生物公司合成，通過加熱干燥的方式將預篩選引物包埋于反應室中，篩選出最佳反應引物。

1.2.2 標準質粒的合成

取提取的腸胞蟲基因片段的克隆采用高保真酶Pfu預混液，進行EHP目的基因擴增，將獲得的PCR產物瓊脂糖凝膠電泳后，切膠回收純化，與pMD19-T載體連接，后轉至DH5α感受態細胞，篩選陽性克隆重組質粒，送生物科技有限公司測序鑒定，對于鑒定正確的重組質粒，名為pMD-EHP，對陽性質粒進行濃度測定，拷貝數計算，分裝，-80 ℃保存備用。

1.2.3 微流控芯片檢測技術標準曲線的建立

樣本充分均質，試劑于室溫下解凍，充分混勻并短暫離心后使用。嚴格按照試劑盒說明書進行操作。

微流控芯片檢測儀恒溫擴增時，儀器會自動實時檢測熒光，形成熒光檢測擴增曲線。微流控芯片按閾值時間（Ct）判定樣品：1）陽性——反應孔出現Ct＜60，有明顯的S型擴增曲線；2）陰性——反應孔出現

Ct＞60，無擴增曲線。

選擇腸胞蟲（EHP）、對蝦通用型傳染皮下壞死（IHHNV-U）、虹彩病毒（DIV1）、弧菌（Vibrio）陽性標準質粒加入樣本內標孔，按照儀器操作說明書運行程序，構建標準曲線。

1.2.4 微流控靈敏度測試

選擇無菌水作為陰性對照，用S01-03-06-18蝦病四聯（EHP、IHHNV-U、DIV1、Vibrio）微流控芯片快速檢測試劑盒QT進行定標，根據優化條件和構建的標準曲線，確定擴增腸胞蟲陽性核酸的最低檢出限。

1.2.5 微流控反應特異性與穩定性測試

特異性實驗是為了檢查該方法與其他水生動物病原之間是否存在交叉反應，分別以腸胞蟲、急性肝胰腺壞死、對蝦通用型傳染、對蝦感染型傳染、對蝦白斑綜合癥、十足目虹彩病毒和羅氏沼蝦諾病毒的DNA為模板，使用優化條件檢測其特異性。

使用稀釋至104 copies·μL-1的標準陽性質粒在1次實驗中重復16次，通過分析檢測閾值時間（Ct）評價該方法的重復性。

1.2.6 實際樣品檢測

2020—2022年，分別在浙江省臺州市、舟山市、嘉興市、寧波市、杭州市采樣，對調查采集的腸胞蟲患病對蝦、其他疑似發患病蝦、藥物治療后的蝦共37批，用微流控芯片進行腸胞蟲進行檢測，統計腸胞蟲陽性檢出率。

2 結果與分析

2.1 微流控引物篩選結果

篩選和比較腸胞蟲微流控檢測的多套引物的Ct值，如圖1所示。結果表明，引物1擴增反應時間比較長，Ct值在22 min左右；引物2反應時間短，Ct值在12 min

左右，具有明顯的擴增曲線，但曲線比較分散；引物3無擴增峰；引物4反應時間短，Ct值在11 min左右，具有明顯的擴增曲線，且曲線比較集中。因此引物4為最佳引物，后續實驗均采用引物4。

2.2 EHP微流控芯片檢測標準曲線

用S01-03-06-18蝦病四聯（EHP、IHHNV-U、DIV1、Vibrio）微流控芯片快速檢測試劑盒QT進行定標，4種病原標準曲線如圖2所示。微流控芯片最低檢出限為3.23×100 copies·μL-1。

2.3 微流控特異性與重復性結果

特異性實驗結果（圖3）顯示，除EHP為模板的陽性樣品熒光定量出現擴增峰外，其他模板樣品均無擴增曲線出現，說明微流控芯片檢測方法的特異性良好。重復性結果見圖4，取104 copies·μL-1的標準陽性質粒在重復檢測16次，Ct值15.40±0.12 min，變異系數0.78，陽性質粒均出現了典型S型擴增，陰性對照均未出現擴增，表明建立的EHP微流控芯片方法有良好的重復性，擴增結果穩定可靠。

2.4 微流控技術在蝦肝腸胞蟲流行病學研究中的應用

如表2所示，2020—2022年共采集檢測樣品37批次，感染20批次，腸胞蟲的感染率為54.05%。其中，2020年共調查11批次，感染6批次，檢出率54.55%；2021年共調查12次，感染9批次，感染率為75.00%；2022年共調查14批次，感染5批次，感染率為35.71%。

對所采集的37批樣本進行分區域病原檢測，結果如表3所示，腸胞蟲的染率達54.05%，對蝦通用型傳染皮下及造血組織壞死病毒（IHHNV-U）檢出率32.43%，弧菌（Vibrio）檢出率為45.95%。三門縣和舟山市的腸胞蟲感染率比較高，其次是寧波市、杭州市。除嘉興市未出現IHHNV-U感染，其他地方均有感染。

3 結論與討論

EHP孢子大小僅為0.7 μm×1.1 μm，感染無明確易判斷的臨床癥狀，很難觀察。雷燕等根據GenBank中對蝦腸道上皮細胞的EHP基因保守序列，設計特異性引物，優化PCR擴增條件，建立了EHP的PCR檢測方法[7]。Tangprasittipap等利用套式PCR檢測方法，開展了EHP診斷和分子流行病學調查[8]。然而PCR具有模板質量和引物設計要求較高、需擴展特定DNA、操作復雜等缺點。劉丹等應用環介導等溫擴增（LAMP）同時檢測副溶血弧菌與金黃色葡萄球菌[9]。環介導等溫擴增（Loop Mediated Isothermal Amplification，LAMP）技術具有檢測時間短、靈敏性高和檢測結果準確等優勢，但由于其預處理時間長，且需要專業的檢測人員操作，不易在現場及基層推廣[10]。世界衛生組織認為，理想的診斷檢測技術應具有敏感性高、特異性強、使用成本低、操作簡單快捷、可用于任何環境條件下同時容易獲得操作儀器等特點[11]。微流控芯片可以設計多條微通道，且微通道之間結構封閉，同一個微流控芯片可以對同一樣本同時進行不同項目的檢測，有效避免交叉污染，縮短了檢測時間，提高了檢測效率[12]。微流控芯片的微型化提高了傳熱效率，節約了試劑成本和樣本，且不需要大量的實驗設備，因此大規模生產技術集成的微流體芯片大大降低了生產成本[13]。

對天津市2015年和2016年蝦肝腸胞蟲的流行情況調查表明，EHP的檢出率分別為56.96%、69.52%[14]。2019年，江蘇省溫室養殖蝦類中EHP患病率為56.3%，土塘養殖蝦類中EHP患病率為79.5%[15]。本實驗室在2020—2022年共采集檢測樣品37批次，腸胞蟲的感染率為54.05%。數據顯示，EHP引發的感染病已嚴重威脅我國蝦類的健康養殖。此外，本文針對浙江省不同地區對蝦流行病學特點的分析發現，三門縣和舟山市的腸胞蟲感染率比較高，除嘉興市未出現對蝦通用型傳染皮下及造血組織壞死病毒感染，其他地方均有感染。

參考文獻：

[1] 邱海洪，何欣怡，李明乾，等.家蠶微孢子蟲感染BmN細胞的差異表達基因篩選及Akirin的原核表達[J].蠶業科學，2012，38（4）：673-679.

[2] TANG K F J， PANTOJA C R， REDMAN R M，et al. Development of in situ hybridization and PCR assays for the detection of Enterocytozoon hepatopenaei （EHP）， a microsporidian parasite infecting penaeid shrimp[J].Journal of Invertebrate Pathology，2015，130：37-41.

[3] 葉鍵，許婷，施禮科，等.3種蝦肝腸胞蟲PCR檢測

方法的應用比較分析[J].水產科學，2019，38（3）：411-415.

[4] 程東遠，邱亮，宋增磊，等.凡納濱對蝦感染蝦肝腸胞蟲的群體及組織間差異性分析[J].漁業科學進展，2018，39（4）：83-92.

[5] 楊小娟，陳潔，魏春梅，等.兩種分離純化介質對蝦肝腸胞蟲孢子發芽率的影響[J].重慶師范大學學報（自然科學版），2020，37（3）：46-53.

[6] 姚琳，白亮，吳亮其，等.微流控芯片技術在細胞生物學研究中的應用進展[J].中國細胞生物學學報，2011，33（11）：1254-1266.

[7] 雷燕，肖洋，張會軍，等.凡納濱對蝦腸道上皮細胞微胞子蟲PCR檢測方法的建立與應用[J].廣東海洋大學學報，2016，36（4）：50-54.

[8] TANGPRASITTIPAP A， SRISALA J， CHOUWDEE S，et al. The microsporidian Enterocytozoon hepatopenaei is not the cause of white feces syndrome in whiteleg shrimp Penaeus （Litopenaeus） vannamei [J].BMC Veterinary Research，2013，9：139.

[9] 劉丹，謝加玲，張孟雨，等.基于實時熒光環介導等溫擴增技術同時檢測副溶血弧菌與金黃色葡萄球菌[J].食品與發酵工業，2022，48（22）：255-262.

[10] 姚延祿，曹寧，周新麗.基于環介導等溫擴增的離心式微流控芯片檢測3種致病菌[J].食品與發酵工業，2022，48（5）：255-261.

[11] MORI Y， NOTOMI T. Loop-mediated isothermal amplification （LAMP）： a rapid， accurate， and cost-effective diagnostic method for infectious diseases [J]. Journal of Infection and Chemotherapy，2009，15（2）：62-69.

[12] AFNAN UDA M N，HASHIM U，UDA M N A，et al.Design and fabrication of multichannel PDMS microfluidic[J].Journal of Physics，2021，2129（1）：012048.

[13] 胡潤林，王立新，任曉龍.基于核酸檢測的微流控芯片設計與傳熱分析[J].微納電子技術，2022，59（1）：58-65.

[14] 許杰.2015—2017年天津市蝦肝腸胞蟲流行情況調查[J].中國動物檢疫，2018，35（8）：13-16.

[15] SHEN H，QIAO Y，WAN X H，et al. Prevalence of shrimp microsporidian parasite Enterocytozoon hepatopenaei in Jiangsu Province， China[J]. Aquaculture International，

2019，27（3）：675-683.

（責任編輯：劉寧寧）