不同劑量維生素D3 對腹主動脈壓力過負荷大鼠心臟結構、功能的影響

王婷，付建莉，張雪梅，趙媛，趙玉蘭

現有證據表明，射血分數降低的心力衰竭（heart failure with reduced ejection fraction，HFrEF）患者25羥維生素D〔25-hydroxyvitamin D，25（OH）D〕水平低于健康對照者［1］，且低水平維生素D是HFrEF患者死亡的獨立預測因子［2］。但心力衰竭患者補充維生素D的臨床效果卻大相徑庭。臨床研究表明，補充維生素D可以改善慢性心力衰竭患者的左心室功能，延緩左心室重塑［3］。但另外一項隨訪3年的臨床試驗結果顯示，補充維生素D并不能降低HFrEF患者的全因死亡率，反而會增加其心臟支架置入風險［4］。筆者所在課題組進行的系統評價結果顯示，維生素D未能改善HFrEF患者的心功能及降低其死亡率，分析原因可能與維生素D服用劑量不足/過量、合并用藥導致機體的25（OH）D及血鈣濃度不適宜有關［5］。為了減少生活習慣、合并疾病、口服藥物等因素的影響，最大限度地了解不同劑量維生素D對心臟結構、功能的影響，本實驗通過分析不同劑量維生素D3對腹主動脈壓力過負荷大鼠心臟結構、功能的影響，探討維生素D3-25（OH）D-心臟結局之間的量效關系，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗時間 本實驗時間為2021年6月。

1.2 實驗動物及分組 選取健康雄性Wistar大鼠60只，8～10周齡，體質量160～200 g，購自西安交通大學實驗動物中心，并通過西安交通大學醫學部動物實驗倫理審查，適應性喂養3 d。采用隨機數字表法將大鼠分為安慰劑組（A組）、小劑量組（B組）、中等劑量組（C組）、大劑量組（D組），每組15只。四組大鼠均采用腹主動脈縮窄術制備腹主動脈壓力過負荷模型，具體如下：采用1%戊巴比妥鈉（40 mg/kg）腹腔注射以麻醉大鼠，采用電熱毯保暖，在大鼠左上腹做一切口，充分暴露腹主動脈，在雙腎動脈上方0.5 cm處將8號針頭與腹主動脈共同結扎，拔出針頭，造成腹主動脈管腔環形縮窄50%～60%。術后每天肌肉注射青霉素10萬U，連續注射3 d。術后按照Sharma方法進行換算［6］，四組大鼠分別給予安慰劑、小劑量維生素D3（84 U/kg）、中等劑量維生素D3（420 U/kg）、大劑量維生素D3（2 100 U/kg）進行灌胃。灌胃方法：將400 U維生素D3置于1 ml花生油中進行稀釋，按照大鼠分組情況抽取含有相應劑量維生素D3的花生油，再抽取純花生油至2 ml，進行灌胃，1次/d，連續灌胃8周。

1.3 觀察指標

1.3.1 一般情況 觀察四組大鼠進食及活動耐量情況。

1.3.2 超聲心動圖檢查指標 灌胃8周后，所有大鼠進行超聲心動圖檢查，所用儀器為飛利浦Epiq7C超聲診斷儀。取胸骨旁左心室長軸切面，將取樣線置于乳頭肌水平，探頭頻率為5.0～11.5 MHz。經左心室長軸獲得標準二維圖像后改為M型模式，然后測量室間隔厚度（interventricular septal thickness，IVST）、左心室后壁厚度（left ventricular posterior wall thickness，LVPWT）、左心室收縮末期內徑（left ventricular endsystolic diameter，LVESD）、左心室舒張末期內徑（left ventricular end-diastolic diameter，LVEDD）和左心室射血分數（left ventricular ejection fraction，LVEF）。以上指標均連續測量3個心動周期并取平均值。

1.3.3 實驗室檢查指標 灌胃8周后，四組大鼠均禁食不禁水10 h，于尾靜脈取血，采用鄰甲酚酞絡合銅法測定血清鈣水平，采用磷鉬酸鹽法測定血清磷水平，所用儀器為全自動生化分析儀（美國貝克曼公司）；采用電化學免疫發光法測定血清25（OH）D水平，所用儀器為COBAS e601電發光免疫分析儀（瑞士羅氏公司）；采用酶聯免疫吸附試驗測定血清N末端腦鈉肽前體（N-terminal pro-brain natriuretic peptide，NT-proBNP）水平。

1.4 統計學方法 采用SPSS 19.0統計學軟件進行數據處理。計量資料以（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗（方差齊）或Dunnett's T3檢驗（方差不齊）。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 一般情況 術中及術后共7只大鼠死亡，其中A組死亡2只、B組死亡2只、C組死亡1只、D組死亡2只。四組大鼠進食及活動耐量均無明顯差異。

2.2 超聲心動圖檢查指標 灌胃8周后，四組大鼠IVST、LVPWT、LVESD、LVEDD、LVEF比較，差異有統計學意義（P＜0.05）；B組大鼠IVST、LVPWT、LVESD、LVEDD小于A組，差異有統計學意義（P＜0.05）；C組大鼠IVST和LVEDD大于B組，LVPWT、LVESD、LVEDD小于A組，差異有統計學意義（P＜0.05）；D組大鼠IVST、LVPWT、LVESD、LVEDD大于A、B、C組，LVEF低于B、C組，差異有統計學意義（P＜0.05），見表1。灌胃8周后，四組大鼠LVEF均＜50%，提示四組大鼠符合HFrEF的LVEF改變。

表1 四組大鼠灌胃8周后超聲心動圖檢查指標比較（±s）Table 1 Comparison of echocardiographic examination indicators in four groups after 8 weeks of gavage

表1 四組大鼠灌胃8周后超聲心動圖檢查指標比較（±s）Table 1 Comparison of echocardiographic examination indicators in four groups after 8 weeks of gavage

注：A組為安慰劑組，B組為小劑量組，C組為中等劑量組，D組為大劑量組；IVST=室間隔厚度，LVPWT=左心室后壁厚度，LVESD=左心室收縮末期內徑，LVEDD=左心室舒張末期內徑，LVEF=左心室射血分數；a表示與A組比較，P＜0.05；b表示與B組比較，P＜0.05；c表示與C組比較，P＜0.05

LVEF（%）A組133.34±0.06 3.15±0.07 5.81±0.10 7.16±0.1038.8±2.9 B組133.20±0.08a 2.94±0.10a 5.57±0.11a 6.97±0.12a40.7±3.2 C組143.29±0.08b 3.01±0.12a 5.66±0.09a 7.06±0.12ab 40.8±2.1 D組13 3.45±0.12abc 3.25±0.08abc 5.91±0.11abc 7.26±0.07abc 36.4±2.9bc F值18.3321.7024.8117.326.69 P值＜0.01＜0.01＜0.01＜0.01＜0.01組別 只數IVST（mm）LVPWT（mm）LVESD（mm）LVEDD（mm）

2.3 實驗室檢查指標 灌胃8周后，四組大鼠血清磷水平比較，差異無統計學意義（P＞0.05）；四組大鼠血清鈣、25（OH）D、NT-proBNP水平比較，差異有統計學意義（P＜0.05）。灌胃8周后，B、C、D組大鼠血清鈣、25（OH）D水平高于A組，C、D組大鼠血清鈣、25（OH）D水平高于B組，D組大鼠血清鈣、25（OH）D水平高于C組，差異有統計學意義（P＜0.05）。灌胃8周后，B、C組大鼠血清NT-proBNP水平低于A、D組，差異有統計學意義（P＜0.05），見表2。

表2 四組大鼠灌胃8周后實驗室檢查指標比較（±s）Table 2 Comparison of laboratory examination indexes in four groups after 8 weeks of gavage

表2 四組大鼠灌胃8周后實驗室檢查指標比較（±s）Table 2 Comparison of laboratory examination indexes in four groups after 8 weeks of gavage

注：25（OH）D=25羥維生素D，NT-proBNP=N末端腦鈉肽前體；a表示與A組比較，P＜0.05；b表示與B組比較，P＜0.05；c表示與C組比較，P＜0.05

組別只數鈣（mmol/L） 磷（mmol/L） 25（OH）D（nmol/L） NT-proBNP（ng/L）A組 133.94±0.123.04±0.1226.58±7.38711.00±97.42 B組 13 3.95±1.29a2.99±0.1756.54±7.31a583.92±65.40a C組 14 4.06±0.09ab3.01±0.17160.17±11.57ab564.08±56.01a D組 13 4.27±0.15abc 3.04±0.13505.73±18.56abc771.27±83.50bc F值17.631.404 424.3819.81 P值＜0.010.25＜0.01＜0.01

3 討論

現有證據表明，低水平維生素D可能通過多種途徑引起HFrEF患者心肌重塑、炎癥反應及心功能惡化，如低水平維生素D可刺激腎素表達，激活腎素-血管緊張素-醛固酮系統［7］；其還會繼發甲狀旁腺功能亢進，而甲狀旁腺功能亢進是心力衰竭患者心血管事件及全因死亡風險增加的獨立危險因素［8］；此外，維生素D還會通過下調核因子κB表達而抑制促炎因子的表達，進而抑制IL-6、IL-12、干擾素、腫瘤壞死因子的表達［9］。動物實驗結果顯示，1，25-二羥基維生素D（維生素D的活性形式）可有效下調腎素的表達［10］。此外，在維生素D受體（vitamin D receptor，VDR）缺失的小鼠或維生素D缺乏的大鼠體內腎素表達水平明顯升高，且其與高血壓、心肌肥厚和心力衰竭的發生有關［10-11］。研究表明，低水平25（OH）D與心血管疾病發生風險升高相關［12］。但也有研究顯示，25（OH）D水平與心血管事件發生率呈U型曲線關系，即25（OH）D過低或過高均會導致心血管事件的發生［13］。

《維生素D及其類似物臨床應用共識》［14］指出，對于維生素D缺乏高風險人群，其維生素D最高耐受劑量為10 000 U/d。本研究為了分析維生素D3-25（OH）D-心臟結局之間的量效關系，選擇了劑量范圍較大的維生素D3（其中B、C、D組維生素D3補充劑量約等同于人維生素D3劑量的800 U/d、4 000 U/d、20 000 U/d），結果顯示，灌胃8周后，B組大鼠IVST、LVPWT、LVESD、LVEDD小于A組；C組大鼠IVST和LVEDD大于B組，LVPWT、LVESD、LVEDD小于A組；D組大鼠IVST、LVPWT、LVESD、LVEDD大于A、B、C組，LVEF低于B、C組；B、C組大鼠LVEF與A組比較無統計學差異，但其血清NT-proBNP水平低于A、D組。上述研究結果提示維生素D3與左心室功能、結構改變呈U型曲線關系。《維生素D及其類似物臨床應用共識》［14］推薦，維持骨骼健康的循環25（OH）D水平應為75 nmol/L（30 μg/L）。ZHOU等［15］研究指出，人們的最初心血管疾病風險是隨著25（OH）D水平升高而急劇下降的，并穩定在50 nmol/L左右。本研究結果顯示，B組大鼠平均25（OH）D水平為56.54 nmol/L，高于A組，該組大鼠心臟結構和功能明顯改善；C組大鼠平均25（OH）D水平為160.17 nmol/L，高于B組，但該組大鼠較B組心臟結構和功能改善并不明顯；D組大鼠平均25（OH）D水平為505.73 nmol/L，高于A、B、C組，但該組大鼠心臟結構及功能反而出現了惡化表現。

綜上所述，維生素D3補充劑量與腹主動脈壓力過負荷大鼠心臟結構、功能改變呈U型曲線關系，即補充小劑量維生素D3能減輕壓力過負荷大鼠心臟結構、功能惡化，而補充大劑量維生素D3反而促進了腹主動脈壓力過負荷大鼠心臟結構、功能的惡化。該研究提示在臨床工作中，應定期監測患者25（OH）D及血鈣水平，既要保證患者維生素D水平達標，也應避免過量補充維生素D。但本研究觀察時間較短，且未細化維生素D的補充劑量，尚不能明確導致心臟出現不良反應的25（OH）D水平截點。

作者貢獻：王婷、趙玉蘭進行文章的構思與設計；王婷、付建莉、張雪梅進行研究的實施與可行性分析；付建莉、張雪梅、趙媛進行數據收集、整理、分析；王婷、張雪梅進行結果分析與解釋；王婷負責撰寫、修訂論文；張雪梅負責文章的質量控制及審校，對文章整體負責、監督管理。

本文無利益沖突。