鋅指蛋白ZBTB20 敲低的血管平滑肌細胞穩轉株的構建及鑒定

趙倩，陳玉霞，王平，任安經，宋金超

研究表明，鋅指蛋白ZBTB20在大腦［1］、肝臟、胰腺、骨骼肌［2］、免疫系統［3］等多個器官/系統中廣泛表達，其是調節神經［4］、內分泌、消化［5］和骨骼肌發育及糖脂代謝穩態的關鍵轉錄因子，其缺乏可導致個體發育障礙［6］、糖尿病［7-8］和智力障礙［9］等。筆者所在課題組前期研究發現，ZBTB20在心血管系統中呈高表達，ZBTB20敲除小鼠心率無明顯異常，但會出現低血壓，導致心臟、左心室壁厚度和心肌細胞明顯縮小，分析原因可能與體質量下降有關；再者，ZBTB20敲除小鼠的心臟收縮能力明顯受損，線粒體功能相關基因（包括Hspb8、Ckmt2、Cox7a1、Tfrc和Ogdhl等）表達明顯降低［10］，推測ZBTB20在心臟發育、能量代謝和心臟收縮能力方面起著重要作用。本研究擬構建ZBTB20干擾慢病毒載體，然后用其感染人肺動脈平滑肌細胞（human pulmonary artery smooth muscle cells，HPASMCs）以構建ZBTB20敲低的血管平滑肌細胞穩轉株，并觀察ZBTB20敲低對HPASMCs增殖和遷移的影響，以期為進一步研究ZBTB20在心血管系統尤其是血管中的生物學功能提供細胞模型。

1 材料與方法

1.1 實驗時間 實驗時間為2022-04-18至2022-11-29。

1.2 主要試劑與儀器 polybrene〔漢恒生物科技（上海）有限公司〕，嘌呤霉素（Sigma），DMEM培養基（Corning），胎牛血清（Gemini），磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered solution，PBC）（Cytiva），反轉錄試劑盒（Toyobo），PVDF膜（Merck millipore），pHBLV-U6-puro載體〔漢恒生物科技（上海）有限公司〕，Lipofectamine 3000試劑（Invitrogen），PowerUpTMSYBRTMGreen Master Mix試劑（Applied Biosystems），CCK-8試劑盒（同仁化學研究所），ECL化學發光超敏顯色試劑盒（中國Yeasen生物科技股份有限公司），封閉試劑（羅氏公司），天能EPS600電泳儀（上海天能科技公司），超靈敏化學發光成像儀（GE Healthcare Life Science），臺式高速大容量冷凍離心機5810R（Eppendorf），熒光顯微鏡（OLYMPUS公司），熒光定量PCR儀（Eppendorf）。

1.3 構建方法

1.3.1 細胞培養 HPASMCs購自美國Sciencell，采用含10%胎牛血清的DMEM培養基，于37 ℃、5% CO2孵箱中培養。

1.3.2 ZBTB20干擾慢病毒載體構建 設計合成針對ZBTB20基因的短發卡RNA（short hairpin RNA，shRNA）并退火以產生dsDNA，隨后將dsDNA與經AgeⅠ和EcoR Ⅰ雙酶切后的pHBLV-U6-puro載體連接。將連接產物轉入感受態細胞TOP10進行擴增，之后將細胞涂板并于37 ℃環境下培養、過夜，挑取單克隆菌落并將其接種于有氨芐霉素抗性的LB培養液中，恒溫（37 ℃）搖床、培養過夜。采用質粒小量抽提試劑盒提取質粒，得到ZBTB20干擾慢病毒載體——pHBLVZBTB20 shRNA并測序鑒定。

1.3.3 ZBTB20干擾慢病毒包裝 將293T細胞接種于6 cm培養皿中，細胞密度約為60%。培養24 h后，根據Lipofectamine 3000試劑說明書配制載體-脂質體混合液，其中pHBLV-ZBTB20 shRNA∶包裝質粒pSPAX2∶包膜質粒pMD2.G為4∶3∶1，載體與脂質體的比例為1 μg∶3 μl。將載體-脂質體混合液于室溫孵育20 min，之后加入細胞中繼續孵育6 h，更換培養基（DMEM+5% FBS）。轉染48 h后收集ZBTB20干擾慢病毒的上清液，于4 ℃環境下離心5 min（2 000 r/min，離心半徑10 cm），采用0.45 μm濾器過濾，分裝保存于-80 ℃冰箱中備用。

1.3.4 ZBTB20敲低的血管平滑肌細胞穩轉株的構建將HPASMCs接種于6 cm培養皿中，次日感染前細胞密度達到40%～50%，棄去細胞培養液。分別加入含8 μg/ml polybrene和0.5 ml ZBTB20干擾慢病毒上清液的無血清培養液3 ml（實驗組）和含8 μg/ml polybrene和0.5 ml含無意義干擾序列的慢病毒的無血清培養液3 ml（陰性對照組）后晃勻，室溫下離心30 min（1 000×g），37 ℃孵育過夜，之后更換新鮮培養液。48 h后，加入含1.5～3.0 μg/ml嘌呤霉素的新鮮完全培養液以篩選存活細胞。同時設置加入不含慢病毒的無血清培養液的HPASMCs作為空白對照組，同樣加入含1.5～3.0 μg/ml嘌呤霉素的新鮮完全培養液。以空白對照組HPASMCs全部死亡為截點，觀察實驗組和陰性對照組中存活的HPASMCs即為轉染成功的HPASMCs。之后以含0.5 μg/ml嘌呤霉素的新鮮完全培養液維持篩選1周。

1.4 鑒定方法

1.4.1 熒光定量PCR 兩組細胞均進行熒光定量PCR，具體步驟如下：（1）設計合成ZBTB20引物，其正向引物：5'-GCAGCCGGCAGCCCCTTCTTC-3'，反向引物：5'-CGCTCGCCGCTGCCATTCTG-3'。（2）制備cDNA：提取細胞總RNA，采用紫外分光光度計檢測RNA濃度和純度，制備總RNA并將其放入-80 ℃環境下保存備用。（3）合成cDNA：第一步，去除總RNA內的DNA；第二步，阻止DNA酶的反應，加入EDTA 1 μl，65 ℃環境下孵育10 min；第三步，采用反轉錄試劑盒進行反轉錄以獲得cDNA。然后將合成的cDNA加入10 mmol/L Tris-HCl緩沖液（pH=8.0）80 μl，置于-20 ℃環境下保存備用。（4）熒光定量PCR：10 μl反應體系包括PowerUpTMSYBRTMGreen Master Mix 5.000 μl、雙蒸水3.250 μl、cDNA模板1.500 μl、正向引物（10 pmol/μl）0.125 μl、反向引物（10 pmol/μl）0.125 μl。使用熒光定量PCR儀進行檢測，以β-actin為內參，采用2-ΔΔCt法計算ZBTB20 mRNA的相對表達量。實驗獨立重復3次。

1.4.2 Western blot法 分別在6孔板上培養兩組細胞，然后采用8 mol/L尿素蛋白裂解液進行裂解，將蛋白樣品與SDS混合物進行電泳并轉至PVDF膜上，將PVDF膜洗滌后加入5%脫脂奶粉，室溫搖床封閉1 h，4 ℃環境下孵育ZBTB20 抗體過夜，洗膜后室溫孵育二抗1 h。采用TBST洗滌3次后加入顯影液，采用FUJIFILM LAS-4000發光檢測儀進行曝光，采用Image Reader LAS-4000軟件測量ZBTB20灰度值，以GAPDH為內參，計算ZBTB20相對表達量，ZBTB20相對表達量=ZBTB20灰度值/GAPDH灰度值。實驗獨立重復3次。

1.4.3 免疫組化試驗 在兩個24孔板中放入爬片，分別接種兩組細胞，每孔104個細胞，然后放入培養箱中過夜，當爬片上的細胞長到50%時采用PBS漂洗3次，之后加入2%多聚甲醛，室溫搖床固定8 min，采用PBS沖洗3次。置于0.5% triton中室溫搖床25 min，采用PBS沖洗3次后將爬片置于blocking液〔1×TNB（牛血清白蛋白0.250 g+明膠0.050 g+脫脂奶粉0.025 g溶于Tris緩沖鹽溶液，定容至50 ml）+5%山羊血清+0.5%封閉試劑〕中，放入37 ℃培養箱內孵育30 min。然后將爬片置于ZBTB20一抗（1∶2 000）中，4 ℃搖床過夜（16 h），次日采用PBS 沖洗5 次后加二抗（1 ∶500）孵育30 min。采用DAPI對細胞核進行染色，采用甘油封固，在熒光顯微鏡下拍照。實驗獨立重復3次。

1.5 細胞增殖實驗 （1）細胞計數：分別將兩組細胞接種到96孔板上，500個/孔，感染后連續5 d細胞處于對數生長期，經過消化、常溫離心（離心半徑10 cm，2 000 r/min，離心時間4 min）、PBS清洗和無血清培養基重懸后，進行細胞計數。（2）CCK8法：分別將兩組細胞接種在96孔板上，每孔500個細胞（100 μl細胞懸液），感染后第1、2、3、4、5天每孔加入10 μl CCK8試劑，在孵箱繼續孵育2 h后使用酶標儀檢測細胞在450 nm處的OD值。實驗獨立重復3次。

1.6 細胞遷移實驗 鋪板前采用marker筆細頭在6孔板底部畫5條橫線。分別將兩組細胞消化后計數，按照1.5×105/孔的密度將其接種于6孔板中，采用含2.5%FBS的DMEM培養基培養，待細胞生長至70%～80%時吸棄培養基，用200 μl槍頭垂直于孔板從上劃到下方，左中右劃三條，采用PBS漂洗2遍以沖洗脫落細胞，然后加入培養基，在劃痕后0、8、24、48 h分別拍照，采用Image J軟件測量劃痕面積，然后計算劃痕愈合面積百分比，劃痕愈合面積百分比=（初始劃痕面積-目標時間劃痕面積）/初始劃痕面積×100%。實驗獨立重復3次。

1.7 統計學方法 應用SPSS 21.0統計學軟件進行數據處理。計量資料以（±s）表示，兩組間比較采用成組t檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 測序鑒定結果 測序鑒定結果顯示，重組載體插入的片段序列與設計合成的pHBLV-ZBTB20 shRNA的序列一致，說明重組載體構建成功，見圖1。

圖1 pHBLV-ZBTB20 shRNA測序鑒定結果Figure 1 Sequencing identification results of pHBLV-ZBTB20 shRNA

2.2 ZBTB20敲低的血管平滑肌細胞穩轉株的構建ZBTB20干擾慢病毒感染HPASMCs后，加入含3 μg/ml嘌呤霉素的新鮮完全培養液，48 h后幾乎所有細胞死亡；之后將嘌呤霉素含量降至1.5 μg/ml，48 h后觀察到部分細胞存活；在此基礎上，對感染細胞離心30 min（1 000×g）以增加細胞的感染機會，同樣加入含1.5 μg/ml嘌呤霉素的新鮮完全培養液，48 h后觀察發現大部分細胞存活。

2.3 ZBTB20敲低的血管平滑肌細胞穩轉株的鑒定 熒光定量PCR結果顯示，實驗組ZBTB20 mRNA相對表達量為（0.19±0.02），低于陰性對照組的（1.00±0.08），差異有統計學意義（t=9.731，P＜0.001）。Western blot法結果顯示，實驗組ZBTB20為（8.62±1.63），低于陰性對照組的（131.60±6.86），差異有統計學意義（t=5.271，P＜0.001），見圖2。免疫組化試驗結果顯示，ZBTB20在陰性對照組的細胞核內高度表達，而在實驗組的細胞核內無明顯表達，表明ZBTB20敲低的血管平滑肌細胞穩轉株構建成功，見圖3。

圖2 兩組ZBTB20蛋白表達的電泳圖Figure 2 Electrophoretogram of ZBTB20 protein expression of the two groups

圖3 兩組免疫組化試驗結果（DAPI染色，×200）Figure 3 Immunohistochemical test results of the two groups

2.4 ZBTB20敲低對HPASMCs增殖、遷移的影響 感染后第1天，兩組細胞計數比較，差異無統計學意義（P＞0.05）；感染后第2～5天，實驗組細胞計數少于對照組，差異有統計學意義（P＜0.05），見表1。感染后第1天，兩組OD值比較，差異無統計學意義（P＞0.05）；感染后第2～5天，實驗組OD值低于陰性對照組，差異有統計學意義（P＜0.05），見表2。感染后8、24 h，兩組劃痕愈合面積百分比比較，差異無統計學意義（P＞0.05）；感染后48 h，實驗組劃痕愈合面積百分比低于陰性對照組，差異有統計學意義（P＜0.05），見表3。

表1 兩組感染后不同時間細胞計數比較（±s，n=3，個）Table 1 Comparison of cell counts between the two groups at different time after infection

表1 兩組感染后不同時間細胞計數比較（±s，n=3，個）Table 1 Comparison of cell counts between the two groups at different time after infection

組別感染后第1天 感染后第2天 感染后第3天 感染后第4天 感染后第5天陰性對照組500±02 050±238 2 300±2002 800±634 050±266實驗組500±01 300±188 1 800±110 2 300±241 2 500±167 t值02.4932.1932.0084.939 P值 1.0000.0320.0460.0490.006

表2 兩組感染后不同時間OD值比較（±s，n=3）Table 2 Comparison of OD values between the two groups at different time after infection

表2 兩組感染后不同時間OD值比較（±s，n=3）Table 2 Comparison of OD values between the two groups at different time after infection

組別感染后第1天 感染后第2天 感染后第3天 感染后第4天 感染后第5天陰性對照組 0.274±0.024 0.389±0.033 0.489±0.063 0.713±0.091 1.059±0.210實驗組0.253±0.019 0.302±0.006 0.418±0.034 0.528±0.045 0.832±0.164 t值 1.92414.5703.3359.0345.925 P值0.127＜0.0010.029＜0.0010.004

表3 兩組感染后不同時間劃痕愈合面積百分比比較（±s，n=3，%）Table 3 Comparison of the percentage of scratch healing area between the two groups at different time after infection

表3 兩組感染后不同時間劃痕愈合面積百分比比較（±s，n=3，%）Table 3 Comparison of the percentage of scratch healing area between the two groups at different time after infection

組別感染后8 h感染后24 h感染后48 h陰性對照組28.91±8.0646.07±4.7866.84±8.41實驗組31.22±6.9040.81±4.8153.40±8.22 t值 0.5751.3443.021 P值0.5760.2500.011

3 討論

ZBTB20由741個編碼氨基酸組成，其N端含有POZ結構域，C端含有5個C2H2鋅指結構域，且與已知的POZ鋅指蛋白BCL6和PLZF有30%～40%的同源性［11］。近年ZBTB20的生物學功能被不斷發現，如其可以調節肝臟脂質生成［12］、通過調節表皮因子生長受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）表達和肝細胞增殖而調節小鼠肝臟再生［13］、通過抑制肝細胞中脂蛋白脂肪酶基因的轉錄而調節血漿三酰甘油代謝［14］。此外，神經系統、三叉神經節傷害性神經元中的ZBTB20還可以介導瘙癢感受［15］，且其對哺乳動物新皮質中胼胝體投射神經元和星形膠質細胞亞群的分化至關重要［10］。

研究表明，ZBTB20基因的雜合突變可引起Primrose綜合征，其臨床表現包括可識別的面部特征、大頭畸形、智力低下、外耳增大和鈣化、體毛稀疏和遠端肌肉萎縮［9］。筆者所在課題組前期研究發現，ZBTB20全身敲除小鼠會出現低血壓、心功能降低［11］。LI等［16］研究發現，在結扎冠狀動脈前降支引起的心肌梗死模型中，ZBTB20過表達可以縮小心肌梗死面積、改善心功能，其機制與抑制ASK1/JNK1/2信號通路有關。TAO等［17］研究發現，ZBTB20在人動脈粥樣硬化斑塊中表達增加，其可以正向調節氧化型低密度脂蛋白誘導的動脈粥樣硬化斑塊中巨噬細胞的氧化應激、線粒體裂變和炎癥反應。本研究結果顯示，ZBTB20在陰性對照組的細胞核內高度表達，故推測ZBTB20在血管平滑肌細胞生理功能維持中具有潛在作用。

慢病毒載體較反轉錄病毒載體有更廣的宿主范圍，其能產生表達shRNA的高滴度慢病毒，并在周期性和非周期性細胞、干細胞、受精卵及分化的后代細胞中表達shRNA［18］。本實驗構建了pHBLV-ZBTB20 shRNA，獲得了ZBTB2干擾慢病毒，并通過感染HPASMCs成功構建了ZBTB20敲低的血管平滑肌細胞穩轉株。

PASMCs位于肺血管結構的中層，是構成肺動脈管壁的主要細胞。研究表明，肺動脈重構主要由PASMCs異常生長、過度增殖和凋亡減少引起，而抑制PASMCs增殖或誘導其凋亡是治療肺動脈高壓（pulmonary hypertension，PH）的有效策略［19-20］。因此，深入挖掘調控PASMCs增殖的分子機制對于臨床治療PH等心血管疾病具有重要意義。本研究結果顯示，感染后第2～5天，實驗組細胞計數少于對照組，OD值低于陰性對照組；感染后48 h，實驗組劃痕愈合面積百分比低于陰性對照組，提示ZBTB20敲低后HPASMCs的增殖和遷移能力明顯受到抑制，這為下一步研究ZBTB20在血管功能及其作為PH的潛在靶點奠定了基礎。

綜上所述，本實驗成功構建了ZBTB20敲低的血管平滑肌細胞穩轉株，且ZBTB20敲低后HPASMCs的增殖和遷移能力明顯受到抑制。

作者貢獻：趙倩、任安經、宋金超進行文章的構思與設計，研究的實施與可行性分析；趙倩、王平進行數據收集、整理、分析；趙倩、陳玉霞進行結果分析與解釋；趙倩、任安經負責撰寫、修訂論文；宋金超負責文章的質量控制及審校，并對文章整體負責、監督管理。

本文無利益沖突。