垂體腺瘤患者Delta 樣蛋白1 同源物、母系表達基因3、母系表達基因8 基因表達水平及其臨床意義研究

吳煒，劉永亮，王彥，董曉柳，張利，馬思偉，張歡，高華，董偉

垂體腺瘤是起源于鞍內垂體前葉的腫瘤，是最常見的顱內腫瘤之一，根據臨床癥狀可分為功能性腺瘤和無功能腺瘤［1］，其中功能性腺瘤又可分為生長激素（growth hormone，GH）腺瘤、泌乳素瘤、促腎上腺皮質激素（adrenocorticotropic hormone，ACTH）腺瘤。《2022年世界衛生組織垂體腺瘤/垂體神經內分泌腫瘤分類概述》［2］提出了細胞譜系概念，認為垂體腺瘤主要分為PIT1譜系、類固醇激素因子1（steroidogenic factor 1，SF-1）譜系和T盒轉錄因子19（T-box transcription factor 19，TPIT）譜系。除PIT1起源的泌乳素瘤外，其他功能性腺瘤（GH腺瘤和ACTH腺瘤）的藥物治療效果不佳，因此探討垂體腺瘤的發生發展機制，對其臨床治療具有重要意義［3］。

Delta樣蛋白1同源物（Delta like non-canonical Notch ligand 1，DLK1）/母系表達基因（maternally expressed gene，MEG）3基因座位于14號染色體32.2區域，其包含3個蛋白編碼基因（即DLK1、反轉錄轉座子1、脫碘酶3基因）和大量母系表達的長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，lncRNA）（包括lncRNA MEG3和超過50個miRNA的集群）［4］。文獻報道，DLK1/MEG3基因座在細胞分化和組織發育中發揮著重要作用，其可參與機體多種病理生理學過程［5］。研究顯示，與野生型小鼠相比，過表達DLK1的轉基因小鼠垂體GH分泌增加、胰島素抵抗者占比升高；此外，過表達DLK1基本不影響垂體泌乳素和ACTH的分泌［6］。MEG3和MEG8在不同亞型垂體腺瘤中呈差異表達，二者均具有抑制腫瘤生長的作用［7-8］。本研究旨在分析垂體腺瘤患者DLK1、MEG3、MEG8基因表達水平及其臨床意義，以期為垂體腺瘤患者的臨床診療提供理論依據。

1 對象與方法

1.1 研究對象 選取2015年6月至2019年12月于唐山市人民醫院行手術切除的垂體腺瘤患者92例為研究對象。納入標準：（1）年齡≥18歲；（2）伴有頭痛、視力下降、視野缺損等垂體腺瘤的典型臨床癥狀，MRI檢查顯示T1WI和T2WI低信號，強化明顯，經病理檢查診斷為垂體腺瘤；（3）原發性腫瘤。排除標準：（1）合并其他腫瘤者；（2）合并嚴重的呼吸、循環系統疾病者；（3）合并其他類型代謝疾病者；（4）合并認知障礙或精神類疾病者；（5）入院1個月內參與其他臨床試驗者。本研究獲得唐山市人民醫院倫理委員會批準（審批號：RMYY-LLKS-2020-013），所有患者或家屬簽署知情同意書。

1.2 研究方法

1.2.1 一般資料收集 收集患者一般資料，包括性別、年齡、腫瘤體積、腫瘤增殖狀態（Ki67指數≥3%為高增殖，＜3%為低增殖）、腫瘤侵襲性（Knosp分級Ⅲ～Ⅳ級為侵襲性生長，Knosp分級Ⅰ～Ⅱ級為非侵襲性生長）、病理類型（分為GH腺瘤和無功能腺瘤）。

1.2.2 RT-qPCR法檢測腫瘤組織DLK1、MEG3、MEG8、POU類1同源框1（POU class 1 homeobox 1，POU1F1）、類固醇生成因子1（steroidogenic factor 1，SF-1）基因表達水平 RNA抽提試劑盒購自凱杰企業管理（上海）有限公司，反轉錄試劑盒和實時熒光定量PCR試劑盒購自美國Thermo Fisher Scientific。取10 mg左右腫瘤組織標本，利用一步法提取細胞總RNA，反轉錄合成cDNA；以cDNA為模板進行實時熒光定量PCR。PCR擴增條件為：50 ℃ 20 min，95 ℃ 10 min、95 ℃10 s、60 ℃ 1 min，共40個循環。引物由北京合生基因科技有限公司合成，引物序列如下：DLK1正向引物為5′-ACGAGTGCTGTACATGACCA-3′，反向引物為5′-GGCTCTCTCTGACTGACACA-3′；MEG3正向引物為5′-TCTTCAAGGAGGTCACGGAC-3′，反向引物為5′-GGACACATCAAATCGCTGCT-3′；MEG8正向引物為5′- GGGCCCTGTTAGTCTGACTT-3′，反向引物為5′-CAAAGTCAGACCCAGGCAAC-3′；POU1F1正向引物為5′-TCCTGACCACACCTTGAGTC-3′，反向引物為5′-GCCTCCCCAACATTTGTCTG-3′；SF-1正向引物為5′- TCTGAGTACCCGGAGCCTTA-3′，反向引物為5′-TGGAGATGAAGGTCTGGTCG-3′；內參GAPDH正向引物為5′-CCAAGGAGTAAGACCCCTGG-3′，反向引物為5′-TGGTTGAGCACAGGGTACTT-3′。采用2-ΔΔCt法計算目標基因表達水平。

1.2.3 免疫組織化學染色檢測腫瘤組織GH、PIT1、SF-1表達情況 采用10%中性甲醛固定腫瘤組織，進行梯度乙醇脫水、二甲苯透明、常規石蠟包埋、連續切片（5 μm），將切片置于60 ℃的烤箱烤1 h，梯度脫蠟，抗原修復后采用羊血清封閉30 min，滴加GH、PIT1、SF-1一抗（購自英國Abcam公司），4 ℃孵育過夜，PBS洗3次，加入二抗（購自北京中杉金橋生物技術有限公司）室溫孵育1 h，PBS洗3次，采用DAB顯色試劑盒（購自北京中杉金橋生物技術有限公司）顯色后用自來水沖洗，進行蘇木素復染、梯度脫水、二甲苯透明、中性樹膠封固，于顯微鏡下觀察染色情況，以細胞內出現棕色和棕褐色染色顆粒為陽性。隨機挑選5個高倍（×400）視野，統計陽性細胞數量和細胞總數。結果判斷標準：（1）陰性：陽性細胞占比≤1%；（2）弱陽性：1%＜陽性細胞占比≤5%；（3）陽性：陽性細胞占比＞5%。

1.2.4 ELISA檢測血清GH、胰島素樣生長因子1（insulin like growth factor 1，IGF-1）水平 采集患者空腹靜脈血0.5 ml，3 000 r/min離心5 min（離心半徑13.5 cm），采用移液器取10 μl血清，按照ELISA試劑盒說明書進行操作，檢測GH、IGF-1水平。

1.3 統計學方法 采用SPSS 19.0軟件進行數據分析。符合正態分布的計量資料以（±s）表示，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗；不符合正態分布的計量資料以M（P25，P75）表示，組間比較采用非參數檢驗；計數資料以相對數表示，組間比較采用χ2檢驗，單向有序分類指標比較采用秩和檢驗；兩變量間的相關性分析采用Pearson相關分析。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 一般情況 92例垂體腺瘤患者中，男63例，女29例；年齡21～75歲，平均（50.7±1.2）歲；腫瘤體積0.04～155.30 cm3，平均（10.80±2.20）cm3；腫瘤高增殖28例，腫瘤低增殖64例；腫瘤侵襲性生長32例，腫瘤非侵襲性生長60例；病理類型：GH腺瘤28例，無功能腺瘤64例；腫瘤組織DLK1、MEG3、MEG8、POU1F1、SF-1基因表達水平分別為（0.077±0.015）、（0.066±0.017）、（0.010±0.002）、（0.331±0.060）、（0.125±0.014）；腫瘤組織GH表達情況：陽性25例，弱陽性3例，陰性64例；腫瘤組織PIT1表達情況：陽性27例，弱陽性20例，陰性45例；腫瘤組織SF-1表達情況：陽性63例，弱陽性14例，陰性15例；血清GH水平為（5.0±1.1）ng/ml；血清IGF-1水平為（266.5±31.1）ng/ml。

2.2 GH腺瘤與無功能腺瘤患者一般資料比較 GH腺瘤患者男性占比、年齡低于無功能腺瘤患者，差異有統計學意義（P＜0.05）；GH腺瘤與無功能腺瘤患者腫瘤體積、腫瘤高增殖者占比、腫瘤侵襲性生長者占比比較，差異無統計學意義（P＞0.05），見表1。

表1 GH腺瘤與無功能腺瘤患者一般資料比較Table 1 Comparison of general information between patients with GH adenomas and non-functioning adenoma

2.3 不同臨床特征垂體腺瘤患者腫瘤組織DLK1、MEG3、MEG8基因表達水平比較 男性垂體腺瘤患者腫瘤組織DLK1、MEG8基因表達水平低于女性垂體腺瘤患者，差異有統計學意義（P＜0.05）；男性與女性垂體腺瘤患者腫瘤組織MEG3基因表達水平比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。年齡≤52歲垂體腺瘤患者腫瘤組織DLK1基因表達水平高于年齡＞52歲垂體腺瘤患者，差異有統計學意義（P＜0.05）；年齡≤52歲與年齡＞52歲垂體腺瘤患者腫瘤組織MEG3、MEG8基因表達水平比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。不同腫瘤體積、腫瘤增殖狀態、腫瘤侵襲性垂體腺瘤患者腫瘤組織DLK1、MEG3、MEG8基因表達水平比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。GH腺瘤患者腫瘤組織DLK1、MEG3、MEG8基因表達水平高于無功能腺瘤患者，差異有統計學意義（P＜0.05），見表2。

表2 不同臨床特征垂體腺瘤患者腫瘤組織DLK1、MEG3、MEG8基因表達水平比較Table 2 Comparison of expression levels of DLK1，MEG3，and MEG8 gene in tumor tissues of patients with pituitary adenomas of different clinical characteristics

2.4 垂體腺瘤患者腫瘤組織DLK1、MEG3、MEG8基因表達水平與腫瘤組織POU1F1、SF-1基因表達水平的相關性 Pearson相關分析結果顯示，垂體腺瘤患者腫瘤組織DLK1、MEG3、MEG8基因表達水平與腫瘤組織POU1F1基因表達水平均呈正相關，與腫瘤組織SF-1基因表達水平均呈負相關（P＜0.05），見表3。

表3 垂體腺瘤患者腫瘤組織DLK1、MEG3、MEG8基因表達水平與腫瘤組織POU1F1、SF-1基因表達水平的相關性Table 3 Correlation between expression levels of DLK1，MEG3，and MEG8 gene in tumor tissue of pituitary adenoma patients and expression levels of POU1F1 and SF-1 gene in tumor tissue

2.5 不同腫瘤組織DLK1、MEG3、MEG8基因表達水平垂體腺瘤患者腫瘤組織GH、PIT1、SF-1表達情況比較 根據腫瘤組織DLK1、MEG3、MEG8基因表達水平的中位數，分別將患者分為DLK1基因高表達組（DLK1基因表達水平≥0.000 15，46例）和DLK1基因低表達組（DLK1基因表達水平＜0.000 15，46例）、MEG3基因高表達組（MEG3基因表達水平≥0.000 11，46例）和MEG3基因低表達組（MEG3基因表達水平＜0.000 11，46例）、MEG8基因高表達組（MEG8基因表達水平≥0.000 08，46例）和MEG8基因低表達組（MEG8基因表達水平＜0.000 08，46例）。DLK1基因高表達組與DLK1基因低表達組、MEG3基因高表達組與MEG3基因低表達組、MEG8基因高表達組與MEG8基因低表達組腫瘤組織GH、PIT1、SF-1表達情況比較，差異有統計學意義（P＜0.05）。DLK1基因低表達組腫瘤組織GH、PIT1陽性者占比及SF-1弱陽性、陰性者占比低于DLK1基因高表達組，GH、PIT1陰性者占比及SF-1陽性者占比高于DLK1基因高表達組，差異有統計學意義（P＜0.05）；MEG3基因低表達組腫瘤組織GH、PIT1陽性者占比及SF-1弱陽性、陰性者占比低于MEG3基因高表達組，GH、PIT1陰性者占比及SF-1陽性者占比高于MEG3基因高表達組，差異有統計學意義（P＜0.05）；MEG8基因低表達組腫瘤組織GH、PIT1陽性者占比及SF-1弱陽性、陰性者占比低于MEG8基因高表達組，GH、PIT1陰性者占比及SF-1陽性者占比高于MEG8基因高表達組，差異有統計學意義（P＜0.05），見表4～6。

表4 DLK1基因高表達組與DLK1基因低表達組腫瘤組織GH、PIT1、SF-1表達情況比較〔n（%）〕Table 4 Comparison of GH，PIT1，and SF-1 expression in tumor tissues between DLK1 gene high expression group and DLK1 gene low expression group

表5 MEG3基因高表達組與MEG3基因低表達組腫瘤組織GH、PIT1、SF-1表達情況比較〔n（%）〕Table 5 Comparison of GH，PIT1，and SF-1 expression in tumor tissues between MEG3 gene high expression group and MEG3 gene low expression group

表6 MEG8基因高表達組與MEG8基因低表達組腫瘤組織GH、PIT1、SF-1表達情況比較〔n（%）〕Table 6 Comparison of GH，PIT1，and SF-1 expression in tumor tissues between MEG8 gene high expression group and MEG8 gene low expression group

2.6 GH腺瘤患者腫瘤組織DLK1、MEG3、MEG8基因表達水平與血清GH、IGF-1水平的相關性 GH腺瘤患者血清GH、IGF-1水平分別為（4.4±1.0）ng/ml、（401.0±45.6）ng/ml。Pearson相關分析結果顯示，GH腺瘤患者腫瘤組織DLK1基因表達水平與血清GH水平呈正相關（P＜0.05），與血清IGF-1水平無直線相關關系（P＞0.05）；GH腺瘤患者腫瘤組織MEG3、MEG8基因表達水平與血清GH、IGF-1水平均無直線相關關系（P＞0.05），見表7。

表7 GH腺瘤患者腫瘤組織DLK1、MEG3、MEG8基因表達水平與血清GH、IGF-1水平的相關性Table 7 Correlation between the expression levels of DLK1，MEG3，MEG8 gene in tumor tissue and serum GH and IGF-1 levels in patients with GH adenoma

3 討論

基因組印跡指根據親本來源進行單等位基因表達的表觀遺傳現象，與早期胚胎發育、癌變和腫瘤易感性密切相關，是目前腫瘤研究的熱點之一［9］。在不同病理類型垂體腺瘤中，DLK1/MEG3基因座呈差異表達，且DLK1水平與GH水平有關［5］。在無功能腺瘤中，MEG3通過誘導細胞凋亡而發揮抑制腫瘤細胞增殖和侵襲的作用［10］。本研究旨在分析垂體腺瘤患者DLK1、MEG3、MEG8基因表達水平及其臨床意義。

本研究結果顯示，92 例垂體腺瘤患者腫瘤組織DLK1、MEG3、MEG8 基因表達水平分別為（0.077±0.015）、（0.066±0.017）、（0.010±0.002），均低于正常人群［11］。本研究結果還顯示，男性垂體腺瘤患者腫瘤組織DLK1、MEG8基因表達水平低于女性垂體腺瘤患者，提示DLK1、MEG8水平升高可能參與女性垂體腺瘤的發生。年齡≤52歲垂體腺瘤患者腫瘤組織DLK1基因表達水平高于年齡＞52歲垂體腺瘤患者，提示DLK1基因表達水平可能與年齡有關，其在高齡患者中降低。不同腫瘤體積、腫瘤增殖狀態、腫瘤侵襲性垂體腺瘤患者腫瘤組織DLK1、MEG3、MEG8基因表達水平比較，差異無統計學意義，提示DLK1、MEG3、MEG8基因表達水平可能與腫瘤體積、增殖狀態和侵襲性無關。

《2022年世界衛生組織垂體腺瘤/垂體神經內分泌腫瘤分類概述》［2］提出了細胞譜系概念，將垂體腺瘤定義為垂體神經內分泌腫瘤，指出其主要表現為垂體的良性增生，并根據轉錄因子水平將其重新分為三類七型。據報道，PIT1可促進垂體細胞向泌乳素細胞、GH細胞和促甲狀腺素細胞分化，而SF-1可促進垂體細胞向促性腺激素細胞分化，并與促性腺激素細胞腺瘤有關［2，12］。本研究結果顯示，垂體腺瘤患者腫瘤組織DLK1、MEG3、MEG8基因表達水平與腫瘤組織POU1F1基因表達水平均呈正相關，與腫瘤組織SF-1基因表達水平均呈負相關；DLK1基因低表達組腫瘤組織PIT1陽性者占比及SF-1弱陽性、陰性者占比低于DLK1基因高表達組，PIT1陰性者占比及SF-1陽性者占比高于DLK1基因高表達組；MEG3基因低表達組腫瘤組織PIT1陽性者占比及SF-1弱陽性、陰性者占比低于MEG3基因高表達組，PIT1陰性者占比及SF-1陽性者占比高于MEG3基因高表達組；MEG8基因低表達組腫瘤組織PIT1陽性者占比及SF-1弱陽性、陰性者占比低于MEG8基因高表達組，PIT1陰性者占比及SF-1陽性者占比高于MEG8基因高表達組；提示DLK1、MEG3、MEG8基因表達水平與垂體腺瘤轉錄因子的表達有關，即隨著DLK1、MEG3、MEG8基因表達水平的增加，轉錄因子POU1FA表達水平升高，SF-1表達水平降低。本研究結果還顯示，GH腺瘤患者腫瘤組織DLK1、MEG3、MEG8基因表達水平高于無功能腺瘤患者，筆者推測DLK1、MEG3、MEG8基因表達水平升高可促進垂體腺瘤細胞向PIT1譜系分化，臨床表現為GH腺瘤表型；其降低可促進垂體腺瘤細胞向SF-1譜系分化，臨床表現為無功能腺瘤表型。但本研究結果還顯示，GH腺瘤患者男性占比、年齡低于無功能腺瘤患者，這可能對本研究結果產生一定影響，尚需要大樣本量的研究進一步證實。

2021年2月《垂體協會肢端肥大癥診治指南》［13］更新版發布，其明確指出術后動態監測GH、IGF-1水平有助于了解疾病進展情況［14］。且研究顯示，GH-IGF軸中的GH與DLK1存在共定位［15］。本研究結果顯示，DLK1基因低表達組、MEG3基因低表達組、MEG8基因低表達組腫瘤組織GH陽性者占比分別低于DLK1基因高表達組、MEG3基因高表達組、MEG8基因高表達組，GH陰性者占比分別高于DLK1基因高表達組、MEG3基因高表達組、MEG8基因高表達組，提示DLK1、MEG3、MEG8基因表達水平升高可能促進垂體腺瘤腫瘤細胞中GH的合成。本研究Pearson相關分析結果顯示，GH腺瘤患者腫瘤組織DLK1基因表達水平與血清GH水平呈正相關，與既往研究結果［5］一致；GH腺瘤患者腫瘤組織DLK1基因表達水平與血清IGF-1水平無直線相關關系，GH腺瘤患者腫瘤組織MEG3、MEG8基因表達水平與血清GH、IGF-1水平均無直線相關關系，提示DLK1/MEG3基因座中的DLK1基因是調控GH分泌的關鍵基因，而MEG3、MEG8基因與GH分泌無關，且三者均對來源于肝臟的IGF-1釋放沒有影響，推測DLK1可能作為GH腺瘤患者的治療靶點，這對豐富GH腺瘤患者的治療選擇具有積極意義。

綜上所述，垂體腺瘤患者的DLK1、MEG3、MEG8基因表達水平低于正常人群。DLK1、MEG3、MEG8基因表達水平升高可促進垂體腺瘤細胞向PIT1譜系分化，臨床表現為GH腺瘤表型；其降低可促進垂體腺瘤細胞向SF-1譜系分化，臨床表現為無功能腺瘤表型。DLK1基因是調控GH分泌的關鍵基因，其可能作為GH腺瘤患者的治療靶點。由于泌乳素瘤患者常規選擇藥物治療且效果較好，ACTH腺瘤為罕見病，臨床收集這兩類垂體腺瘤的標本非常困難，本研究并未分析泌乳素瘤、ACTH腺瘤患者DLK1、MEG3、MEG8基因表達水平，且本研究樣本量較小，因而本研究結論尚需要大樣本量的研究進一步證實。

作者貢獻：吳煒進行文章的構思與設計，撰寫論文；高華進行研究的實施與可行性分析、文章的質量控制及審校；劉永亮、王彥、張歡進行數據收集；張利進行數據整理；董曉柳進行統計學處理；馬思偉負責結果的分析與解釋；吳煒、高華、董偉進行論文的修訂；董偉對文章整體負責、監督管理。

本文無利益沖突。