肉類食品中大腸桿菌快速檢驗即用型質控樣品研制

張雅倫 陳晨 王慧 張同賀 張雙 李獻 李永波

摘 要：為實現肉類食品中大腸桿菌快速檢驗，研制出大腸桿菌基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜（matrix assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry，MALDI-TOF-MS）檢驗即用型質控樣品，可以直接溶解使用，無需再次培養，并系統分析了質控樣品的均勻性和穩定性。結果表明：經篩選得到凍干基質最佳條件，質控樣品存活率均在90%以上；質控樣品培養計數結果F=0.567，小于臨界值，證明均勻性好；質控樣品在37 ℃和25 ℃環境下放置14 d后菌株計數穩定，在－20 ℃和4 ℃環境下貯藏28 d復蘇率分別為101.5%和99.6%，在37 ℃和－20 ℃環境下貯藏28 d后的MALDI-TOF-MS檢測結果仍保持一致，表明樣品穩定性好，滿足作為質控樣品的要求。

關鍵詞：基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜技術；大腸桿菌；定性質控樣品；均勻性；穩定性

Development of Ready-to-Use Quality Control Samples for Rapid Detection of Escherichia coli in Meat and Meat Products

ZHANG Yalun， CHEN Chen， WANG Hui， ZHANG Tonghe， ZHANG Shuang， LI Xian， LI Yongbo*

（Hebei Engineering Research Center for Special Food Safety and Health， Key Laboratory of Special Food Supervision Technology for State Market Regulation， Hebei Food Safety Key Laboratory， Hebei Food Inspection and Research Institute， Shijiazhuang 050071， China）

Abstract： This paper developed a ready-to-use quality control sample which can be directly used without secondary culture for the rapid detection of Escherichia coli in meat and meat products by matrix assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry （MALDI-TOF-MS）. The sample was evaluated for homogeneity and stability. The results showed that the survival rate of the quality control sample prepared using the selected cryoprotectant was above 90%. The culture count result of the quality control sample （F = 0.567） was less than the critical value， suggesting good uniformity. The quality control sample was stable for 14 days at 37 and 25 ℃， and the resuscitation rates were 101.5% and 99.6% at ?20 and 4 ℃ for 28 days， respectively. After 28 days of storage at 37 and ?20 ℃， the results of MALDI-TOF-MS were consistent， indicating that the developed sample had good stability and met the requirements of quality control samples.

Keywords： matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry; Escherichia coli; qualitative control samples; homogeneity; stability

DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20220919-127

中圖分類號：TS201.3? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文獻標志碼：A 文章編號：1001-8123（2023）03-0046-05

引文格式：

張雅倫， 陳晨， 王慧， 等. 肉類食品中大腸桿菌快速檢驗即用型質控樣品研制[J]. 肉類研究， 2023， 37（3）： 46-50. DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20220919-127.? ? http：//www.rlyj.net.cn

ZHANG Yalun， CHEN Chen， WANG Hui， et al. Development of ready-to-use quality control samples for rapid detection of Escherichia coli in meat and meat products[J]. Meat Research， 2023， 37（3）： 46-50. （in Chinese with English abstract） DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20220919-127.? ? http：//www.rlyj.net.cn

肉類食品是人們不可或缺的食物，補充人體所需的必要元素[1-2]。腐敗和病原微生物是肉類和肉制品中的污染物，微生物病原體引起的食源性感染是發病率和死亡率升高的重要原因，對食品質量和安全有相當大的影響，且可能存在于食品產業鏈各個環節[3-6]。大腸桿菌是人類和動物腸道中作為共生生物最具代表性的革蘭氏陰性菌，具有莢膜、脂多糖、外毒素等多種毒性物質，是一種重要的食源性病原體[7-9]，但肉類食品極易受到大腸桿菌污染，尤其是生肉類和加工過程中的肉制品為主要污染源[10-11]，人體攝入大腸桿菌污染過后的肉類食品可引起不同的疾病綜合征，如不同類型的腹瀉疾病、傷口感染，甚至會引起免疫性疾病等，極大損害人體健康[12-13]。因此，大腸桿菌的早期和快速檢測對于確保肉類食品安全至關重要[14]。

現行檢驗肉類食品中大腸桿菌的方式仍為以分離培養、生化鑒定為主的傳統檢測策略，需要大量的時間和經驗豐富的人員[15]。這些檢驗方式不適應新時代快速、精準的檢驗需求[16-19]，勢必極大影響食品的安全管理和有效監測。基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜（matrix assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry，MALDI-TOF-MS）是快速鑒定新方法，具有前處理簡單和高通量的特點，可以實現對未知微生物的快速鑒定、分型、溯源等[20-22]，現已廣泛應用于臨床微生物、食源性致病菌及動物源性致病菌的快速鑒定[23-25]。雖然大腸桿菌可以使用MALDI-TOF-MS快速鑒定[26-28]，但此方法的質量控制樣品缺失嚴重限制了我國食品快速檢測技術的發展。

本研究通過真空冷凍技術成功研制即用型大腸桿菌質控樣品，系統分析該樣品均勻性和穩定性。通過優化制備條件，得到存活率最高的質控樣品，通過菌落計數和MALDI-TOF-MS檢驗樣品的均勻性和穩定性，旨在作為質控樣品用于肉類食品中大腸桿菌快速檢測，使MALDI-TOF-MS檢驗有準則可以依據，提高鑒定的準確性，增加我國自主知識產權的權重，提升食品安全突發事件的處置能力和風險監測預警能力。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大腸桿菌（CMCC 43201） 中國食品檢驗研究院。

乙醇、甲酸、乙腈、蔗糖、葡聚糖 天津科密歐化學試劑有限公司；1640細胞培養基 美國Sigma公司；質譜靶板基質液 德國Bruker公司。

1.2 儀器與設備

BHC-300IIA/B3生物安全檢驗柜 蘇州凈化儀器設備有限公司；MS3振蕩混勻器 美國IKA公司；HVE-50滅菌器 日本Hirayama公司；MIR-254恒溫培養箱?日本Sanyo公司；3K15冷凍離心機 德國Sigma公司；autoflex maX LIN MALDI-TOF-MS儀 德國Bruker公司。

1.3 方法

1.3.1 凍干基質的篩選

凍干基質的種類和各成分之間的比例關系是影響質控樣品穩定性最重要的因素之一。將培養好的大腸桿菌依據不同凍干基質種類和比例進行真空冷凍干燥后，通過復溶測定樣品凍干存活率，確定最佳凍干基質條件，凍干存活率按下式計算。

選用基質種類分別為1640細胞培養基、蔗糖、葡聚糖、牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）、脫脂乳粉，按照不同比例配制不同基質進行研究。

1.3.1.1 脫脂乳粉和蔗糖

分別配制質量濃度為5、10、15 g/100 mL的脫脂乳粉，對應配制不同質量分數的蔗糖（5%、10%、15%、20%）為凍干基質，按照1.3.2節進行樣品制備，并使用無菌生理鹽水使其復溶，測定存活率，篩選凍干基質。

1.3.1.2 1640細胞培養基

選取1640細胞培養基作為基礎原料，其他凍干基質為蔗糖、葡聚糖、BSA。蔗糖質量分數使用1.3.1.1節得到的結果，對葡聚糖（2%、4%、6%、8%、10%）和BSA（1%、3%、5%、10%）的比例進行研究，按照1.3.2方式進行樣品制備，并使用無菌生理鹽水使其復溶，測定存活率，篩選凍干基質。

1.3.2 大腸桿菌質控樣品制備

將大腸桿菌劃線接種于PCA平板上，放置于36 ℃培養24 h。用無菌棉簽刮取培養好的菌苔，混懸于篩選過后的凍干基質中，使用紫外分光光度計調節菌液濃度，波長650 nm，使其OD650 nm為2.5左右。使用微量移液器吸取100 μL菌懸液快速滴入含有液氮的西林瓶中，將樣品迅速轉移到真空冷凍干燥機內進行質控樣品制備，真空冷凍干燥機預凍程序為－20 ℃、200 min，－40 ℃、200 min；冷凍干燥程序為－35 ℃、360 min、真空度130 mTorr，－30 ℃、360 min、真空度130 mTorr，－25 ℃、480 min、真空度130 mTorr，－20 ℃、480 min、真空度130 mTorr，－10 ℃、480 min、真空度130 mTorr。程序結束時保存為－20 ℃、真空度100 mTorr狀態，制備質控樣品。

1.3.3 大腸桿菌質控樣品均勻性驗證

采用簡單隨機抽樣方式驗證質控樣品均勻性，將制備好的樣品進行隨機編號，通過選定號碼，確定20 個質控樣品進行均勻性研究，通過培養計數方式對質控樣品進行定量檢測驗證均勻性。吸取1 mL無菌水分別加入質控樣品中，讓樣品復溶，通過多次稀釋后均勻涂布在平板上，同時做2 次平行實驗，將平板置于36 ℃培養箱中培養24 h，測定大腸桿菌數量。

1.3.4 大腸桿菌質控樣品穩定性驗證

1.3.4.1 運輸穩定性驗證

將制備好的大腸桿菌質控樣品分別保存在37 ℃和25 ℃環境中，進行14 d的穩定性研究，分別在0、1、2、3、5、7、14 d進行測定，同時做3 次平行實驗。通過數值變化驗證樣品在較高溫度下的運輸穩定性，以及能否作為質控樣品進行實際發樣運輸。

1.3.4.2 貯藏穩定性驗證

將質控樣品分別保存在4 ℃和－20 ℃環境中，進行28 d的穩定性研究。穩定性檢驗的時間間隔可以按先密后疏的原則安排。在使用期間應有多個時間間隔的監測數據，分別在0、1、3、5、7、14、28 d進行測定，同時做3 次平行實驗。通過復蘇率驗證樣品在低溫下的貯藏穩定性，以及能否穩定保存。

1.3.4.3 MALDI-TOF-MS穩定性驗證

將樣品分別在37 ℃和－20 ℃環境中保存28 d后進行MALDI-TOF-MS檢驗，導入BN軟件進行分析整合，研究質控樣品MALDI-TOF-MS穩定性。

1.3.5 大腸桿菌質控樣品MALDI-TOF-MS檢驗

制備的質控樣品進行MALDI-TOF-MS時可以直接溶解使用，無需再次培養。

1.3.5.1 樣品前處理

將密封的質控樣品開啟，將凍干菌球取出放入離心管內，加入100 μL滅菌水使其復溶，12 500 r/min離心5 min，去除上清液，保留沉淀，重復進行3 次。

1.3.5.2 樣品靶板制作

向沉淀中添加50 μL體積分數70%甲酸，充分裂解2 min，添加50 μL乙腈，充分溶解后，以12 500 r/min離心5 min，取1 μL上清液到靶板相應位置，靜置，待溶液揮發完成，取1 μL質譜靶板基質液到同樣位置，靜置，待溶液揮發完成，進行后續MALDI-TOF-MS檢驗。

1.4 數據處理

使用SPSS軟件，采用單因素方差分析方法對質控樣品均勻性進行分析。

2 結果與分析

2.1 凍干基質的篩選結果

凍干基質種類繁多，其構成、種類和比例不同均會導致菌株活菌數發生變化。

2.1.1 脫脂乳粉和蔗糖

由表1可知，5 g/100 mL脫脂乳粉、15%蔗糖保護劑的凍存效果最好，凍干存活率為95%。但在后續MALDI-TOF-MS檢測中，在m/z 2 000～20 000出現了溶劑雜峰，影響對目標菌的檢測，因此不能用脫脂乳粉作保護劑。

2.1.2 1640細胞培養基

因脫脂乳粉無法使用，選取1640細胞培養基作為基礎原料。由表2可知，8%葡聚糖（相對分子質量40 000）、5% BSA保護劑的凍存效果最好，凍干存活率為95%。但是加入BSA后，在后續MALDI-TOF-MS檢測中也在m/z 2 000～20 000出現了溶劑雜峰，影響對目標菌的檢測，所以需要去除BSA。

2.1.3 多次實驗驗證結果

得到篩選過后的凍干溶劑為1640細胞培養基，其中蔗糖質量分數為15%，葡聚糖質量分數為8%，進行重復實驗驗證。由表3可知，最高存活率為95%，存活率均在90%以上，在后續MALDI-TOF-MS檢測時m/z 2 000～20 000沒有出現溶劑雜峰，可以作為凍干菌球的保護劑。

2.2 大腸桿菌質控樣品均勻性驗證結果

由表4可知，20 瓶大腸桿菌質控樣品計數結果較為統一，沒有發生較大波動，說明樣品均勻性良好。

使用SPSS軟件，采用單因素方差分析方法，對樣品的均勻性進行檢驗。FINV（0.05，19，20）臨界值=2.137，由表5可知，根據SPSS軟件計算的F=0.486＜FINV（0.05，19，20）臨界值，菌株計數穩定，側面驗證定性結果均一，表明該樣品均勻性符合要求。

2.3 大腸桿菌質控樣品穩定性驗證結果

2.3.1 運輸穩定性驗證結果

由表6可知，質控樣品在37 ℃放置14 d后，大腸桿菌計數仍維持在106 CFU，在25 ℃環境下，質控樣品計數較37 ℃更加穩定，證明質控樣品運輸穩定性良好。

2.3.2 貯藏穩定性驗證結果

由表7可知，質控樣品在－20 ℃放置28 d復蘇率為97.78%，在4 ℃放置28 d復蘇率為95.00%，說明大腸桿菌質控樣品貯藏穩定性良好。

2.3.3 MALDI-TOF-MS穩定性驗證結果

由圖1～2可知，在不同溫度條件下用MALDI-TOF-MS

檢測大腸桿菌質控樣品，結果穩定，譜圖一致，說明質控樣品MALDI-TOF-MS測定穩定性良好，可以作為陽性質控樣品在MALDI-TOF-MS檢驗中使用。

3 結 論

肉類食品中大腸桿菌危害較大，但檢驗方式多為生化培養，檢驗時間較長，導致污染控制問題無法有效控制[29-30]，不能滿足快速檢驗需求。MALDI-TOF-MS作為精準、高通量檢測手段正在逐步應用于日常微生物檢測，但因沒有相應匹配的質控樣品，導致沒有方法規范檢測數據，嚴重制約了MALDI-TOF-MS的發展。

本研究通過優化凍干基質條件，成功研制出大腸桿菌即用型質控樣品，樣品通過直接溶解方式，無需再次培養，可以用于肉類食品中大腸桿菌MALDI-TOF-MS快速檢驗，并通過樣品復溶計數方式驗證均勻性和穩定性。實驗結果表明：本質控樣品F=0.486，小于臨界值，證明樣品有良好的均勻性，保障了作為質控樣品的一致性；37 ℃和25 ℃環境條件下實驗結果證明了本樣品具有良好的運輸穩定性，保證了樣品在實際運輸過程中不會變質；4 ℃和－20 ℃環境條件下實驗結果證明了本樣品具有良好的貯藏穩定性，保證了作為質控樣品的長期有效性；樣品在37 ℃和－20 ℃環境中貯藏28 d后的MALDI-TOF-MS檢測結果一致，說明樣品能夠作為質控樣品在MALDI-TOF-MS檢驗中穩定使用，為MALDI-TOF-MS技術檢驗肉類食品中大腸桿菌提供了校檢方式，保證了檢驗數據的穩定、可靠。

參考文獻：

[1] 王英. 肉類食品中獸藥殘留的原因及對策[J]. 食品安全導刊， 2021（18）： 18-20. DOI：10.16043/j.cnki.cfs.2021.18.012.

[2] 孫孟嬌， 王穩航. 肉類食品生物膜的形成機制及預防措施[J].

中國食品學報， 2021， 21（4）： 375-383. DOI：10.16429/j.1009-7848.2021.04.044.

[3] SILVA B， BERNARDES P C， PINHEIRO P F， et al. Chemical composition， extraction sources and action mechanisms of essential oils： natural preservative and limitations of use in meat products[J]. Meat Science， 2021， 176（3）： 108463. DOI：10.1016/j.meatsci.2021.108463.

[4] KARIKARI A B， KPORDZE S W， YAMIK D Y， et al. Ready-to-eat food as sources of extended-spectrum β-lactamase-producing Salmonella and E. coli in Tamale， Ghana[J]. Frontiers in Tropical Diseases， 2022， 3： 834048. DOI：10.3389/fitd.2022.834048.

[5] 李丹， 王守偉， 臧明伍， 等. 我國肉類食品安全風險現狀與對策[J]. 肉類研究， 2015， 29（11）： 34-38. DOI：10.15922/j.cnki.rlyj.2015.11.008.

[6] ARSLAN S， EYI A. Antimicrobial resistance and esbl prevalence in Escherichia coli from retail meats[J]. Journal of Food Safety， 2011， 31（2）： 262-267. DOI：10.1111/j.1745-4565.2010.00295.x.

[7] FOKT H， CLETO S， OLIVEIRA H， et al. Bacteriocin production by Escherichia coli during biofilm development[J]. Foods， 2022， 11（17）： 2652. DOI：10.3390/foods11172652.

[8] QUI?ONES D， AUNG M S， CARMONA Y， et al. High prevalence of CTX-M type extended-spectrum beta-lactamase genes and detection of NDM-1 carbapenemase gene in extraintestinal pathogenic Escherichia coli in Cuba[J]. Pathogens， 2020， 9（1）： 65. DOI：10.3390/pathogens9010065.

[9] 徐偉， 陳亞妮， 何珊珊， 等. 奶牛急性大腸桿菌性乳房炎病例[J].

中國獸醫雜志， 2016， 52（9）： 119-120. DOI：10.3969/j.issn.0529-6005.2016.09.045.

[10] 王政， 付玉林， 汪洋， 等. 多黏菌素E耐藥基因mcr-1在我國養殖場的流行及其傳播擴散[J]. 中國抗生素雜志， 2019， 44（2）： 191-196. DOI：10.13461/j.cnki.cja.006552.

[11] 李明昊， 劉文雙， 李彥， 等. 山東地區零售畜禽生肉源大腸桿菌中CTX-M型超廣譜β-內酰胺酶的流行調查[J]. 中國獸醫雜志， 2022， 58（6）： 57-61.

[12] TREIER A， STEPHAN R， STEVENS M J A. et al. High occurrence of Shiga toxin-producing Escherichia coli in raw meat-based diets for companion animals： a public health issue[J]. Microorganisms， 2021， 9（8）： 1556. DOI：10.3390/microorganisms9081556.

[13] WANG Min， JIANG Min， WANG Zhongxing， et al. Characterization of antimicrobial resistance in chicken-source phylogroup F Escherichia coli： similar populations and resistance spectrums between E. coli recovered from chicken colibacillosis tissues and retail raw meats in Eastern China[J]. Poultry Science， 2021， 100（9）： 101370. DOI：10.1016/j.psj.2021.101370.

[14] COSSETTINI A， VIDIC J， MAIFRENI M， et al. Rapid detection of Listeria monocytogenes， Salmonella， Campylobacter spp.， and Escherichia coli in food using biosensors[J]. Food Control， 2022， 137： 108962. DOI：10.1016/j.foodcont.2022.108962.

[15] SRINIVASAN S Y， GAJBHIYE V， BODAS D. Development of nano-immunosensor with magnetic separation and electrical detection of Escherichia coli using antibody conjugated Fe3O4@Ppy[J]. Nanotechnology， 2021， 32（8）： 085603. DOI：10.1088/1361-6528/abc8b1.

[16] 農業農村部. 農業農村部關于印發《2019年動物源細菌耐藥性監測計劃》的通知[EB/OL]. （2019-04-20） [2022-09-19]. http：//www.moa.gov.cn/nybgb/2019/201904/201906/t20190607_6316352.htm.

[17] 韓勝濤， 榮揚， 任恩恒， 等. 關于食品微生物檢驗內容及檢測技術的思考[J]. 食品安全導刊， 2021（20）： 81; 85. DOI：10.16043/j.cnki.cfs.2021.20.064.

[18] 李志芬， 王峰. 從微生物指標中看我國肉類食品安全問題及解決措施[J]. 中國微生態學雜志， 2013， 25（6）： 720-722; 730. DOI：10.13381/j.cnki.cjm.2013.06.008.

[19] 吳彤. 食品質量檢驗存在的問題與對策[J]. 食品安全導刊， 2016（30）： 45.

DOI：10.16043/j.cnki.cfs.2016.30.034.

[20] UCHIDA S， UMEMURA H， NAKAYAMA T. Current status of matrix-assisted laser desorption /ionization-time-of-flight mass spectrometry （MALDI-TOF MS） in clinical diagnostic microbiology[J]. Molecules， 2020， 25（20）： 4775. DOI：10.3390/molecules25204775.

[21] WELKER M， VAN BELKUM A， GIRARD V， et al. An update on the routine application of MALDI-TOF MS in clinical microbiology[J]. Expert Review of Proteomics， 2019， 16（8）： 695-710. DOI：10.1080/14789450.2019.1645603.

[22] 丁曉妍， 崔明全， 李霆， 等. 基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜在動物源細菌耐藥性監測中的研究應用[J]. 中國獸藥雜志， 2022， 56（5）： 20-26. DOI：10.11751/ISSN.1002-1280.2022.05.03.

[23] 湯旭， 肖迪， 張慧芳， 等. MALDI-TOF-MS鑒定布魯氏菌方法建立和評價[J]. 中國人獸共患病學報， 2016， 32（9）： 772-778. DOI：10.3969/j.issn.1002-2694.2016.09.002.

[24] 姜彥芬， 王金鳳， 孫曉霞， 等. 基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜對羊源多殺性巴氏桿菌的快速鑒定[J]. 中國獸醫雜志， 2022， 58（1）： 43-46.

[25] 張秋艷， 唐靜， 祝素珍， 等. 基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜分析技術在微生物鑒定與分型中的應用[J]. 食品安全質量檢測學報， 2021， 12（19）： 7549-7555. DOI：10.19812/j.cnki.jfsq11-5956/ts.2021.19.007.

[26] DWIVEDI P， PUZON G， TAM M， et al. Metabolic profiling of Escherichia coli by ion mobility-mass spectrometry with MALDI ion source[J]. Journal of Mass Spectrometry， 2010， 45（12）：1383-1393. DOI：10.1002/jms.1850.

[27] 閆雯倩， 陳企發， 夏炎. 基質輔助激光解析/電離飛行時間質譜（MALDI-TOF MS）在微生物鑒定中的應用[J]. 化學教育（中英文）， 2022， 43（10）： 7-14. DOI：10.13884/j.1003-3807hxjy.2021040081.

[28] 李濱洲， 陳飛， 郭珍珍， 等. 基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜技術分離鑒定生鮮豬肉中沙門氏菌/大腸桿菌類似菌[J].

食品安全質量檢測學報， 2018， 9（4）： 717-722. DOI：10.3969/j.issn.2095-0381.2018.04.006.

[29] 吳萱， 楊璐， 劉艷超， 等. 北京市售雞肉和豬肉中大腸桿菌污染情況及耐藥特征分析[J]. 中國食品衛生雜志， 2022， 34（2）： 211-216. DOI：10.13590/j.cjfh.2022.02.004.

[30] KIRK M D， PIRES S M， BLACK R E， et al. World health organization estimates of the global and regional disease burden of 22 foodborne bacterial， protozoal， and viral diseases， 2010： a data synthesis[J]. PLoS Medicine， 2015， 12（12）： e1001921. DOI：10.1371/journal.pmed.1001921.

收稿日期：2022-09-19

基金項目：河北省市場監督管理局科研計劃項目（2022ZD10）

第一作者簡介：張雅倫（1991—）（ORCID： 0000-0001-5441-969X），男，工程師，碩士，研究方向為食品安全。

E-mail： 11490405113@qq.com

*通信作者簡介：李永波（1988—）（ORCID： 0000-0001-5827-1186），男，工程師，碩士，研究方向為食品安全。

E-mail： 913557305@qq.com