灰飛虱唾液鞘形態及其蛋白質組分鑒定

戚良軒　徐晴玉　李晶　鞠佳菲　孫洋　方繼朝　紀銳

摘要： 灰飛虱是一種小型的刺吸式口器昆蟲，是危害水稻的主要害蟲之一。灰飛虱刺吸取食時分泌的膠狀唾液可形成唾液鞘，保護口針并幫助取食，同時其中的蛋白質效應子在調控作物免疫中扮演重要角色。本研究利用掃描電子顯微鏡觀察了灰飛虱唾液鞘的形態：多呈樹枝狀，表面為較為光滑的珠狀結構。應用雙層膜裝置收集了若蟲的唾液鞘，經液相色譜與串聯質譜聯用檢測鑒定得到42種灰飛虱唾液鞘蛋白質，其中19種蛋白質檢測到2個及以上的唯一肽段。進一步分析了編碼這19種蛋白質的基因在各個組織中的表達模式，發現其中8個基因在唾液腺中明顯高表達，推測其可能參與了唾液鞘的形成以及害蟲-作物的互作。唾液鞘蛋白質組分鑒定為后續篩選和研究灰飛虱效應子功能提供了基礎，有助于明確灰飛虱-水稻互作的分子機制，為開發害蟲綠色防控新策略提供思路。

關鍵詞： 灰飛虱；唾液鞘；蛋白質組分

中圖分類號： S435.112 文獻標識碼： A 文章編號： 1000-4440（2023）01-0030-07

Morphology and protein identification of salivary sheath from Laodelphax striatellus

QI Liang-xuan¹， XU Qing-yu¹， LI Jing¹， JU Jia-fei¹， SUN Yang²， FANG Ji-chao^1，3， JI Rui^1，2，3

（1.Institute of Plant Protection， Jiangsu Academy of Agricultural Sciences， Nanjing 210014， China;2.Key Laboratory for Conservation and Use of Important Biological Resources of Anhui Province/College of Life Sciences， Anhui Normal University， Wuhu 241000， China;3.Jiangsu Collaborative Innovation Center of Regional Modern Agriculture & Environmental Protection/Huaiyin Normal University， Huai′an 223300， China）

Abstract： Small brown planthopper （SBPH） Laodelphax striatellus， the tinny sap-sucking insects， is one of the most destructive herbivores damaging rice in China. During the feeding process， gel saliva secreted by SBPHs can form the salivary sheath to protect stylet and help feeding. Some protein effectors in the salivary sheath play important roles in regulating plant immunity. Here， we observed the morphology of SBPH salivary sheaths under scanning electron microscope： most salivary sheaths were dendritic and had smooth bead structures in the surface. The salivary sheaths of SBPH nymphs were collected using double membrane device. After the liquid chromatography-tandem mass spectrometer （LC-MS/MS）analysis， 42 proteins were finally identified in the salivary sheaths，? and among them， 19 proteins with two or more unique peptides were detected. Using quantitative polymerase chain reaction， we analyzed the expression patterns of genes encoding these 19 proteins in different tissues of SBPH， and found eight genes with dramatically higher expression levels in the salivary gland， suggesting their importance in the formation of salivary sheaths and interaction of insect and plant. These results lay a solid foundation for studying the function of SBPH salivary sheath， revealing the detailed mechanism of SBPH-rice interaction， and developing green pest management strategies.

Key words： Laodelphax striatellus;salivary sheath;protein component

作物與害蟲之間一直存在共同進化的“軍備”競賽。作物通過受體識別與感知害蟲的相關分子信號激活一系列的免疫反應，比如：誘發鈣離子內流，激活絲裂原活化蛋白激酶途徑，誘導活性氧爆發和抗蟲激素積累，進而產生有毒物質影響昆蟲的取食、發育，或產生揮發物來吸引害蟲天敵。相應地，害蟲也進化出各種對抗策略來逃避與破解植物的防御反應，分泌效應子至宿主作物體內就是其中的重要策略之一^[1]。

灰飛虱（Laodelphax striatellus）等刺吸式口器害蟲在取食過程中，向作物體內不斷地分泌2種類型的唾液——水狀唾液與膠狀唾液，調控植物免疫，幫助昆蟲取食^[2]。水狀唾液中的酶類可以將植物的營養物質初步降解，有利于消化吸收，部分效應子還能以多種形式與植物抗蟲因子相互作用，比如，（1）酶解宿主植物中的抗蟲物質：褐飛虱（Nilaparvata lugens）唾液中的內切β-1，4-葡聚糖酶能分解水稻中的纖維素，便于口針在水稻細胞間和向細胞內穿刺時突破細胞壁屏障，幫助其順利取食^[3]。灰飛虱唾液中的DNase II 能夠降解刺吸損傷時植物產生的胞外DNA，進而抑制刺吸損傷誘導的防御反應^[4]；（2）與植物細胞內的金屬離子結合：褐飛虱和灰飛虱唾液中的鈣結合蛋白通過結合水稻細胞質中的Ca²⁺，阻斷鈣信號通道，抑制取食所誘導的水稻胼胝質沉積以及抗蟲信號分子的積累^[5-7]；（3）與植物中的關鍵抗蟲蛋白質互作：灰飛虱效應子卵黃原蛋白在細胞核中與免疫調控轉錄因子OWRKY71互作，并抑制其轉錄活性，進而抑制OsWRKY71介導的防御反應^[8]；煙粉虱（Bemisia tabaci）效應子Bt56、Bsp9、Armet分別和寄主植物中的轉錄因子NTH202和WRKY33以及半胱氨酸蛋白酶抑制子CYS6互作，抑制植物免疫^[9-11]。然而，膠狀唾液的成分鑒定和功能分析的報道相對較少，目前僅在褐飛虱中鑒定到16種蛋白質^[12]。膠狀唾液分泌進入植物體內后凝結成唾液鞘，包裹、潤滑和保護口針^?[13]，還能隔絕口針和植物細胞結構的接觸，封閉針刺產生的細胞傷口，防止植物細胞內容物外流所引發的免疫反應。飛虱唾液鞘中的主要蛋白質（Salivary sheath protein和Mucin）對于唾液鞘的形成和取食至關重要^[14-15]，沉默Mucin能影響飛虱的取食行為，不利于植物病毒的水平傳播^[16]，而且Mucin還可以被作物識別，激發強烈的防御反應^[15]。

灰飛虱屬半翅目飛虱科害蟲，由其直接取食、產卵和傳播病毒病所引起的糧食減產損失極其嚴重。唾液是植物-病毒-昆蟲三者互作的關鍵因素，鑒定灰飛虱的唾液鞘蛋白效應子，設計相應策略阻斷這些唾液效應子的功能，一方面可以有效地控制灰飛虱的直接危害，另一方面通過抑制其取食來阻斷作物病毒的水平傳播，起到“一石二鳥”的作用。本研究擬在電子顯微鏡下觀察灰飛虱唾液鞘的形態，利用液相色譜與串聯質譜聯用（Liquid chromatography-tandem mass spectrometer ，LC-MS/MS）等方法鑒定灰飛虱唾液鞘蛋白質組分，并采用定量PCR技術對唾液鞘基因的組織表達模式進行分析，為后續效應子篩選積累重要的蛋白質資源。

1 材料與方法

1.1 供試昆蟲

灰飛虱在人工氣候室內[溫度：（28±1） ℃；光周期：14 h光照、10 h黑暗]以南粳9108稻苗為寄主進行飼養。

1.2 雙層膜夾蔗糖溶液

用高壓滅菌后的超純水溶解蔗糖，配置成2.5%的蔗糖溶液，經針孔式過濾器（濾膜孔徑0.22 μm） 除菌。將Parafilm 膜裁成小方塊，置于紫外燈下滅菌1 h。將充分拉伸過的膜覆蓋在雙通玻璃管的一端，另一端用紗布包住透氣。將80 μl蔗糖溶液滴到膜的中央位置，再覆上第2層膜，壓緊2層膜使蔗糖溶液在膜間充分鋪展。

1.3 唾液鞘樣品處理及形態觀察

（1）樣品收集與清洗：將約60頭4～5齡灰飛虱若蟲放進雙通管中，待灰飛虱在上述的Parafilm 膜上取食蔗糖溶液24 h后，用75%乙醇溶液輕輕漂洗帶有唾液鞘的膜。（2）固定：將4%多聚甲醛與2.5%戊二醛（2∶1，體積比）混合配置成固定液，對Parafilm膜進行固定，然后去除固定液，并用PBS溶液進行清洗。（3）脫水：用梯度濃度的乙醇溶液（30%～100%）對樣品進行梯度脫水。（4）置換：向上述樣品中倒入醋酸異戊酯和乙醇（1∶2，體積比）的混合液，適當搖動10 min；轉移膜至醋酸異戊酯∶乙醇（1∶1，體積比）的混合液中，搖動10 min；最后轉移膜至醋酸異戊酯中，緩慢搖動10 min，從樣品中充分置換出乙醇。（5）干燥：用濾紙吸除樣品表面殘留的醋酸異戊酯，將樣品膜在室溫下干燥24 h，然后轉移至50 ℃的烘箱中，干燥2 h；（6）粘樣、鍍膜：采用導電雙面膠將膜粘到樣品臺上，利用離子濺射法鍍膜；（7）樣品觀察：在掃描電鏡觀察室進行觀察，拍攝獲得唾液鞘的清晰圖片。涉及的具體方法參照文獻[17]。

1.4 唾液鞘收集

在體視顯微鏡下觀察，用鑷子從Parafilm膜上取下完整的唾液鞘，放入SDT蛋白裂解液中，-80 ℃保存。取約6 000頭若蟲的唾液鞘，超聲波破碎處理（100 W工作10 s，間歇10 s，循環10次），沸水浴10 min。離心后取上清液，利用胰蛋白酶進行充分酶解，獲得肽段。

1.5 LC-MS/MS測定

上述酶解后的肽段上樣到經0.1%甲酸溶液平衡過的色譜柱，再經分析柱分離，HPLC系統流速設定為0.3 μl/min。色譜分離后的產物進一步用Q-Exactive質譜儀檢測2 h。

1.6 質譜數據分析和蛋白質鑒定

將獲得的質譜數據利用MASCOT軟件比對灰飛虱基因組預測的蛋白質數據庫（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/data-hub/genome/？taxon=195883&annotated_only=true&refseq_annotation=true&genbank_annotation=true）。參數設定如下：enzyme為trypsin；missed cleavage sites為2；fixed modification為carbamidomethyl；varialbe modification為oxidation（M）和Acetyl（Protein N-term）；過濾參數FDR≤0.01。

1.7 灰飛虱各組織總RNA提取和熒光定量PCR分析

灰飛虱各組織總RNA的提取參照普洛麥格生物技術有限公司的總RNA提取試劑盒說明書進行，提取的總RNA用瓊脂糖凝膠電泳和艾本德有限公司的微量分光光度計檢測其質量和濃度。cDNA合成參照寶生物工程有限公司的反轉錄試劑盒說明書進行。定量PCR配置體系和方法參照寶生物工程有限公司的染料法熒光定量試劑盒（TB Green^TMPremix Ex Taq^TMkit）說明書進行，在羅氏的LightCycler 480 II 實時熒光定量PCR儀上進行反應。灰飛虱延伸因子基因（EF-1）為內參基因，唾液鞘基因相對表達量的計算采用2^-△Ct方法^[8]。

2 結果與分析

2.1 灰飛虱唾液鞘形態

利用掃描電子顯微鏡觀察Parafilm膜上的灰飛虱唾液鞘的形態。唾液鞘多為樹枝狀，可有多個分叉，大多數表面為較光滑的珠狀結構（圖1）。

2.2 灰飛虱唾液鞘樣品質量檢測

收集到69.7 μg灰飛虱唾液鞘蛋白質，利用SDS-PAGE分析了唾液鞘樣品的質量，蛋白質條帶（考染）清晰、豐富（圖2），表明唾液鞘蛋白質含量較高，并且未發生明顯的降解和損失。唾液鞘樣品質量較好，可滿足后續蛋白質組分測定的要求。

2.3 灰飛虱唾液鞘蛋白質鑒定與注釋

利用LC-MS/MS檢測了灰飛虱唾液鞘的蛋白質成分，共鑒定到42種蛋白質，其中19種蛋白質檢測到的肽段數量較多，有2～34個唯一肽段；其他23種蛋白質只檢測到1條唯一肽段。利用SignalP-5.0預測這些唾液鞘蛋白質的信號肽序列：僅4個含信號肽，分別是精氨酸激酶和肌動蛋白，以及2個未知功能蛋白質（KAF7751974.1和RZF33379.1）。

將鑒定到的蛋白質氨基酸序列比對到NCBI的Non-Redundant Protein（NR）數據庫進行功能注釋，發現其中36個具有功能注釋結果（表1）。肌球蛋白重鏈在唾液鞘蛋白質中含量最高，檢測到34個唯一肽段。副肌球蛋白質的含量次之，檢測到12個唯一肽段。

2.4 灰飛虱唾液鞘基因的組織表達模式

檢測到19種唾液鞘蛋白質的唯一肽段數≥2（表1），表明這些蛋白質的鑒定結果可信度較高，因此利用定量PCR探究了這19個基因在灰飛虱各組織中的表達模式，引物見表2。結果（圖3）表明，編碼副肌球蛋白、精氨酸激酶、原肌球蛋白-1、延伸因子1-α、肌球蛋白調節輕鏈2、堿性肌球蛋白輕鏈、組蛋白H2B以及微管蛋白β-1鏈的8個基因在唾液腺中特異性高表達，而在脂肪體、腸道、精巢以及卵巢中表達量很低。其余基因在灰飛虱各個組織中均有不同程度的表達。

3 討論

本研究利用掃描電子顯微鏡觀察到灰飛虱唾液鞘呈樹枝狀的清晰形態，并收集了大量的灰飛虱唾液鞘樣品，利用LC-MS/MS測定了其蛋白質組分，鑒定得到42個灰飛虱唾液鞘蛋白質，其中ATP合成酶，肌動蛋白和Mucin在褐飛虱唾液鞘蛋白質中也被鑒定到^[12]，其他唾液鞘蛋白質組分為首次報道。我們鑒定到的灰飛虱唾液鞘蛋白質數量雖然比褐飛虱唾液鞘中鑒定得到的蛋白質數量（16種）要多^[12]，但是遠少于水狀唾液中鑒定得到的蛋白質數量（褐飛虱水狀唾液中鑒定到149種蛋白質，灰飛虱中鑒定到236種）^[18]，這說明水狀唾液中蛋白質比膠狀唾液中蛋白質的種類和功能更豐富，這可能是因為水狀唾液參與了飛虱取食、體外消化和降解、調控水稻防御等多種功能，而膠狀唾液多為結構性蛋白質，其主要參與唾液鞘形成。

水狀唾液中的降解酶可以幫助昆蟲體外消化、分解植物中的營養物質和抗性因子。本研究在唾液鞘中雖然未檢測到相關的降解酶，但鑒定到一些與能量代謝相關的酶，比如ADP /ATP 轉移酶和5種ATP合成酶，這在稻飛虱水狀唾液、膠狀唾液中也被檢測到^[5，12]，其可能在植物中發揮了與消耗能量相關的功能。此外，還發現了肌球蛋白、原肌球蛋白、副肌球蛋白、微管蛋白、肌動蛋白等參與維持細胞功能的一些結構蛋白質，推測這些蛋白質可能與唾液鞘的形成有關，其在昆蟲-植物互作中的功能尚需進一步研究。

灰飛虱唾液鞘蛋白質組分比較豐富，但僅有4個蛋白質含有信號肽，這與其他刺吸式口器昆蟲唾液中大部分蛋白質不含信號肽類似，說明除了內質網-高爾基體這一經典的分泌途徑外，唾液蛋白質還有著其他非經典的分泌方式^[12]。不同的唾液鞘基因在灰飛虱各組織中的表達模式不盡相同，測定的19個基因中，42%的基因在唾液腺中的表達水平顯著高于在其他組織中的表達量，這些蛋白質可能在唾液腺中合成，然后被分泌到寄主作物中，主要在保持唾液腺的生理功能、維持正常的取食行為或調控水稻防御過程中發揮重要作用，它們是潛在的效應子。

唾液鞘蛋白質除了具有參與唾液鞘形成以及介導昆蟲與植物互作的功能，還可能參與植物病毒的傳播。普通的非蟲接種方式很難使病毒感染植物，唾液作為植物-病毒-昆蟲三者互作的關鍵因素，極可能是病毒侵染作物并且傳播爆發的關鍵因子。水稻條紋病毒（Rice stripe virus，RSV）隨著灰飛虱唾液進入到水稻中，最近研究發現唾液鞘蛋白質Mucin與唾液鞘形成相關，通過影響灰飛虱的取食行為來干擾RSV的水平傳播，表明正常結構的唾液鞘對于刺吸式口器害蟲水平傳播植物病毒極為重要^[16]。

由于唾液鞘蛋白質在植物-病毒-昆蟲互作中的重要性及其功能的多樣性，本研究鑒定到的42種灰飛虱唾液鞘蛋白質是研究灰飛虱-水稻-病毒互作過程中的重要里程碑。深入研究這些蛋白質在幫助灰飛虱危害作物和傳播病毒過程中的作用，一方面有利于明晰害蟲-病毒-作物互作背后復雜的分子機制等基礎科學問題，另一方面鑒定出的效應子以及與效應子互作的水稻抗蟲因子，可以成為抗性育種、新型RNAi 生物農藥、高效防控的新靶標，這對于制定害蟲可持續治理對策、研發新的綠色防控產品及技術，具有重要價值。

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（責任編輯：陳海霞）