不同地域草莓擬盤多毛孢根腐病菌致病力差異及對苯醚甲環唑的敏感性

吳娥嬌　郭文龍　王志偉　關玲　喬玉山　趙密珍

摘要： 近年來中國草莓主產區擬盤多毛孢根腐病大面積發生并呈危害加重趨勢。為明確不同地域來源擬盤多毛孢根腐病菌的致病力差異及其對苯醚甲環唑的敏感性，采用離體葉片和菌絲生長速率法對收集到的不同地域的73株病原菌菌株進行致病力分析和苯醚甲環唑敏感性測定。結果表明，不同地域來源的菌株致病力差異極顯著，且和采樣地年平均溫度呈顯著正相關。不同病原菌菌株對苯醚甲環唑的敏感性呈單峰分布，EC₅₀范圍為0.01～2.94 μg/ml，平均值為1.34 μg/ml。菌絲生長速率與AUDPC（病情發展曲線下面積）之間無相關性，不同苯醚甲環唑質量濃度下菌絲生長速率和產孢量之間的相關性存在差異。研究結果為苯醚甲環唑應用于草莓擬盤多毛孢根腐病的精準防控提供科學依據。

關鍵詞： 草莓擬盤多毛孢根腐病菌；苯醚甲環唑；致病力；敏感性

中圖分類號： S436.63 文獻標識碼： A 文章編號： 1000-4440（2023）01-0044-09

Virulence difference and sensitivity analysis to difenoconazole of Neopestalotiopsis clavispora crown rot pathogens isolated from strawberry plants of different areas in China

WU E-jiao¹， GUO Wen-long^1，2， WANG Zhi-wei^1，2， GUAN Ling¹， QIAO Yu-shan¹， ZHAO Mi-zhen¹

（1.Institute of Pomology， Jiangsu Academy of Agricultural Sciences/Jiangsu Key Laboratory for Horticultural Crop Genetic Improvement， Nanjing 210014， China;2.College of Horticulture and Plant Protection， Yangzhou University， Yangzhou 225009， China）

Abstract： Strawberry crown rot caused by Neopestalotiopsis spp. has occurred in many areas in China and led to an increasing economic loss in recent years. In order to clarify the virulence difference of Neopestalotiopsis crown rot pathogens from different geographical sources and their sensitivity to difenoconazole， the pathogenicity analysis and sensitivity to difenoconazole of 73 pathogenic strains collected from different regions were determined by in vitro leaf and mycelial growth rate method. The results showed that the virulence of strains from different geographical sources was significantly different， and significantly positively correlated with the annual mean temperature of the sampling sites. The sensitivity of different pathogenic strains to difenoconazole showed a single peak distribution. The EC₅₀values of the 73 N. clavispora isolates ranged from 0.01 μg/ml to 2.94 μg/ml， with an average of 1.34 μg/ml. There was no correlation between mycelial growth rate and area under disease progress curve （AUDPC）， and the correlation between mycelium growth rate and conidia production was different under different difenoconazole concentrations. The results provide a scientific basis for the application of difenoconazole in the precise prevention and control of strawberry Neopestalotiopsis crown rot.

Key words： Neopestalotiopsis clavispora from strawberry crown root;difenoconazole;virulence;sensitivity

據聯合國糧農組織統計，中國2021年草莓栽培總面積達1.29×10⁵hm²，總產量達3.39×10⁶t，產值超過2.50×10¹⁰元，是世界最大的草莓生產和消費國（http：//faostat.fao.org/）。隨著草莓生產的產業化和規模化發展，大面積栽培品種單一化、過度連作和高度設施化等，使草莓生產上呈現出次要病害猖獗、病原物致病型變異加快的特點^[1-2]。甜查理是中國栽培面積一度占居第二位的主栽品種^[3]。由擬盤多毛孢（Neopestalotiopsis）引起的草莓擬盤多毛孢根腐病（Neopestalotiopsis crown rot）在甜查理及以其為親本育成的品種上發生嚴重，且呈現逐年加重趨勢，個別田塊發病率高達90%以上，造成絕產、絕收，已成為當前制約草莓生產的一種毀滅性病害^[4]。

目前中國對草莓擬盤多毛孢根腐病的研究還處于起步階段，多集中于致病菌的分離鑒定、防控藥劑篩選等方面^[4-12]。對該病害的命名和主要致病菌的鑒定結果不一，多數學者認為草莓出現葉片發紅枯死是由草莓根腐病菌引起。寧志怨等^[4]在2019年首次報道了引起安徽省草莓紅葉病的主要致病菌是棒狀擬盤多毛孢（Pestalotiopsis clavispora）；劉艷茹等^[5]研究發現引起江蘇省徐州市草莓紅葉根腐病的致病菌為Neopestalotiopsis roase；趙景楠等^[6]認為引起草莓棒孢葉斑病的主要致病菌也是棒狀擬盤多毛孢；趙宇等^[7]認為擬盤多毛孢是引起草莓出現紅葉枯死病的優勢致病菌。目前生產上主要使用化學藥劑進行草莓擬盤多毛孢根腐病的防控。苯醚甲環唑是一種內吸性廣譜殺菌劑，通過抑制真菌細胞膜上甾醇類化合物的合成而影響細胞的正常生物代謝，對多種真菌病害具有較好的防治效果^[13]，在草莓生產上大面積且長期使用。溫浩等^[9]測定了9種殺菌劑對新擬盤多毛孢病菌（Pestalotiopsis clavispora）的室內毒力，發現苯醚甲環唑的平均EC₅₀為0.47 μg/ml。寧志怨等^[10]測定草莓紅葉病病原菌（Pestalotiopsis clavispora）對9種常用殺菌劑的敏感性時發現苯醚甲環唑在苗期和大田生長期的防效分別達90.16%和61.89%。劉艷茹^[11]的研究結果表明苯醚甲環唑對草莓擬盤多毛孢根腐病菌（Neopestalotiopsis roase）的最高抑制率達93.60%，對盆栽苗的最佳防效為96.67%，平均EC₅₀為0.06～0.84 μg/ml。李忠峰等^[12]研究結果表明10.00%的苯醚甲環唑對草莓紅斑葉枯病病原菌（Pestalotiopsis clavispora）的EC₅₀為11.88 μg/ml，抑制率高達94.91%。

目前，關于草莓擬盤多毛孢根腐病菌致病力的研究報道很少，尤其是針對不同地域來源草莓擬盤多毛孢根腐病菌致病力差異與其對苯醚甲環唑敏感性的關聯分析基本空白。本研究對2020年3-5月從中國25個地區分離到的288株病原菌中挑選73株代表性草莓擬盤多毛孢根腐病菌進行致病力分析及其對苯醚甲環唑的敏感性測定，以期明確不同地域來源病原菌的致病力差異，并探究其對苯醚甲環唑的敏感性，為殺菌劑的高效應用和草莓擬盤多毛孢根腐病的精準防控提供科學依據和指導。

1 材料與方法

1.1 樣本采集

于2020年3-5月在草莓擬盤多毛孢根腐病發生盛期從中國15個省、直轄市和自治區的25個草莓種植區（表1）采集草莓植株定植后未使用過苯醚甲環唑及其相同作用機制殺菌劑且具有典型癥狀的設施栽培草莓發病植株（圖1），草莓品種主要有甜查理、寧玉和寧豐等。

1.2 供試菌株

采用組織分離法^[14]進行草莓擬盤多毛孢根腐病菌的分離，挑取單孢進行病原菌純化（圖1），結合形態學和分子生物學進行病原菌鑒定，最終獲得病原菌288株（表1）。依據地域來源、寄主品種和病原菌鑒定結果選取73株草莓擬盤多毛孢根腐病菌菌株（表2）用于后續研究。

1.3 供試藥劑

96.00%苯醚甲環唑（Difenoconazole），購于上海安譜實驗科技股份有限公司，用丙酮配制成1.0×10⁵μg/ml母液，于4 ℃冰箱保存，備用。99.50%丙酮，購于國藥集團化學試劑有限公司。

1.4 供試培養基

PDA培養基：馬鈴薯（去皮）200 g，葡萄糖20 g，瓊脂粉18 g，加入1 000 ml超純水中，沸水煮20 min用四層紗布過濾后補充超純水至1 000 ml，121 ℃滅菌20 min后備用。

含殺菌劑的PDA培養基：用丙酮將苯醚甲環唑母液依次稀釋成0.50×10³μg/ml、1.50×10³μg/ml和3.00×10³μg/ml，分別吸取上述各質量濃度溶液400 μl加入至399.6 ml已滅菌且冷卻至50 ℃左右的PDA培養基中，制成終質量濃度為0.50 μg/ml、1.50 μg/ml和3.00 μg/ml的含殺菌劑的PDA平板。

1.0%水瓊脂培養基（WA）：瓊脂粉10 g，加水定容至1 000 ml，加熱至瓊脂完全溶化后分裝，121 ℃滅菌20 min，備用。

1.5 草莓擬盤多毛孢根腐病菌致病力分析

依據同質園試驗（Common garden experiment）原理^[15]在離體感病品種寧玉上進行擬盤多毛孢根腐病菌致病力分析。具體方法：無菌條件下將從健康植株上采集的大小、葉齡一致的新鮮葉片置于預先備好的1.0%水瓊脂培養基的培養皿（直徑10 cm）中，每皿放兩片葉，葉背朝上，用昆蟲針在每張葉片背部相同位置刺一直徑約0.50 mm的針孔。隨后用無菌槍頭從PDA培養基上活化培養7 d的菌落邊緣取直徑為5 mm的菌餅，倒置接種于針孔處。每處理接種3皿，共6片葉，以接種直徑為5 mm的無菌PDA為對照。于恒溫26.0 ℃、濕度95.00%、光照16 h/黑暗8 h的培養箱中培養48 h后將葉片翻為正面，于接種后2～5 d內每間隔24 h用數碼相機固定焦距獲取病斑圖像。采用ImageJ1.51軟件進行病斑面積的獲取，對第5 d病斑面積和2～5 d病情發展曲線下面積（AUDPC）^[16]進行分析，AUDPC參照公式（1）計算。

式（1）中t_i表示第i次獲取照片的時間（d），x_i表示第i次測定時葉片的病斑面積，n表示病斑面積測定總次數（n=4）。

1.6 草莓擬盤多毛孢根腐病菌對苯醚甲環唑的敏感性測定

采用菌絲生長速率法^[17]進行草莓擬盤多毛孢根腐病菌對苯醚甲環唑的敏感性測定。將表2選定的草莓擬盤多毛孢根腐病菌接種在PDA平板上預先活化培養7 d后，在菌落邊緣取直徑為5 mm的菌餅，分別將菌絲面朝下接種至含0.50 μg/ml、1.50 μg/ml和3.00 μg/ml苯醚甲環唑的PDA平板中心，以含等量丙酮的PDA平板為對照（CK），每處理重復3次，于26 ℃恒溫培養箱內黑暗培養，自接菌后的第2～5 d每間隔24 h用數碼相機固定焦距后拍照，用ImageJ 1.51軟件進行菌落直徑和菌落面積的獲取。以拍攝時間為x，當天菌落面積的自然對數為Y，用SLOPE函數計算得到病原菌的菌絲生長速率^[18]。菌絲生長抑制率=（對照菌落直徑-處理菌落直徑）/（對照菌落直徑-菌餅直徑）×100%，以菌絲生長抑制率為縱坐標（Y），藥劑質量濃度的常用對數值為橫坐標（x），求出毒力回歸方程和相關系數（r），計算各處理的抑制中濃度（EC₅₀）。使用R語言vioplot工具進行菌絲生長速率概率分布分析，利用Pearson相關法^[19]分析菌絲生長速率和致病力間的相關性。

1.7 草莓擬盤多毛孢根腐病菌產孢量測定

試驗設計同方法1.6。在草莓擬盤多毛孢根腐病菌對苯醚甲環唑敏感性試驗中，接種培養第10 d從6個地域來源的菌株中各選取1株，共6株，進行產孢量測定。具體測定方法為：用打孔器從培養基中心接菌處向外依次呈十字輻射狀取一定數量直徑為5 mm的菌餅，置于加有5 ml無菌水的離心管中，并加入5～8粒滅菌的玻璃珠，于轉速為200 r/min的恒溫26 ℃搖床中震蕩20 min，以促進孢子釋放。隨后用無菌牙簽將病原菌餅取出，于4 000 r/min低速離心機中離心12 min，棄上清液后加入200 μl無菌水，于10×10倍顯微鏡下采用血球計數板計算每1 cm²孢子數，每菌株重復測定3次。

2 結果與分析

2.1 草莓擬盤多毛孢根腐病菌的致病力

病斑面積是病原菌致病力的重要特征。草莓離體葉片在接種73株擬盤多毛孢根腐病菌后2～5 d病斑面積呈不斷擴大的趨勢（圖2）。不同地域來源的菌株接種后第5 d平均病斑面積和2～5 d AUDPC分別為1.65～5.91 cm²和3.08～13.48。來自涼山的17株菌株致病力較強，第5 d平均病斑面積和AUDPC分別為5.91 cm²和15.79，云南昆明的6株菌株致病力最弱，第5 d平均病斑面積和AUDPC分別為1.65 cm²和3.08。不同地域來源的菌株，甚至來源同一地域的菌株接種后第5 d病斑面積和AUDPC存在顯著差異，說明不同地域來源甚至來源同一地域的病原菌存在較大的致病力差異（表3）。隨著菌株來源地年平均溫度的增加，菌株的AUDPC呈增大趨勢，即AUDPC與菌株來源地的年平均溫度呈顯著正相關（圖3）。

2.2 苯醚甲環唑對草莓擬盤多毛孢根腐病菌菌絲生長的影響

圖4為不同苯醚甲環唑質量濃度對呼和浩特草莓擬盤多毛孢根腐病菌菌株HHHT-2接種5 d后菌絲生長的影響。從圖4中可以看出，隨苯醚甲環唑質量濃度的增加，草莓擬盤多毛孢根腐病菌生長受到的抑制作用增強。不同苯醚甲環唑質量濃度下，供試的73株病原菌菌絲生長速率概率分布如圖5所示。73株病原菌最高概率密度所對應的菌絲生長速率及菌絲生長速率均值（期望值）隨苯醚甲環唑質量濃度的增加逐漸降低。不同地域來源的病原菌菌絲生長速率存在一定的差異（表4）。在CK以及0.50 μg/ml、1.50 μg/ml、3.00 μg/ml苯醚甲環唑質量濃度下，病原菌的平均菌絲生長速率分別為0.96、0.80、0.74和0.70。整體來看，來自年平均溫度較低地區（呼和浩特和臨沂）的病原菌生長速率較快，而來自年平均溫度較高地區（福州和涼山）的病原菌生長速率較慢。在CK以及0.50 μg/ml、1.50 μg/ml、3.00 μg/ml苯醚甲環唑質量濃度下，病原菌菌絲生長速率與采樣地的年平均溫度的相關系數分別為-0.58、-0.53、-0.79和-0.92。隨苯醚甲環唑質量濃度的增加病原菌菌絲生長速率和年平均溫度的負相關性越強，在3.00 μg/ml時呈極顯著負相關。說明在化學藥劑的脅迫下，病原菌的菌絲生長速率受本地年平均溫度的影響愈嚴重。

2.3 草莓擬盤多毛孢根腐病菌對苯醚甲環唑的敏感性

EC₅₀是體現病原菌對殺菌劑敏感程度的重要指標。苯醚甲環唑對73株草莓擬盤多毛孢根腐病菌的EC₅₀為0.01～2.94 μg/ml，平均值為1.34 μg/ml。在草莓擬盤多毛孢根腐病菌對苯醚甲環唑的敏感性測定范圍內，將EC₅₀分為6個區間，統計每個區間內的菌株個數及頻率，可以看出73株草莓擬盤多毛孢根腐病菌對苯醚甲環唑的敏感性頻率分布呈單峰變化（圖6）。EC₅₀為0.51～1.00 μg/ml區間內菌株分布最多，其頻率值為24.46%。9株采集自鹽城地區的菌株呈現較高的EC₅₀（1.63 μg/ml），來自臨沂的18株菌株呈現較低的EC₅₀（1.21 μg/ml）（表5），說明臨沂地區的草莓擬盤多毛孢根腐病菌比鹽城地區的對苯醚甲環唑更敏感，可見不同地域來源的病原菌株對苯醚甲環唑的敏感性不同。

2.5 草莓擬盤多毛孢根腐病菌菌絲生長速率與產孢量的相關性

對不同地域來源的6株草莓擬盤多毛孢根腐病菌產孢量的分析結果表明，不同地域來源的菌株在不同苯醚甲環唑質量濃度下其產孢量存在一定差異，隨苯醚甲環唑質量濃度增加病原菌產孢量下降，在CK以及0.50 μg/ml、1.50 μg/ml、3.00 μg/ml苯醚甲環唑質量濃度下6個病原菌平均產孢量分別為1 cm²6.17個、4.00個、3.61個、2.93個。產孢量與菌絲生長速率的相關性分別為-0.39，-0.82，-0.92，-0.74。在0.50 μg/ml和1.50 μg/ml苯醚甲環唑質量濃度下菌絲生長速率與產孢量均呈顯著負相關（圖8）。

3 討論

在植物病害的防控過程中，探究植物病原菌與寄主的進化演化規律是病害防控的關鍵，病原菌的致病力除和自身的生物學特性相關外，同時也受寄主植物與外界環境的共同影響^[18，20]。在全球氣候變化的大背景下，病原菌為更好地生存和繁衍會通過遷移或改變自身的適應能力來應對環境的變化。有關病原菌致病力的評價指標多采用潛伏期、發病率或病斑面積等，本研究基于不同時間病斑面積及AUDPC進行評價。研究發現不論是病斑面積還是AUDPC對不同地區間菌株的致病力評價結果一致，不同地域來源的菌株以及同一地區的菌株個體間致病力存在較大差異，且不同地域菌株間的致病力和樣本來源地的年平均溫度呈顯著正相關（圖3），來自年平均溫度較高地區如福州和涼山的菌株呈現較高的致病力，反之則低。這說明草莓擬盤多毛孢根腐病菌對溫度可能存在本地適應性，這與前人在擬盤多毛孢乃至其他病原真菌和卵菌上的研究結果一致^[18，21]。

病原菌的抗藥性是指對殺菌劑敏感的植物病原菌個體或群體長期受到農藥的作用引起的^［22-23］，由于靶標基因的位點突變以及靶標基因和運輸體基因的過量表達等遺傳變異呈現出對藥劑敏感性下降的現象^[24]。草莓生產上除用苯醚甲環唑防治擬盤多毛孢根腐病外，還用來防控炭疽根腐病（Colletotrichum crown rot）和疫霉根腐病（Phytophthora crown rot）等一些常見的病原真菌或卵菌病害。由于頻繁連續使用苯醚甲環唑，導致生產上用藥量逐年上升，已有較多病原菌對苯醚甲環唑產生抗藥性的報道^[25-28]。本研究發現不同苯醚甲環唑質量濃度下，不同地域來源的草莓擬盤多毛孢根腐病菌菌絲生長速率存在一定差異，來自年平均溫度較低地區（呼和浩特和臨沂）的病原菌生長相對較快，敏感性較差，預示著這些采樣地的草莓擬盤多毛孢群體中可能存在對該藥劑敏感性低的天然耐藥菌株。本研究所選菌株樣本均為生長期未施用過苯醚甲環唑及其相同作用機制藥劑的菌株，整體來看，73株草莓擬盤多毛孢根腐病菌對苯醚甲環唑的敏感性特征（EC₅₀）呈單峰曲線，平均EC₅₀為1.34 μg/ml，同前人^{[8，11，29]}的研究結果相比敏感性有所降低。因此，在未來使用苯醚甲環唑甚至相同作用機制藥劑時應格外重視其抗藥性的監測。菌絲生長速率的差異表明草莓擬盤多毛孢根腐病菌可能在侵染寄主時存在致病力的差異，在對其進行致病力測定時發現73株病原菌在致病力上存在顯著差異，而致病力差異與菌絲生長速率差異類似，在不同菌株間存在特異性。不同苯醚甲環唑質量濃度下草莓擬盤多毛孢根腐病菌菌絲生長速率和致病力之間不存在相關性，這說明在實際侵染寄主植物時菌絲生長速率并不能與致病力及發病程度直接相關。6株不同地域來源的菌株產孢量也存在較大差異，已有研究結果證明真菌的致病毒素在其致病過程中發揮關鍵作用，毒素多由孢子萌發產生，一般來講產孢量多意味著其毒素產生量多，對寄主植物的致病力越強^[30]。本研究發現，不同苯醚甲環唑質量濃度下草莓擬盤多毛孢根腐病菌的菌絲生長速率與產孢量的相關性存在差異，且菌絲生長速率和AUDPC不存在相關性。這可能因為致病力除與毒素產量相關外，還與細胞壁降解酶、主要致病因子多聚半乳糖醛酸酶等多種因素有關造成的^[31]。因此，不同病原菌菌株致病力差異機理尚需進行更深入全面的研究。

總之，考慮到作用機制和降低抗藥性風險，建議生產中應盡量避免苯醚甲環唑等DMI（14α-脫甲基酶抑制劑）類藥劑的單一使用，盡量將其與其他內吸性或者保護性殺菌劑混合或者交替使用，最大限度延長苯醚甲環唑的使用壽命。此外，各地的病原菌在致病力、菌絲生長速率等方面存在一定的差異，因此，還應根據當地的氣候環境制定草莓擬盤多毛孢根腐病的區域防控策略，從而實現對病害的可持續有效防控。

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（責任編輯：石春林）