大蒜熱激轉錄因子基因AsHSFB1的克隆、亞細胞定位及其表達分析

楊青青　楊峰　趙永強　陸信娟　劉燦玉　葛潔　張碧薇　樊繼德

摘要： 熱激轉錄因子（HSF）基因是植物熱脅迫響應的重要轉錄調節基因，在植物脅迫應答和其他抗逆反應過程中起著關鍵作用。為研究大蒜熱激反應的分子機制，本研究基于大蒜轉錄組數據，以徐蒜6號為試驗材料，采用同源克隆方法獲得編碼HSF的AsHSFB1基因。序列分析結果顯示，AsHSFB1含有882 bp的開放閱讀框，編碼293個氨基酸，其蛋白質含有熱激轉錄因子的特征結構域。在進化關系上，AsHSFB1與擬南芥AT4G11660（AtHSFB2B）同源性最高。亞細胞定位結果表明，AsHSFB1蛋白主要定位在細胞核和細胞質上。本研究采用同源重組技術成功構建pCAMBIA1305-AsHSFB1過表達載體，為進一步研究該轉錄因子基因的功能，培育耐熱大蒜品種奠定基礎。RT-PCR分析結果表明，不同大蒜品種中，AsHSFB1基因在葉片中相對表達水平均最高，具有組織表達特異性；38 ℃高溫脅迫處理下，徐蒜6號中的AsHSFB1基因相對表達水平在24 h時明顯上調；4 ℃低溫脅迫下，徐蒜815和徐蒜6號中AsHSFB1基因相對表達水平的變化趨勢相似，均先上升后下降，在處理4 h時相對表達水平達到峰值。

關鍵詞： 大蒜；AsHSFB1基因；同源重組技術；亞細胞定位；相對表達水平

中圖分類號： S633.4 文獻標識碼： A 文章編號： 1000-4440（2023）01-0169-09

Cloning， subcellular localization and expression analysis of garlic heat shock transcription factor gene AsHSFB1

YANG Qing-qing， YANG Feng， ZHAO Yong-qiang， LU Xin-juan， LIU Can-yu， GE Jie， ZHANG Bi-wei， FAN Ji-de

（Xuzhou Institute of Agricultural Sciences in Jiangsu Xuhuai Area， Xuzhou 221121， China）

Abstract：Heat shock transcription factor （HSF） is an important transcription regulation gene and plays a key role in plant stress response and other stress tolerance processes. In order to investigate the molecular mechanism of heat stress response in garlic， based on the transcriptome data of garlic， the experiment was conducted to obtain AsHSFB1 gene. This gene encoding HSF transcription factor was isolated by homologous cloning of Xusuan NO.6. Sequence analysis indicated that open reading frame （ORF） length of AsHSFB1 was 882 bp， encoding 293 amino acids. Its protein contained characteristic domain of heat shock transcription factor. Phylogenetic tree analysis result showed that AsHSFB1 was close to AT4G11660 （AtHSFB2B）. Subcellular localization results showed that AsHSFB1 was mainly localized in the nucleus and cytoplasm. In this study， overexpression vector pCAMBIA1305-AsHSFB1 was successfully constructed by homologous recombination technology， which provided a theoretical basis for the subsequent study on the function of AsHSFB1 gene and the cultivation of heat-resistant garlic varieties. RT-PCR analysis showed that the relative expression level of AsHSFB1 gene in garlic leaves was highest， indicating that it had tissue specificity. Compared with the control， the relative expression level of AsHSFB1 gene in Xusuan No.6 increased significantly at 24 h under 38 ℃ high temperature stress. Under 4 ℃ low temperature stress， the relative expression level of AsHSFB1 gene in Xusuan No.6 and Xusuan 815 showed a similar trend， which increased first and then decreased and reached the peak at 4 h.

Key words： garlic;AsHSFB1 gene;homologous recombination technology;subcellular localization;relative expression level

隨著全球氣候的變化，熱脅迫已成為限制植物代謝和作物生產力的主要環境脅迫之一^[1-2]。熱激反應是真核生物響應熱脅迫廣泛存在的保守進化反應，通常表現為停止正常的蛋白質合成和細胞活動以實現熱激蛋白（HSP）的表達^[3-4]。熱激轉錄因子（HSF）可以通過直接或間接調控一些應答基因的表達來調節植物對高溫脅迫的響應^[5-6]。

HSF基因在植物中普遍存在，其數量、結構和調控過程遠比動物體內的HSF復雜。目前根據序列相似性和寡聚化結構域的結構特征，可以將植物HSF基因家族成員劃分Class A、Class B和Class C 3類^[7]。HSF結構一般由識別并結合熱激元件（HSE）的N端DNA結合域、調控HSP轉錄的寡聚化結構域、核定位信號和核輸出信號組成^[8]。Scharf等^[9]首次在番茄中克隆得到HSF基因。Mishra等^[10]對番茄植株進行高溫處理，發現SlHsfA1基因的表達量顯著增加。在擬南芥HSFA2基因的熱脅迫研究中發現，該基因在高溫脅迫下大量表達，可能主導了擬南芥的抗高溫脅迫響應^[11]。Li等^[12]發現，玉米ZmHsf06基因可能在提高過表達擬南芥植株的耐高溫、抗旱能力中發揮主要作用。在42 ℃高溫處理下，不同時間段百合LlHSF1基因均有響應，證實該基因與百合的耐熱性相關^[13]。此外，有研究發現，HSF轉錄因子還參與調控植物配子形成和根發育等過程^[14]。例如，在擬南芥和向日葵中，發現HsfA9與胚胎發育、種子形成有關^[15-16]。因而挖掘植物HSF相關基因，對植物耐熱性分子機制與育種途徑、耐熱性生理基礎等研究具有重要意義。

大蒜（Allium sativum L.）是具有醫藥作用的蔬菜作物，在世界范圍內廣泛種植^[17-18]。大蒜植株的耐寒能力較強，但不耐高溫，是低溫長日照作物，因此在栽培過程中，高溫天氣會嚴重影響大蒜的產量和品質^[19-20]。但目前關于大蒜中AsHSFB1的表達是否響應高溫、低溫脅迫的研究卻鮮有報道。本研究擬對大蒜中AsHSFB1基因進行克隆，并進行生物信息學分析，研究其在特定溫度下的表達特性，以期為進一步探索其功能提供依據。

1 材料與方法

1.1 植物材料及其試驗設計

以徐蒜6號、徐蒜815（江蘇徐淮地區徐州農業科學研究所園藝研究室保存）為試驗材料，選取已經解除休眠、飽滿、無傷的鱗莖，播種于基質中，14 d之后將大蒜幼苗移栽到添加霍格蘭氏（Hoagland）營養液的水培箱中。此外，選擇生長一致、健壯的植株進行高溫（38 ℃）、低溫（4 ℃）脅迫處理。空氣相對濕度設置為30%，每個處理重復3次。在處理0 h、4 h、8 h、24 h和48 h時取大蒜植株上部葉片，用液氮冷凍，并在-80 ℃條件下儲存備用。

1.2 RNA提取和cDNA反轉錄

利用RNA提取試劑盒提取大蒜的RNA，并使用反轉錄試劑盒ReverTra Ace qPCR RT Master Mix將RNA反轉錄為cDNA，并將該cDNA用去離子水稀釋15倍用于基因克隆。

1.3 AsHSFB1基因的擴增

根據課題組建立的大蒜轉錄組數據庫，檢索得到大蒜AsHSFB1基因序列。使用軟件Primer Premier 6設計AsHSFB1基因全長引物，根據同源重組引物設計原則，選擇Bam H Ⅰ、Hind III 2個限制性內切酶，設計克隆正向引物：5′-CGGGATCCCGATGACGCCAGCGGTCGAT-3′）和反向引物5′-CGAAGCTTCGTCACATTGCACTATGCTTTCTCCC-3′。程序設置為：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，54 ℃退火30 s，72 ℃延伸60 s，共34個循環；72 ℃延伸10 min。回收PCR目的條帶。本研究所有引物合成、測序工作均由生工生物工程（上海）股份有限公司完成。

1.4 利用同源重組法構建大蒜AsHSFB1基因表達載體

利用Bam H Ⅰ、Hind III 2個內切酶對pCAMBIA1305載體進行雙酶切，獲得線性化的載體，將含有酶切位點的目的片段重組到pCAMBIA1305空載體上，轉化到大腸桿菌DH5α，篩選陽性克隆測序。

1.5 大蒜AsHSFB1基因的生物信息學分析

不同植物的HSFB1氨基酸序列比對利用DNAMAN 6.0軟件完成；運用ExPASy蛋白質組分析工具中的Prot-Param（http：//www.expasy.ch/tools/protparam.html）分析蛋白質的基本性質；利用CDD（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/cdd/）預測大蒜AsHSFB1氨基酸保守域；用SOPMA軟件對大蒜AsHSFB1蛋白進行二級結構預測及分析；利用MEGA 5.0軟件以Neighbor-Joining算法構建系統發育樹^[21]；運用plantCARE在線分析工具分析AsHSFB1啟動子。

1.6 AsHSFB1蛋白的亞細胞定位

利用基因和載體的序列設計、重組新的引物，對去掉終止密碼子的AsHSFB1基因進行擴增。選取Bsa Ⅰ/Eco31 Ⅰ酶切位點，設計特異性引物（正向引物5′-CAGTCGTCTCACAACATGACGCCAGCGGTCGATTCAC-3′，反向引物5′-CAGTCGTCTCATACACATTGCACTATGCTTTCTCCCCAACGG-3′）來擴增AsHSFB1基因，切膠回收PCR產物檢測無誤后與線性化載體pBWA（V）HS-GFP進行連接，連接產物轉化至大腸桿菌DH5α，挑取陽性單克隆進行測序驗證后，即獲得重組質粒pBWA（V）HS-AsHSFB1-GFP，利用電擊法將其重組融合表達載體pBWA（V）HS-AsHSFB1-GFP導入農桿菌GV3101。通過懸浮農桿菌、收集菌體，再經過重懸后，用1 ml注射器分別將含有綠色熒光蛋白（GFP）和pBWA（V）HS-AsHSFB1-GFP的緩沖液注射到30 d左右苗齡煙草的葉片背面，將侵染后的煙草弱光培養48 h后使用激光共聚焦顯微鏡觀察亞細胞定位情況。

1.7 RT-qPCR分析

使用Primer Premier 6軟件設計AsHSFB1基因的RT-qPCR定量引物（正向引物：5′-CAGCAGCAGTGACAGTAG-3′，反向引物：5′-CTTGGACATAAGCGAGTAGA-3′）。選擇SNAD基因作為大蒜內參基因（BD-SAND-F：5′-GCGTCAACGAATGTTCCAATTACCA-3′，BD-SAND-R：5′-TCTCTTCAGTCTCAACTTCATCAGCAT-3′）。通過IQTM5 Real-time PCR System完成RT-qPCR檢測。基因相對表達水平的計算采用2^-△△Ct法^[22]。

2 結果與分析

2.1 大蒜AsHSFB1基因的克隆及其編碼的蛋白質理化性質的分析

以徐蒜6號未經脅迫處理葉片的cDNA為模板進行擴增，得到1個長約800 bp的目的片段（圖1）。測序結果顯示AsHSFB1基因含有1個長度為882 bp的開放閱讀框，編碼293個氨基酸。NCBI BlastP結果顯示，AsHSFB1屬于HSF家族成員。

通過ExPaSy-ProtParam預測顯示AsHSFB1蛋白的分子式為C₁363H₂170N₃88O₄47S₁1，相對分子質量為3.149×104，理論等電點（pI）為6.76，帶正電荷的殘基總數[精氨酸（Arg）+賴氨酸（Lys）]為33個，帶負電荷的殘基總數[天冬氨酸（Asp）+谷氨酸（Glu）]為33個；不穩定系數為53.37，說明AsHSFB1蛋白屬于不穩定蛋白質；AsHSFB1蛋白富含絲氨酸（Ser，14.7%）、甘氨酸（Gly，8.2%）、亮氨酸（Leu，7.5%）（圖2）。AsHSFB1蛋白的二級結構主要由螺旋（33.11%）、延伸結構（12.36%）、轉角（4.1%）和無規則卷曲（50.17%）構成。

2.2 大蒜AsHSFB1基因相關生物信息學分析

2.2.1 保守域結構預測 通過NCBI CDS對徐蒜6號中AsHSFB1蛋白的保守域進行預測，結果（圖3）表明，AsHSFB1的第14位至第106位氨基酸間含有HSF-DNA結構域，屬于HSF家族。

2.2.2 同源性比對分析 將大蒜AsHSFB1與NCBI數據庫中水仙（Narcissus tazetta，登錄號：QBC36000.1）、薯蕷（Dioscorea cayenensis，登錄號：QBC36000.1）、楊梅（Morella rubra，登錄號：KAB1210726.1）、金杜鵑（Rhodamnia argentea，登錄號：XP_030536717.1）和獼猴桃（Actinidia chinensis，登錄號：PSR93425.1）5種植物的HSFB1氨基酸序列通過DNAMAN 6.0進行序列比對，結果（圖4）表明，大蒜AsHSFB1氨基酸序列與水仙、金杜鵑的HSFB1氨基酸序列的一致性較高，說明HSFB1具有較高的保守性。

2.2.3 親水性/疏水性分析 對大蒜的AsHSFB1蛋白進行疏水性/親水性預測，結果（圖5）表明，該蛋白質的親水性平均系數（GRAVY）為-0.502，具有較強的親水性，屬于親水性蛋白質。

2.2.4 AsHSFB1進化樹的分析 通過MEGA 5.0軟件對大蒜AsHSFB1與擬南芥HSF家族進行同源性分析。圖6顯示，AsHSFB1與AT4G11660、AT5G62020.1、AT2G41690進化距離最近，且屬于同一分支。AsHSFB1與AT4G11660（AtHSFB2B）的同源性最高，其次與AT5G62020.1（AtHSFB2A）類熱激轉錄因子的同源性也比較高，因此，大蒜AsHSFB1屬于HSFB亞家族成員。

2.2.5 AsHSFB1啟動子的生物信息學分析 利用PlantCARE啟動子預測元件分析AsHSFB1啟動子的順式調節元件，并列出11種常見的元件（圖7、表1），這些元件包括厭氧誘導必需的順式作用調節元件ARE，赤霉素響應元件GARE-motif，參與MeJA反應的順式調控元件CGTCA-motif，參與脫落酸反應的順式作用元件ABRE，核心啟動子元件TATA-box，蛋白質結合位點HD-Zip3，啟動子增強的順式調節元件CAAT-box以及4個光響應元件（Box 4、G-Box、Gap-box和ACE）。

2.3 基于同源重組克隆技術構建大蒜AsHSFB1表達載體

將重組得到pCAMBIA1305-AsHSFB1質粒進行酶切鑒定，能夠切出大小為800 bp左右的片段（圖8），說明成功構建了pCAMBIA1305-AsHSFB1植物過表達載體（圖9）。

不同顏色的片段是推定的元素序列。

2.4 大蒜AsHSFB1蛋白亞細胞定位

為明確AsHSFB1在細胞中的位置，以GFP空載體為陽性對照，在本氏煙草中進行亞細胞定位測定。圖10顯示，細胞核及細胞質上均有熒光信號，說明AsHSFB1蛋白主要定位在細胞核和細胞質中。

2.5 AsHSFB1基因在不同組織中、不同溫度處理下的表達

RT-qPCR分析結果（圖11）表明，徐蒜815、徐蒜6號AsHSFB1基因在葉片中的相對表達水平均表現為顯著高于其在根和鱗莖中的相對表達水平，而根和鱗莖間AsHSFB1基因的相對表達水平差異不顯著。

圖12顯示，38 ℃高溫處理下，徐蒜815中AsHSFB1相對表達水平在高溫處理4 h、24 h時與0 h（對照）相比顯著升高，在處理24 h時達到峰值，是對照的12.48倍；徐蒜6號中AsHSFB1相對表達水平在高溫處理24 h時達到最高，是對照的17.82倍。4 ℃低溫處理下，隨著處理時間的增長，徐蒜815和徐蒜6號中AsHSFB1基因的相對表達水平均呈現先升高后下降的趨勢，并且均在處理4 h和48 h分別達到最高和最低。

3 討論

在熱激反應中HSF作為關鍵調控因子，主要通過調控下游熱激蛋白基因以及耐熱性相關基因的表達來發揮抗逆作用^[23-24]。當植物遭受高溫脅迫時，HSF不再以單體的形式存在于細胞質中，而是形成特殊結構三聚體進入細胞核，通過特異性識別啟動子區的熱激元件來激活熱激基因轉錄，進而生成HSP來抵抗高溫脅迫^[25-26]。本研究從大蒜品種徐蒜6號中克隆得到AsHSFB1基因，保守結構域分析結果表明AsHSFB1屬于HSF家族，具有典型的HSF-DNA結構域。通過多重序列比對分析，發現大蒜AsHSFB1氨基酸序列與水仙、金杜鵑HSFB1氨基酸序列的一致性較高，表明HSFBL具有較高的保守性。大蒜AsHSFB1與擬南芥HSF家族成員構建的進化樹顯示，大蒜AsHSFB1屬于HSFB亞家族成員。RT-qPCR結果顯示：不同大蒜品種中AsHSFB1基因對38 ℃高溫和4 ℃低溫2種逆境環境均有響應。對大蒜AsHSFB1基因表達特性進行深入研究，發現不同品種大蒜AsHSFB1基因在不同組織（根、鱗莖、葉片）中均有表達且具有組織表達特異性，在葉片中的相對表達水平最高。

目前，關于植物中HSF家族B亞族的研究并不多。在番茄中，HSFB1作為協同激活因子，與HSFA家族成員共同參與對高溫脅迫的調節^[27]。擬南芥中過表達鷹嘴豆CarHSFB2基因增強了擬南芥的耐熱性^[28]。擬南芥中的HSFB2a、HSFB2b可以通過與HSFA1a、HSFA1b結合，從而提高擬南芥的耐熱性，屬于熱誘導型轉錄因子^[29]。由于大蒜AsHSFB1是HSFB亞家族成員，而B亞家族成員不含芳香族-疏水-酸性氨基酸尾巴（AHA）序列，因此大蒜AsHSFB1基因可能是通過與HSFA類基因的協同作用來增強植株的抗熱能力。在魔芋^[30]和香石竹^[31]中都成功克隆到HSFB1基因，發現魔芋AaHSFB1和香石竹DcHSFB1蛋白N端均有典型的DBD結構域，這一點與大蒜AsHSFB1蛋白N端也具有DBD結構域的結果一致，并且大蒜AsHSFB1與來源于其他物種的HSFB1均存在HSF保守結構域。HSFB基因的表達存在物種、組織的差異，芹菜品種津南實芹中AgHSFB2基因在葉片和根中的相對表達水平明顯高于莖^[32]。魔芋AaHSFB1基因在球莖中的表達量低于根和葉片^[30]。在本研究中，大蒜AsHSFB1基因在葉片中的相對表達水平顯著高于根和鱗莖。

通過對大蒜幼苗進行高溫、低溫逆境脅迫處理，在不同的處理時間（0 h、4 h、8 h、24 h和48 h）進行取樣，可以較為深入地研究溫度對大蒜AsHSFB1表達模式的影響。結果表明：38 ℃高溫脅迫處理下，徐蒜815和徐蒜6號中AsHSFB1基因均能響應熱脅迫，并且都在處理24 h時相對表達水平達到最高；4 ℃低溫處理時，在大蒜幼苗經歷低溫的48 h之內，徐蒜815和徐蒜6號中AsHSFB1基因相對表達水平總體呈現先升高后下降的趨勢，均在低溫脅迫4 h時達到峰值，隨后開始下降。AsHSFB1基因在相同溫度處理下表現出品種的差異，38 ℃高溫處理下，徐蒜6號中AsHSFB1基因的相對表達水平總體高于徐蒜815。綜上所述，大蒜熱激轉錄因子基因AsHSFB1可能參與其對高溫、低溫逆境的響應過程，但作用機制還需要進一步研究。

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（責任編輯：王 妮）