益生菌對萬壽菊發酵品質及葉黃素含量的影響

甄莉娜　劉麗珍　朱晉緯　潘登奎　劉慧君

摘要：萬壽菊是提取葉黃素的天然原料，由于使用單一乳酸菌，發酵周期長，葉黃素損失量大，文章分別選用2種益生菌菌群（乳酸菌菌群、乳酸菌+芽孢桿菌菌群），采用2個接種量（2‰、5‰）發酵萬壽菊鮮花，通過比較感官指標、溫度、pH值、還原糖和葉黃素酯含量來研究益生菌對萬壽菊鮮花發酵的影響。結果表明，發酵結束后，由乳酸菌發酵萬壽菊的感官評價指標優于乳酸菌+芽孢桿菌菌群，乳酸菌對pH和還原糖含量的降低效果較好，5‰接種量發酵效果優于2‰。發酵57 h后，乳酸菌+芽孢桿菌菌群的發酵溫度均高于乳酸菌，接種量越大，溫度波動越小。5‰乳酸菌和2‰乳酸菌+芽孢桿菌菌群發酵萬壽菊葉黃素酯含量保存效果較好。與常規萬壽菊發酵效果相比，益生菌菌群發酵能夠更好地縮短發酵周期，減少葉黃素酯的損失。

關鍵詞：萬壽菊發酵;乳酸菌;芽孢桿菌;葉黃素酯

中圖分類號：TS201.3文獻標志碼：A 文章編號：1000-9973（2023）06-0195-04

Abstract： Tagetes erecta is a natural raw material for extracting lutein. Due to the long fermentation period and the large loss amount of lutein caused by using a single lactic acid bacterium， two probiotic bacteria floras （lactic acid bacteria flora， lactic acid bacteria+Bacillus flora） are selected in this paper， and two inoculation amounts （2‰，5‰） are used to ferment Tagetes erecta flowers. The effects of probiotics on fermentation of Tagetes erecta flowers are studied by comparing sensory indexes， temperature， pH value， reducing sugar and lutein ester content. The results show that the sensory evaluation indexes of Tagetes erecta fermented by lactic acid bacteria are better than those of Tagetes erecta fermented by lactic acid bacteria+Bacillus? flora after fermentation， lactic acid bacteria have a better effect on reducing pH and reducing sugar content， and the fermentation effect of 5‰ inoculation amount is better than that of 2‰ inoculation amount. After 57 hours of fermentation， the fermentation temperature of lactic acid bacteria+Bacillus flora is higher than that of lactic acid bacteria， and the greater the inoculation amount， the smaller the temperature fluctuation. The content of lutein ester in Tagetes erecta fermented by 5‰ lactic acid bacteria and 2‰ lactic acid bacteria+Bacillus flora has a good preservation effect. Compared with conventional Tagetes erecta fermentation effect， fermentation by probiotic flora can better shorten the fermentation period and reduce the loss of lutein ester.

Key words： Tagetes erecta fermentation; lactic acid bacteria; Bacillus; lutein ester

收稿日期：2022-11-26

基金項目：國家自然科學基金項目（31400479）；山西省應用基礎研究計劃項目（201801D121258，201901D111306）；大同市平城區重點研發計劃項目（202003）；大同大學科研項目（2021CXZ7，202177）

作者簡介：甄莉娜（1983—），女，副教授，博士，研究方向：微生物發酵、礦區生態修復。

*通信作者：劉慧君（1977-），男，副教授，博士，研究方向：動植物有效成分的提取、分離與檢測。

葉黃素是一種天然色素，在萬壽菊（Tagetes erecta）花中含量很高，占總類胡蘿卜素的90%以上[1]。萬壽菊花中含有葉黃素和6種葉黃素二酯，顏色越深，葉黃素酯的含量越高，色素含量與脂肪含量呈正相關[2]。

萬壽菊的鮮花部分葉黃素含量最高[3]，為了能較高程度地提取葉黃素，本試驗采用萬壽菊鮮花進行發酵。萬壽菊提取葉黃素預處理工藝流程：鮮花采摘→保鮮發酵→去水干燥→粉碎造粒[4-6]。萬壽菊鮮花中的化學成分主要有水、粗脂肪、灰分、粗蛋白、粗纖維、總糖等，其中，含量最高的是水（占48.15%），其次是總糖（占36.28%）[7]。發酵可以使萬壽菊鮮花中結合狀態的葉黃素變成游離狀態，游離狀態的葉黃素很容易被有機溶劑萃取出來[8]；萬壽菊鮮花中的水分直接影響葉黃素的提取，通過發酵可以盡可能地分離出鮮花中的水分，且花朵色澤仍保持鮮艷[9]。萬壽菊鮮花中總糖占30%左右，通過乳酸菌等微生物的發酵可消耗菊花中的糖類，便于之后造粒；在發酵過程中，乳酸菌能很快生長增殖，從而產生很多乳酸和乙酸，這些產物既對有害菌有較強的抑制作用，同時也可以起到軟化細胞壁的作用，便于后續葉黃素的提取；對萬壽菊鮮花進行發酵處理，可以使萬壽菊鮮花細胞壁破裂，使葉黃素更易被提取出來[10]。

本試驗采用大同本地的萬壽菊花進行發酵試驗，通過設置不同的菌種類型、接種量和發酵溫度，檢測發酵過程中的溫度、pH、還原糖含量和葉黃素酯含量，來探究使用益生菌對萬壽菊發酵的適宜條件。在保證葉黃素含量和質量的前提下，使萬壽菊盡可能地進行充分發酵，縮短發酵時間，提高發酵效率，便于后續葉黃素的提取與分離。

1 材料與方法

1.1 材料與設備

1.1.1 試驗材料

于山西省大同縣萬壽菊種植基地采摘萬壽菊鮮花作為試驗材料。

1.1.2 供試菌種

發酵菌劑A：乳酸菌菌群（植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）、嗜酸乳桿菌（Lactobacillus acidophilus）、兩岐雙岐桿菌（Bifidobacterium bifidum）），發酵菌劑B：乳酸菌+芽孢桿菌菌群（枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）、地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）、凝結芽孢桿菌（Bacillus coagulans）、植物乳桿菌、嗜酸乳桿菌），菌劑A與菌劑B菌種均由各菌種等比例混合而成。發酵菌劑均由山西大同大學農學與生命科學學院微生物實驗室分離篩選。

1.1.3 試驗試劑

葡萄糖（生化試劑）、3，5-二硝基水楊酸、酒石酸鉀鈉、重蒸酚、亞硫酸鈉、氫氧化鈉：均為分析純。

1.1.4 主要儀器設備

HPX-9272MBE恒溫培養箱、9070MBE恒溫鼓風干燥箱 上海博迅實業有限公司；C21-Simple 103電磁爐 美的集團；SP-723紫外可見分光光度計 上海光譜儀器有限公司；JH1102精度天平 上海精科天美科學儀器有限公司；DK-8D電熱恒溫水浴鍋 常州市國旺儀器制造有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 萬壽菊發酵試驗

試驗設置2種益生菌菌劑類型，分別為乳酸菌菌群（發酵劑A）和乳酸菌+芽孢桿菌菌群（發酵劑B），每種菌群各2個接種量（2‰、5‰），并設置空白對照組，共5個處理，每個處理重復3次，計算平均值。

分別稱取新摘的萬壽菊14 kg，放入塑料箱中，將2種菌劑分別溶于300 mL蒸餾水中，攪拌均勻，并將其分別接入萬壽菊鮮花中，混合均勻。對照組倒入300 mL蒸餾水。15袋萬壽菊均在27～30 ℃下培養。

1.2.2 pH測定方法

稱取5 g發酵中的萬壽菊花瓣，放入小燒杯中，再加入30 mL去離子水，攪拌1 min，放置5 min后，用校準后的筆式pH計進行測定并記錄[11]。

1.2.3 溫度測定方法

將兩支溫度計同時插入發酵中的萬壽菊中部的不同位置，30 s后讀數，取兩支溫度計讀數的平均值，每隔5 h測定一次溫度。

1.2.4 還原糖含量的測定

將萬壽菊發酵過程中取得的樣品烘干后，用粉碎機進行粉碎，發酵結束后測定還原糖的含量。本試驗采用比色法，在540 nm波長處測定還原糖的含量[12]。

1.2.5 葉黃素酯含量的測定

取適量的提取物，按測定葉黃素含量的標準曲線制作方法，在443 nm處測其吸光度值，代入回歸方程，求出提取物中葉黃素酯的含量[6]。

1.2.6 萬壽菊發酵的感官評價

為了能比較直觀地反映萬壽菊花的發酵效果，對發酵結束萬壽菊的質量優劣進行評定[13]。感官評價標準見表1。

2 結果與分析

2.1 發酵過程中溫度的變化

由圖1可知，菌劑A的發酵溫度表現出先升高后降低的趨勢，5‰和2‰添加量在發酵23 h和33 h時達到高峰，均高于36 ℃；菌劑B的發酵溫度波動較大，經歷了2個高峰期，發酵后期溫度較高，5‰水平在發酵23 h和67 h時分別達到37.5 ℃和36 ℃，5‰水平在發酵19 h和62 h時達到第2個高峰期，均為36 ℃。

2.2 萬壽菊發酵后的感官評分

發酵結束后，對萬壽菊進行感官評價，結果見表2。

用乳酸菌菌群（菌劑A）發酵的處理組與用乳酸菌+芽孢桿菌菌群（菌劑B）發酵的處理組相比，其顏色、質地、氣味更好；乳酸菌接種量為5‰時發酵效果更好。對照組發酵過程中花色變暗褐色，腐爛變質。

2.3 發酵過程中pH值的變化

萬壽菊發酵過程中pH的變化見圖2。與對照相比，菌劑A發酵萬壽菊pH值顯著降低（P＜0.05），在發酵55 h左右下降幅度最大，2種添加量在發酵結束后pH值相近；菌劑B（乳酸菌+芽孢桿菌菌群）發酵的萬壽菊，芽孢桿菌占主導地位，在發酵過程中pH雖然有所下降，但變化幅度不大，均低于對照組。乳酸菌將植物組織中可溶性的碳水化合物轉化成有機酸，短時間內降低了pH值，抑制了其他雜菌的生長[14]。

由圖4可知，還原糖含量表現出先降低后升高的趨勢，且在整個發酵過程中，均低于空白對照組。在發酵前33 h內，2種益生菌菌劑均使萬壽菊還原糖含量驟降，菌劑A（乳酸菌菌群）的還原糖含量低于菌劑B（乳酸菌+芽孢桿菌菌群）。萬壽菊發酵過程中還原糖含量與溫度變化成反比。發酵前期，乳酸菌對還原糖的降解量高于芽孢桿菌，可能是由于乳酸菌在發酵初期快速消耗糖類化合物轉化成乳酸等物質[14]。芽孢桿菌的抗逆性強，在厭氧和好氧條件下均能生長繁殖，能夠產生蛋白酶、脂肪酶等水解酶，芽孢桿菌在后期對還原糖增加幅度較大，可能是芽孢桿菌產生纖維素酶，降解萬壽菊中的纖維素轉化成糖類所致[15]。有研究發現乳酸菌+芽孢桿菌發酵玉米秸稈，使還原糖含量提高了3倍[16]。

2.5 發酵過程中葉黃素酯含量的變化

由圖6可知，在菌劑A和菌劑B的2個添加量發酵50 h之后，葉黃素酯的含量均達到最低，與鮮花相比，乳酸菌菌群和乳酸菌+芽孢桿菌菌群萬壽菊花干粉損失葉黃素酯量分別是5～6 mg/g和4～5 mg/g。發酵后期，隨著鮮花中水分的散失，發酵花中葉黃素酯的含量不斷增加，葉黃素酯含量的升高可能是發酵過程中水分的消耗與蒸發以及營養物質被大量分解利用，使得葉黃素酯的相對含量升高[17]。對萬壽菊進行發酵處理時，為使萬壽菊花的顏色保持鮮艷，發酵時間仍應在50 h以內，此時的糖含量較低，便于后續的造粒工藝且葉黃素酯的損失較少；相同條件下，乳酸菌的接種量越大，發酵速度越快。

3 小結

試驗選用2種不同的益生菌菌群，在不同接種量下對萬壽菊鮮花進行發酵，通過觀察不同處理組的顏色、氣味和測量發酵過程中的溫度、pH以及還原糖含量等指標來獲得萬壽菊發酵的適宜條件。結果發現，由乳酸菌發酵萬壽菊的感官評價指標優于乳酸菌+芽孢桿菌，乳酸菌對pH和還原糖含量的降低效果較好，5‰接種量發酵效果優于2‰。發酵57 h后，乳酸菌+芽孢桿菌菌群的發酵溫度均高于乳酸菌，接種量越大溫度波動越小。5‰乳酸菌和2‰乳酸菌+芽孢桿菌菌群發酵萬壽菊葉黃素酯含量保存效果較好。與常規萬壽菊發酵相比，益生菌菌群發酵能夠縮短發酵周期，減少葉黃素的損失。結合感官評價指標分析，要保持萬壽菊花的顏色鮮艷，發酵時間應在2 d以內，若發酵時間過長則易導致萬壽菊花色變化，從而影響葉黃素酯的提取。

參考文獻：

[1]QUACKENBUCH F W.Use of heat to saponify xanthophyll esters and speed analysis for carotenoids in feed material： collaborative study[J].Journal of Association of Official Analytical Chemists，1973，56：748-753.

[2]孟麗，趙文軍.萬壽菊干花中葉黃素酯的超聲提取工藝研究[J].食品工業科技，2009，30（3）：270-271.

[3]李鳳偉，劉麗娜.萬壽菊花中葉黃素提取工藝的優化[J].湖北農業科學，2012，51（18）：4094-4096.

[4]張志強，凡前峰，李佳佳，等.萬壽菊葉黃素的提取與皂化條件的研究[J].青海大學學報（自然科學版），2013，31（5）：39-43.

[5]王琦，高彥祥，劉璇.動態夾帶劑強化超臨界CO2萃取萬壽菊中葉黃素[J].中國調味品，2008（7）：30-33.

[6]吳紅艷，安琪，李秀鑫，等.葵花籽油微乳液對萬壽菊中葉黃素提取工藝優化[J].中國調味品，2021，46（9）：161-165.

[7]周曦，付娟娟，殷建忠.萬壽菊化學成分及其應用的研究進展[J].國外醫學（醫學地理分冊），2011，32（1）：51-52.

[8]道達·薩達·阿巴，于鋒，周蕓.利用干發酵方法處理廢棄物[J].沈陽化工大學學報，2014，28（2）：184-192.

[9]張志強，劉進風，呂伶俐，等.萬壽菊葉黃素的提取與皂化工藝研究[J].中國食品添加劑，2011（4）：97-101.

[10]孫丹丹，陶正國，吳秀麗.一株用于青貯萬壽菊的植物乳桿菌的分離、鑒定及發酵工藝研究[J].廣東飼料，2013，22（7）：18-21.

[11]梁寶玲，郎海洋，呼和.酸度計的校準與使用[J].內蒙古科技與經濟，2013（1）：96-97.

[12]江龍發.干紅葡萄酒中總糖快速測定技術研究[D].南昌：南昌大學，2015.

[13]吳興壯，張華，王小鶴，等.萬壽菊鮮花乳酸菌發酵技術研究[J].農業科技與裝備，2011（11）：30-31.

[14]馬媛，耿偉濤，王金菊，等.乳酸菌代謝與食品風味物質的形成[J].中國調味品，2019，44（1）：159-163.

[15]侯星，易弋，張興猛，等.發酵食品中微生物的功能特性[J].中國調味品，2019，44（1）：191-194.

[16]王巍杰，常麗新，田亞紅.枯草芽孢桿菌和乳酸菌混合發酵玉米秸稈制備飼料的工藝研究[J].飼料工業，2014，35（5）：35-37.

[17]吳興壯，張華，王小鶴，等.制備萬壽菊葉黃素技術研究進展[J].食品工業科技，2012，33（6）：456-459.