氣相色譜法測定鹽酸平陽霉素原料及其制劑中的殘留溶劑

韓彬?徐艷梅?周玉巖?李佳蕊?高燕霞

摘要：目的 建立頂空進樣-氣相色譜法測定鹽酸平陽霉素原料及其制劑中有機溶劑殘留量，同時對國產樣品質量現狀進行評價。方法 采用氣相色譜法，頂空進樣；色譜柱為DB-624毛細管柱（60 m×0.53 mm， 3.0 μm），載氣為高純氮氣，程序升溫，氫火焰離子化檢測器（FID），進樣口溫度為200℃，檢測器溫度為 230℃，載氣流速為 5.0 mL/min，分流比為 10：1，進樣量1 mL。結果 鹽酸平陽霉素原料中可檢出甲醇、丙酮、異丙醇3種溶劑；應用經驗證的新方法對征集到的原料進行測定，其中一廠家的3批產品批間差異非常小，提示其生產工藝穩定，另一廠家的產品檢出的丙酮含量超出國家限定值范圍。 注射用鹽酸平陽霉素中有機溶劑殘留量遠低于限度要求。結論 該方法操作簡單、快速靈敏、結果準確，可通過對鹽酸平陽霉素有機溶劑殘留量的測定，對藥品生產的工藝控制水平進行評估。建議我國藥品生產企業在內控標準中增訂殘留溶劑檢查項，并開展周期性地檢驗，及時發現生產中的質量波動情況；注射用鹽酸平陽霉素采用冷凍干燥工藝生產，因而不需控制殘留溶劑。

關鍵詞：鹽酸平陽霉素；殘留溶劑；質量分析；工藝控制

中圖分類號：R978.1文獻標志碼：A

Abstract Objective To establish a headspace sampling-gas chromatography method for the determination of residual organic solvents in bleomycin A5 hydrochloride， and to evaluate the quality status of domestic raw materials and powder for injections. Methods Gas chromatography and headspace injection were used. The chromatographic column was a DB-624 capillary column （60 m×0.53 mm， 3.0 μm） with high purity nitrogen as carrier gas， temperature programmed， hydrogen flame ionization detector （FID）， injection port temperature of 200℃， detector temperature of 230℃， carrier gas flow rate of 5.0 mL/min. The shunt ratio was 10：1， and the injection volume was 1 mL. Results Three solvents， methanol， acetone and isopropanol， were detected in the raw material of Bleomycin A5 hydrochloride. The new verified method was used to determine the collected raw materials. The difference between the three batches of products from one manufacturer was very small， indicating that the production process was stable. The residual amount of organic solvent in bleomycin A5 hydrochloride for injection is far below the limit requirement. Conclusion The method is simple， rapid， sensitive， and accurate. It can be used to evaluate the process control level of drug production by determining the residual organic solvent of bleomycin A5 hydrochloride. It is suggested that Chinese drug manufacturers should add residual solvent inspection items in the internal control standards， and carry out periodic inspection to discover the quality fluctuation in production in time. It is not necessary to control the residual solvent of bleomycin A5 hydrochloride for injection， which is produced by freeze drying process.

Key words Bleomycin A5 hydrochloride; Residual solvent; Quality analysis; Process control

鹽酸平陽霉素，又名爭光霉素是我國由平陽鏈霉菌發酵液中分離，并自主研發的抗腫瘤類抗生素[1]，制劑注射用鹽酸平陽霉素為鹽酸平陽霉素凍干品。臨床上主要用于治療唇癌、舌癌、齒痕癌和鼻咽癌等頸部鱗癌[2]，其主成分化學結構與博來霉素A5組分一致，但肺毒性低于博來霉素[3]，同時本品不抑制機體的免疫功能，無常用抗癌藥物所引起的白細胞減少癥狀，且價格低廉，是優良的進口抗癌藥物替代品種。1994年進入首批國家基本藥物目錄，現行質量標準收載于《中國藥典》2020年版二部[4]。

鹽酸平陽霉素發酵液中伴生多種雜質[5]，生產過程需要多次提純，其工藝的穩定性直接影響產品的質量。提純中使用到的有機溶劑主要有甲醇、丙酮和異丙醇3種，然而現行質量標準中未對殘留溶劑做出要求，檢索近年文獻，亦無相關報道。

殘留溶劑的評估是原料生產過程控制的重要環節。本文根據人用藥物注冊技術要求國際協調會（ICH）的相關規定和《中國藥典》2020年版四部通則 0861“殘留溶劑測定法” 的要求，采用氣相色譜法測定鹽酸平陽霉素原料中3種有機溶劑的殘留量，進而評估鹽酸平陽霉素原料的生產工藝穩定性，同時用建立的方法考察注射用鹽酸平陽霉素中有機溶劑殘留情況，為檢查項目設置必要性提供數據支持。

1 儀器與試劑

1.1 儀器

安捷倫7890B氣相色譜儀；氫火焰離子化檢測器（FID）；純水氫氣發生器（濟南浩偉實驗儀器有限公司）；SGK-2LB低噪空氣泵（北京東方精華苑科技有限公司）；Open LBACDS Chem Station Edition工作站；德國梅特勒XS205電子分析天平。

1.2 藥品與試劑

鹽酸平陽霉素原料，廠家1，批號：Y190401、Y200901、Y200902；廠家2，批號：200322。注射用鹽酸平陽霉素，廠家1，批號：190501、200501、200801、200901；廠家2，批號：20200424、20200519。水是實驗室自制超純水（電阻率18.2Ω）；甲醇、丙酮、異丙醇均為色譜純。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

采用Agilent DB-624毛細管色譜柱（60 m×0.53? mm，3.0 μm）；檢測器為氫火焰離子化監測器（FID）；進樣口溫度為200℃；檢測器溫度為230℃；采用程序升溫方式：起始柱溫為40℃，維持2 min，以5℃/min的速率升溫至100℃，維持8 min，再以20℃/min的速率升溫至200℃，維持5 min；載氣為高純N2，柱流速為5 mL/min；頂空瓶平衡溫度設定為70℃，頂空平衡時間30 min。

2.2 溶液配制

混合對照品貯備液：精密稱取甲醇1.50 g、丙酮2.50 g、異丙醇2.50 g，分置50 mL量瓶中，用水稀釋至刻度，搖勻；精密量取上述3溶液各5 mL置同一50 mL量瓶中。用水稀釋至刻度，搖勻，即得含甲醇、丙酮、異丙醇分別為3、5和5 mg/mL 的混合對照品貯備液。

對照品溶液：精密量取混合對照品貯備液5 mL，置50 mL量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，精密量取2 mL置頂空瓶中，密封，即得。

供試品溶液：精密稱取供試品0.2 g，置頂空瓶中，精密加入水2 mL溶解，密封，即得。

2.3 專屬性試驗

精密量取“2.2”項下混合對照品溶液、空白溶液（水）和供試品溶液，照“2.1”項下方法測定，記錄色譜圖（圖1）。在該色譜條件下，出峰順序依次為：甲醇（4.713 min）、丙酮（6.683 min）和異丙醇（6.896 min），各色譜峰分離度均大于1.5；理論板數均大于50000，溶劑對樣品測定無干擾，其它雜質峰對測定無干擾。

2.4 檢出限及定量限測定

精密量取混合對照品溶液，逐級稀釋，照“2.1”項下色譜條件測定，記錄色譜峰高并與信噪比（S/N）比較，當峰高約為10倍的S/N時，該供試品濃度即為定量限（LOQ）；當約為3倍的S/N時，即為檢出限（LOD）。檢測結果見表1。

2.5 線性關系考察

精密量取混合對照品貯備液各0.1、0.5、1、2和5 mL分別置于10 mL量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，制成系列標準曲線混合對照測試溶液。精密量取2 mL置頂空瓶中，密封，按“2.1”項下色譜條件測定，記錄峰面積。以溶液濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標，進行線性回歸，分別得到甲醇、丙酮、異丙醇的標準曲線線性回歸方程及線性范圍，結果見表2。

2.6 準確度試驗

精密量取混合標準貯備液0.8、1.0、1.2置10 mL量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，即得標準加入液（1）、（2）、（3）；精密稱取鹽酸平陽霉素原料（批號：Y200901）0.2 g，共9份，分3組，置頂空瓶中，分別加入上述混合對照溶液2.0 mL，密封。照“2.1”項下測定，記錄色譜圖；以峰面積，按外標法，測定甲醇、丙酮和異丙醇的回收率（表3），測定結果提示方法的準確性良好。

2.7 精密度試驗

2.7.1 進樣精密度試驗

取對照品溶液注入氣相色譜儀，記錄色譜圖。重復進樣6次，計算RSD，考察本法的儀器精密度。結果：甲醇保留時間RSD為0.01%，峰面積RSD為1.0%，丙酮保留時間RSD為0.0%，峰面積RSD為0.7%，異丙醇保留時間RSD為0.01%，峰面積RSD為0.8%，進樣精密度良好。

2.7.2 重復性試驗

取鹽酸平陽霉素原料1批（批號：Y190401）和混合對照品貯備溶液，照擬定方法，平行制備6份，考察本法的重復性。結果：同一實驗人員重復測定6次，6次測定結果比較甲醇、丙酮和異丙醇的檢出量一致。方法重復性良好。

2.8 溶液穩定性試驗

按對照品溶液配制方法制備，于室溫放置0、1、2、3、4、5和6 h，取不同放置時間的上述溶液注入氣相測定，結果：室溫放置6 h，對照品溶液中甲醇、丙酮和異丙醇峰面積RSD分別為4.1%、1.6%和1.9%（n=7），對照品溶液在6 h內穩定。

2.9 耐用性試驗

分別考察了載氣流速3.0、4.0和5.0 mL/min；進樣口溫度180℃、200℃和220℃和檢測器溫度210℃、230℃和250℃，以及分流比5：1、10：1條件下3種有機溶劑的色譜保留行為，結果見表4。在各色譜條件下甲醇、丙酮和異丙醇3種溶劑分離度及理論塔板數均符合要求，提示本方法色譜條件的耐用性良好。

2.10 樣品測定

取鹽酸平陽霉素原料4批（批號：Y190401、Y200901、Y200902和200322）和注射用鹽酸平陽霉素6批（190501、200501、200801、200901、20200424和20200519），每份0.2g，按“2.1”項下方法測定，記錄峰面積，外標法計算有機溶劑殘留量，結果見表5。

3 討論

3.1 色譜條件篩選

鹽酸平陽霉素易溶于水，待測3中有機溶劑與水溶解度良好，因此選擇水為溶劑；甲醇、丙酮和異丙醇的沸點分別為64.8℃、56.5℃和82.4℃，沸點均低于水的沸點，因而選擇頂空進樣。取供試品溶液，固定加熱時間30 min，分別考察50℃、60℃、70℃、80℃和90℃頂空條件下，待測組分峰面積變化及降解雜質對測定的干擾情況。實驗發現，在70℃條件下，各待測組分均有良好相應，且降解雜質對測定無影響，因此確定頂空溫度為70℃。取混合對照品溶液，固定頂空溫度為70℃，分別考察加熱10、20、30、40和50 min時待測溶液的氣液平衡狀態。實驗發現，30 min后，各組分峰面積趨于穩定，以30 min分離度最好，且檢測周期適宜，因此確定頂空條件為70℃，加熱30 min。

3.2 樣品分析

通過微生物發酵工藝或半合成過程生產的抗生素，組分較復雜，生產工藝中常用有機溶劑對粗品進行結晶提純，如果工藝參數控制不嚴格，成品中殘留有機溶劑的量將出現較大變異，因此，以殘留溶劑是表征提純工藝穩定性的重要指標之一。對征集到的兩個廠家4批原料藥的檢測結果提示，一個廠家的樣品均符合《中國藥典》四部通則0831殘留溶劑測定[6]中的限度要求，且3批批間差異非常小，提示其生產工藝穩定。另一個企業的樣品，丙酮含量超過國家標準限度近一倍，但由于僅有一批樣品，無法評價其工藝穩定性。雖然在兩個企業的6批制劑中，殘留溶劑均未被檢出或殘留量較低，其原因為注射用鹽酸平陽霉素采用冷凍干燥工藝生產，原料中的低沸點溶劑在制劑過程中可以被去除。但企業內控質量標準中設立殘留溶劑檢查項，并周期性地進行測定，對評估生產工藝的仍穩定性具有重要意義。

3.3 小結

殘留溶劑與原料提純工藝密切相關。對其殘留量進行分析，可以體現出藥品生產企業的工藝控制水平，同時也暴露出不同企業間生產工藝的差距。建議我國藥品生產企業制訂內控質量標準，并周期性地開展檢驗，以便及時發現生產中的質量波動情況，注射用鹽酸平陽霉素殘留溶劑檢出量遠遠低于標準限度，標準中無需增加殘留溶劑檢查項。

參 考 文 獻

張瑞， 許鴻章， 婁志賢. 爭光霉 素的研究[J]. 微生物學報， 1980， 20（1）： 76-81.

許鴻章， 張鶴鏞. 平陽霉素的分離和鑒別[J]. 藥學學報， 1980， 15（10）： 609-614.

甄永蘇， 李電東. 抗腫瘤抗生素平陽霉素研究與臨床應用40年[J]. 中國抗生素雜志， 2009， 34（10）： 577.

國家藥典委員會. 中華人民共和國藥典[S]. （2020年版二部）. 北京： 中國醫藥科技出版社， 2020： 1085-1087.

虞惺， 許永壽， 李妙兒. 平陽霉素發酵中若干問題的探討[J]. 抗生素， 1979， （3）： 7-14.

國家藥典委員會. 中華人民共和國藥典[S]. （2020年版四部）. 北京： 中國醫藥科技出版社， 2020： 116-120.