Oligo-FISH涂染揭示柚粗線期1 號染色體的結構及配對

何禮 張國艷 陳克玲 何建 關斌 李文婷 劉建軍

摘要：【目的】深化柑橘減數(shù)分裂粗線期染色體結構組成和配對分析。【方法】首次利用柑橘染色體全長特異寡核苷酸熒光原位雜交（oligo-fluorescence in situ hybridization，oligo-FISH）涂染探針，精準示蹤鑒定沙田柚粗線期1 號染色體的結構特征，比較其與有絲分裂間期細胞核、有絲分裂前中期和中期染色體的結構差異，并揭示粗線期全長染色體的同源配對。【結果】觀測到同源配對的全長粗線期與有絲分裂中期較大染色質(zhì)結構差異。經(jīng)測定，柚粗線期1 號染色體平均全長、長臂長、短臂長和臂比分別為中期的13.93 倍、16.54 倍、10.44 倍和1.54 倍，表現(xiàn)出更高FISH 信號分辨率。檢測到柚粗線期1 號染色體著絲粒附近約3.01 Mb的探針信號缺失區(qū)。【結論】首次實現(xiàn)柑橘特定全長粗線期染色體的跟蹤研究，為深入開展其結構和配對遺傳利用的精準研究提供了新方法。

關鍵詞：柑橘；粗線期；寡核苷酸熒光原位雜交；染色體涂染；分辨率

中圖分類號：S666 文獻標志碼：A 文章編號：1009-9980（2023）04-0788-09

柑橘是世界上最重要和最廣泛種植的果樹之一。自然界中柑橘及其近緣種基本為二倍體（2n=2x=18）[1]，近年也創(chuàng)制、篩選并積累了大量柑橘多倍體材料[2]。染色體細胞遺傳研究不僅是柑橘類種屬起源進化分析的重要手段[3-4]，更是減數(shù)分裂同源或部分同源染色體配對遺傳利用研究的直接工具[5-6]，還能夠輔助全基因組測序的驗證[7]。而對特定單條染色體特別是減數(shù)分裂前期Ⅰ中單條全長染色體的精準識別，是實現(xiàn)以上研究的關鍵。

由于缺乏染色體全長特異的DNA 探針，在大多數(shù)植物中無法跟蹤研究單條染色體[8-9]。柑橘類為小染色體（1～4 μm）物種[10]，已在其有絲分裂中期細胞上開展了廣泛的染色體識別和比較鑒定，包括利用染色體色霉素A3（chromomycin A3，CMA）熒光顯帶[10-13]，以及綜合CMA顯帶、rDNA、基因組中其他重復序列[14-15]和染色體特異細菌人工染色體（bacterial artificial chromosome，BAC）探針標記的熒光原位雜交（fluorescence in situ hybridization，F(xiàn)ISH）[16-18]。然而，以上標記僅識別染色體上的特定區(qū)段，無法跟蹤研究細胞分裂活動，特別是減數(shù)分裂各時期的單條全長染色體，例如涉及同源染色體精細配對的粗線期染色體，它相較于中期Ⅰ的配對分析能更準確評估染色體的同源性[6，19]。另外，雖已經(jīng)完成部分柑橘種的基因組測序，但精準組裝仍受基因組中大量重復序列的干擾，可利用粗線期染色體高分辨率的FISH輔助基因組的組裝和驗證，特別是含有大量重復序列的著絲粒及附近異染色質(zhì)區(qū)[7]。而中期染色體太小[10]，F(xiàn)ISH 信號的分辨率極低，難以精準觀察測定。

最近，基于寡核苷酸的新型DNA文庫已迅速成為“新一代”的植物染色體精準研究FISH 探針[9，19]。利用生物信息學手段，實現(xiàn)了從任何植物物種組裝的基因組序列中，篩選出針對染色體特定區(qū)域或整個染色體鑒定的寡核苷酸序列，經(jīng)人工合成后標記作為染色體鑒定的特異FISH 探針[19]。利用覆蓋整個染色體的寡核苷酸探針能夠產(chǎn)生“染色體涂染（chromosome painting）”信號，實現(xiàn)了有絲及減數(shù)分裂中特定單條染色體的精準追蹤[4-6，19-21]。筆者已在柑橘中研創(chuàng)了所有9 條全長染色體特異的寡核苷酸涂染探針，準確鑒定了有絲分裂中期所有染色體[4]。筆者在本研究中旨在利用柑橘1 號染色體的特異涂染FISH探針，首次進行沙田柚減數(shù)分裂粗線期染色體的跟蹤研究；同時以有絲分裂不同濃縮階段的染色質(zhì)做對比，揭示粗線期與有絲分裂各時期染色體結構及FISH信號分辨率的巨大差異，為精準解析粗線期染色體結構和特定區(qū)段序列組成，輔助全基因組特別是測序組裝困難的著絲粒及附近異染色質(zhì)區(qū)的測序組裝驗證提供新工具，也為染色體的配對遺傳利用，特別是柑橘多倍體減數(shù)分裂粗線期染色體的精準研究奠定新的方法基礎。

1 材料和方法

1.1 植物材料

選取柑橘類代表種沙田柚[Citrus maxima（Burm.） Merr.‘Shatian pummelo，2n=2x=18]用作染色體涂染分析。植物材料保存于四川省農(nóng)業(yè)科學院園藝研究所成都試驗基地。

1.2 染色體特異涂染探針制備

前期，參照Albert 等[20]的方法開發(fā)了柑橘染色體特異涂染探針[4]。利用Chorus2 軟件（https：//github.com/zhangtaolab/Chorus2）從Citrus maxima 的參考基因組中（https：//citrus.hzau.edu.cn/orange/index.php）篩選1 號染色體上的長45 個堿基的單拷貝寡核苷酸。利用Citrus maxima 的基因組序列數(shù)據(jù)（SRR4294213）[22]過濾重復寡核苷酸序列。寡核苷酸探針文庫由Arbor Biosciences（Ann Arbor， 密歇根， 美國）合成。按照Han 等[19]的方法用地高辛標記染色體涂染探針。

1.3 有絲分裂中期染色體制片

以根尖為材料制備有絲分裂中期染色體制片。截取新鮮的根尖在1.10 mPa壓力下用N2O處理2 h，然后在固定液（3 倍乙醇/1 倍冰醋酸）中固定備用。根尖用蒸餾水洗滌10 min 后，用2%（w，后同）纖維素酶（Yakult Pharmaceutical，日本）和1%果膠酶（Sigma，美國）在37 ℃水浴鍋中酶解140 min。采用滴片法制取有絲分裂中期染色體[4]。

1.4 減數(shù)分裂粗線期染色體制片

以花蕾為材料制取減數(shù)分裂粗線期染色體。選新鮮并未變白的花蕾，用固定液（3 倍乙醇/1 倍冰醋酸）固定備用。用花蕾中的1 個花藥壓片鏡檢花粉母細胞是否處于粗線期，其余花藥用作酶解制片。花藥用蒸餾水洗滌20 min，后用3%纖維素酶（Yakult Pharmaceutical，日本）和2%果膠酶（Sigma，美國）的酶解液在37 ℃水浴鍋中酶解5 h。采用滴片法制取粗線期染色體[6]。

1.5 寡核苷酸熒光原位雜交（Oligo-FISH）

參照He等[4]的方法開展Oligo-FISH和檢測。雜交液含寡核苷酸探針200 ng，去離子甲酰胺10 μL，50%硫酸葡聚糖4 μL，20×SSC 2 μL，加蒸餾水至20 μL。地高辛標記的探針用抗地高辛異硫氰酸熒光素（fluorescein isothiocyanate isomer，F(xiàn)ITC）（Roche Diagnostics，美國）檢測。用含4，6-二脒基-2-苯基吲哚（4， 6-diamidino-2-phenylindole，DAPI）的VectaShield 抗淬滅劑（Vector Laboratories，美國）對染色體進行復染。用蔡司Axio Scope A1 熒光顯微鏡上耦合的電荷耦合器件（charge coupled device，CCD）相機（ORCA Flash4.0，濱松，日本）拍攝FISH圖像。用Adobe Photoshop 5.0 調(diào)整圖像的亮度和對比度。

用Image J 軟件測定中期和粗線期染色體的長度，并用其中的“Straighten”插件拉直彎曲的粗線期染色體。

2 結果與分析

2.1 柚有絲分裂中期染色體涂染鑒定

筆者前期利用Chorus2 軟件（https：//github.com/zhangtaolab/Chorus2），以柚基因組DNA 序列開發(fā)了柑橘類物種所有9 條染色體的特異性涂染探針[4]。為了篩選能夠均勻覆蓋1 號染色體的寡核苷酸，從1 號染色體的DNA序列中篩選了27 392 個長為45 bp 的單拷貝寡核苷酸序列（寡核苷酸分布密度為0.85 個·kb-1）作為混合池，用作該染色體鑒定的特異涂染探針。

經(jīng)綠色熒光檢測，在柚有絲分裂中期細胞中，能清楚鑒定出1 號染色體的2 條同源染色體（圖1）。然而，F(xiàn)ISH信號在1 號染色體上的分布并不均勻，部分區(qū)域沒有觀察到信號或信號非常微弱（圖1-B）。這可能是1 號染色體對應區(qū)域單拷貝寡核苷酸的密度相對較低（小于0.1 個·kb-1）引起的。

2.2 間期細胞核及前中期染色體可視化

為了識別中期染色體外其他不同分裂階段濃縮的染色質(zhì)，并展現(xiàn)可視化單個染色體占據(jù)的區(qū)域，利用1 號染色體特異涂染探針開展了FISH（圖2）。對柚根尖細胞進行FISH涂染，結果清晰顯示細胞核中的2 個同源染色體分別位于獨立的區(qū)域（圖2-B），且染色質(zhì)呈離散狀態(tài)，濃縮程度極低。前中期細胞上的探針信號顯示，每個同源染色體相較間期時更濃縮，但相對中期時濃縮程度更低。中部無信號或信號微弱的染色體區(qū)段清晰可見（圖2-D，箭頭）。然而，此時染色體各部位的特征，特別是著絲粒不易辨認。試驗表明，特異探針涂染能有效示蹤有絲分裂各周期的1 號染色體。

2.3 減數(shù)分裂粗線期染色體Oligo-FISH涂染

為了精準示蹤減數(shù)分裂粗線期1 號染色體，利用特異涂染探針（圖3）進行了FISH 標記。除著絲粒及緊鄰的亞著絲粒小區(qū)段外，足夠密度的探針信號將該染色體從末端到末端標記了出來，清晰地展示了粗線期2 條1 號同源染色體從末端到末端充分配對的情況。利用探針信號（圖3-B），清晰展示了減數(shù)分裂粗線期的狀態(tài)，即使在眾多染色體相互纏繞以致幾乎無法辨認其形態(tài)的情況下（圖3-A），也能夠準確反映特定粗線期染色體在細胞中的分布及配對情況，并進行精準跟蹤研究。在15 個粗線期細胞中觀察到，1 號染色體的2 條同源染色體均表現(xiàn)從末端到末端的完整配對，展示了它們之間高度的同源性。結果表明，采用特異探針涂染能精準有效示蹤粗線期染色體及同源染色體配對。

經(jīng)DAPI 染色后，著絲粒區(qū)染色淺且兩側分布DAPI 染色明亮的亞著絲粒異染色質(zhì)區(qū)（圖3-E），染色體臂上的常染色質(zhì)區(qū)染色較淺。短臂上綠色探針信號覆蓋至非常接近DAPI 染色淺的著絲粒區(qū)（圖3-E）。結合著絲粒位置及短臂挨著絲粒區(qū)信號消失的特征，甚至能在眾多相互纏繞的粗線期染色體上定位著絲粒（圖3-A～B箭頭指示），并能據(jù)此準確測定染色體臂長及總長。測得15 個粗線期細胞1 號染色體的平均總長為（27.48±1.89）μm，是有絲分裂中期高度濃縮染色體長度的13.93 倍（表1）；粗線期長臂平均長度為中期長臂的16.54 倍，高于染色體全長的倍率，表明粗線期長臂的伸展程度高于整條染色體的平均值；粗線期短臂長為中期的10.44 倍，低于染色體全長的倍率，更低于長臂的倍率，表明粗線期短臂的伸展程度除低于整條染色體的平均值外，更遠低于長臂的伸展程度。

雖在有絲分裂中期和前中期1 號染色體上能夠觀察到探針信號較弱或缺失的區(qū)域，但因染色體濃縮程度較大，分辨率低，導致難以準確鑒定其所處的區(qū)段。借助涂染探針信號，在粗線期染色體上清晰觀察到1 段信號缺失區(qū)，但在眾多染色體相互纏繞的減數(shù)分裂相中，較難厘清該區(qū)段所處區(qū)域及染色質(zhì)特征（圖3-A～B）。因此，利用涂染探針信號作指示，選取與其他染色體無交叉重疊的粗線期1 號染色體（圖3-D～E），以準確鑒定整條染色體上常染色質(zhì)和異染色質(zhì)區(qū)的分布特征，以及涂染探針信號在不同染色質(zhì)區(qū)的精準分布。用Image J 軟件分離并拉直了圖3-D來自2 個細胞中無交叉重疊的2 條粗線期1 號染色體。染色體灰度圖非常清晰地顯示，即使2 條粗線期染色體的濃縮程度存在差異，它們的常染色質(zhì)（DAPI 染色較淺）和異染色質(zhì)（DAPI 染色明亮）分布模式，以及探針信號在對應位置的覆蓋情況仍極為相似（圖3-E）。短臂絕大多數(shù)區(qū)域為DAPI染色明亮的異染色質(zhì)區(qū)。占長臂約1/3 長度且靠近著絲粒區(qū)域為較為集中的異染色質(zhì)區(qū)，余下近端粒段2/3 的長臂均為DAPI 染色較淺的常染色質(zhì)區(qū)。然而，從細胞學的角度認為富含重復序列的異染色質(zhì)區(qū)幾乎均被單拷貝寡核苷酸涂染探針信號覆蓋，說明相應區(qū)域仍含有一定比例的單拷貝DNA序列，能夠進行基因組組裝。在DAPI 染色最強烈的區(qū)域，探針信號相對其他區(qū)域明顯更微弱，如短臂和長臂上各有1 個明亮的異染色質(zhì)區(qū)域；在包括著絲粒及長臂緊鄰著絲粒DAPI 染色明亮的整個亞著絲粒異染色質(zhì)區(qū)幾乎沒有任何信號。

經(jīng)Image J 軟件測定，粗線期1 號染色體上連續(xù)無信號的著絲粒及緊鄰亞著絲粒區(qū)長度為（2.36 ±0.34）μm，占染色體總長的8.58%。由于涂染探針篩選自基因組測序組裝大小為32.08 Mb的柚1 號染色體[22]，很可能完全對應探針信號覆蓋區(qū)域的大小。假定DNA含量在全長染色體上呈均衡分布，1號染色體的大小可計算為32.08 Mb ÷（100%-8.58%）=35.09 Mb，而著絲粒附近信號缺失區(qū)段的大小為35.09 Mb×8.58%=3.01 Mb。

3 討論

標準的單條染色體鑒定方法可實現(xiàn)中期染色體及其他不同細胞分裂階段濃縮染色質(zhì)的識別。最近的研究利用生物信息學手段，研發(fā)基于單拷貝寡核苷酸序列的FISH涂染探針，能夠在任何已獲得基因組序列的植物種中應用[9，21]，并已在許多植物種中取得成功，包括黃瓜[19]、馬鈴薯[6，23]、水稻[24]和楊樹[25]等。即使在大基因組的小麥[26]和玉米[20]中也獲得了成功。這相對于傳統(tǒng)在小基因組模式植物擬南芥和二穗短柄草中采用大量BAC混合池作FISH 涂染探針[27-28]，取得了革命性的進步，將極大地提升染色體FISH 涂染在眾多植物種中的應用。已有柑橘及多個相關種屬完成了全基因組測序組裝[22，29-30]，可用作該新型染色體精準鑒定單拷貝FISH 寡核苷酸探針的發(fā)掘。筆者新近研發(fā)了柑橘所有9 條染色體特異的涂染探針[4]，為基于FISH 技術開展豐富的柑橘及相關種屬間系統(tǒng)精準染色體結構變異鑒定和進化分析提供了有力工具[9，21]。筆者在本研究中利用柑橘1號染色體特異FISH涂染探針，實現(xiàn)了在有絲分裂間期細胞核、前中期和中期細胞染色體及減數(shù)分裂粗線期染色體和其所在區(qū)域的可視化，可為開展柑橘染色體研究及育種利用提供強大工具，開拓柑橘染色體結構及特定區(qū)段序列組成精準研究，特別是柑橘多倍體材料減數(shù)分裂粗線期染色體精準配對和遺傳鑒定利用的新領域。

減數(shù)分裂是真核生物生命周期中染色體數(shù)目減少并產(chǎn)生配子的重要且特殊過程，有效地實現(xiàn)從末端到末端鑒定單條粗線期染色體，將大力推動減數(shù)分裂染色體配對機制的精準研究。前人研創(chuàng)了染色體全長涂染FISH探針，實現(xiàn)了玉米1 號染色體[20]、馬鈴薯7 號和11 號染色體[6]、黃瓜3 號染色體的全長示蹤[19]，以及不同倍性茄屬物種的粗線期染色體精細配對研究[6]。在柑橘中，前人采用的染色體鑒定方法包括CMA顯帶[10-13]，以及結合CMA顯帶、rDNA、基因組中篩選的其他重復序列[14- 15]和染色體特異BAC開展FISH[16-18]，均無法對減數(shù)分裂粗線期特定的全長染色體進行跟蹤研究。筆者在本研究中首次在柑橘粗線期染色體上開展FISH實驗，實現(xiàn)了單條全長粗線期染色體的精準鑒定，可解決對柑橘粗線期特定全長染色體進行跟蹤研究的難題。

染色體涂染探針能否有效示蹤鑒定粗線期染色體，與探針設計時染色體上篩選到的寡核苷酸分布密度有關[9]。在幾個不同的植物中，染色體上寡核苷酸的密度為0.1～0.5 個·kb-1時，足以在濃縮的中期染色體上產(chǎn)生高質(zhì)量的全染色體涂染信號[9]。但粗線染色體的長度為體細胞中期染色體的10～40倍[31]，因此，用涂染探針鑒定減數(shù)分裂粗線染色體，需要采用更高的寡核苷酸密度。1個密度為2個·kb-1的水稻9 號染色體探針在粗線染色體上顯示出良好的信號[24]。1 個密度為0.6 個·kb-1的馬鈴薯11 號染色體探針足以顯示整個粗線染色體[6]。玉米1 號染色體上密度為0.3 個·kb-1，可基本覆蓋粗線期染色體[20]，但信號覆蓋的密度明顯更低。本研究中柑橘1號染色體上寡核苷酸的密度為0.85 個·kb-1，在粗線期染色體上產(chǎn)生了很好的信號覆蓋，起到了很好的示蹤效果。涂染探針信號顯示，粗線期15 個細胞中的1 號染色體均表現(xiàn)從末端到末端的完整配對，證明2 條同源染色體的同源性高，與測序報道柚類基因組雜合度低的特征相吻合[29]。

前人研究表明，利用粗線期染色體開展FISH定位，可大大提高信號分辨率。在不同基因組大小的代表性物種中，將粗線期與有絲分裂中期的染色體長度進行比較，發(fā)現(xiàn)黑麥中的長度差異大于7 倍、玉米為10 倍、番茄為15 倍、擬南芥大于20 倍、水稻為40 倍[31]。因此，以高度伸展的粗線期染色體相較于高度收縮的中期染色體作靶標，具有高出數(shù)倍的FISH 信號分辨率[31-32]，是將DNA序列信息與染色體結構特征相結合極有效的方法，是高分辨率細胞遺傳圖譜構建的強大工具。例如在水稻早粗線期10號染色體上，可區(qū)分相距40 kb 的DNA 探針信號[32]。在番茄粗線期染色體常染色質(zhì)區(qū)FISH 定位的分辨率為120 kb，在異染色質(zhì)區(qū)為1.20 Mb[31]。本研究揭示，柑橘粗線期1 號染色體的平均長度為中期的13.93 倍，實現(xiàn)了柑橘粗線期染色體高分辨率的FISH 鑒定，為深入開展其結構精準研究提供了新方法。

本研究中測算出著絲粒及緊鄰的信號缺失區(qū)約為3.01 Mb，這在高度收縮的柑橘中期染色體上是極難測定的。由于著絲粒及附近異染色質(zhì)區(qū)DNA的濃縮程度高于全染色體上的平均值[31]，因此，該區(qū)段實際應大于3.01 Mb。利用著絲粒功能蛋白CENH3 免疫共沉淀測序，估算1 號染色體著絲粒區(qū)大小為7.6 Mb，含有大量長末端重復序列（long terminalrepeat，LTR）[33]。在基因組測序組裝時，很可能由于該區(qū)域富含高度重復DNA序列而未被當前的參考基因組覆蓋，因此未篩選到單拷貝寡核苷酸，表現(xiàn)為探針信號的缺失。研究結果顯示著絲粒及其緊鄰異染色質(zhì)的特定區(qū)段無信號覆蓋，提示該區(qū)域可能未完全實現(xiàn)基因組的組裝。

本研究表明高分辨率粗線期染色體FISH 涂染可應用于植物的基因組研究，檢查基因組序列組裝的完整性[34]，未來可用作測序組裝困難著絲粒和附近異染色質(zhì)區(qū)的輔助驗證，以及其他植物細胞遺傳學新研究。

4 結論首次在柑橘上利用染色體全長特異探針涂染，揭示了粗線期與有絲分裂各時期染色體結構及FISH 信號分辨率的巨大差異，為進一步探究柑橘減數(shù)分裂其余染色體的結構組成及不同倍性材料中的配對遺傳利用奠定了新的試驗基礎。

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