基于紫外可見光譜的紅葡萄酒關鍵質量指標快速監測

劉彩云 李慧穎 張倩瑋 范舒悅 陶永勝,2 李運奎,2

(1.西北農林科技大學葡萄酒學院, 陜西楊凌 712100;2.西北農林科技大學寧夏賀蘭山東麓葡萄酒試驗示范站, 永寧 750104)

0 引言

葡萄酒是一種具有很高商業價值的商品。葡萄酒釀造過程中品質指標的檢測對于產品的質量控制和等級劃分具有重要意義。酚類化合物是紅葡萄酒生產中的關鍵成分,因為它們在很大程度上決定了最終產品的感官特性。因此,對于葡萄酒廠而言,能否通過快速、簡單、準確且經濟的方式獲得紅葡萄酒發酵和陳釀過程中與酚類化合物的相關信息至關重要。其中黃烷醇、花色苷、黃酮醇、單寧等的變化對于葡萄酒的感官品質(如口感、顏色乃至香氣)都有重要的影響,被廣泛用于葡萄酒質量評估[1-2]。但目前還沒有快速、全面且經濟的方法來監測葡萄酒釀造過程中酚類物質的演變。顏色是葡萄酒最直觀的品質特征,也是決定消費者購買決策和體驗的重要因素。顏色反映了葡萄酒的類型、品質層次、陳釀潛力、營養價值等信息,顏色也作為葡萄酒生產過程中質量控制的重要依據和指標。葡萄酒產業亟需可靠的顏色質量控制手段幫助葡萄酒生產者更加方便、有效地進行葡萄酒色澤質量的管理和控制。

消費者對高質量和安全生產的葡萄酒的需求,要求在質量保證和過程控制方法方面有高標準,而這種需求又要求對葡萄酒在生產過程中和生產后進行適當的分析。葡萄酒發酵和陳釀過程中酚類成分分析方法與顏色管理需以最簡單的樣品制備,并在多個參數上快速產生結果才能獲得廣泛的工業應用。雖然有研究者探討了葡萄酒中酚類物質的分析方法,但都存在葡萄酒行業采用的局限性。如化學方法處理過程的繁瑣[3]、高效液相色譜(HPLC)等儀器昂貴的成本都限制了其在行業的應用[4]。隨著研究的不斷深入和創新,基于光譜的測定方法是目前最具吸引力的分析手段。迄今為止,這些預測葡萄和葡萄酒成分的方法主要集中在紅外光譜(Infrared spectroscopy)的使用上[5]。但紅外光譜對昂貴的專用儀器的需求,以及對產地、季節和品種的持續驗證要求,阻礙了這種技術在常規酚類分析中的應用[6]。因此仍需要能夠同時分析多種酚類物質質量濃度和顏色演變的快速、全面的分析方法。酚類化合物在紫外可見(UV-Vis)區域具有天然吸光度,包含了酚類化合物的大量信息。紫外可見分光光度法也因其可靠性、快速性、成本效益和簡單性成為酚類的常用定量方法。在葡萄酒研究中,這種光譜技術主要應用于花青素、黃酮類化合物和非黃酮類化合物的鑒定及其濃度的測量[7-8]。同時,這種多參數測量技術也非常適合在線檢測系統,這使得它適合于葡萄酒發酵和陳釀過程的控制和監測[9]。

紫外-可見光譜與化學計量學可聯合使用于葡萄和葡萄酒中酚類化合物以及多個參數的同時監測。文獻[10]測定了波爾多產區(n=34)多產地、多品種、年輕葡萄酒和陳釀葡萄酒的紫外可見光譜,數據顯示了紫外可見光譜對葡萄酒釀造過程中酚類物質的分析潛力。文獻[11]研究了使用紫外光譜法定量甲基纖維素可沉淀單寧(MCP)的精確多元線性回歸(MLR)和偏最小二乘(PLSR)回歸校正。文獻[12]的研究表明,紫外-可見光譜是監測釀酒過程中酚類成分的有效選擇。文獻[13]也通過UV-Vis光譜測定發酵過程樣品和成品酒中的單寧、花色苷、總酚和顏色的變化。文獻[14]基于紫外-可見光譜建立了不同的多元回歸方法(RR、PLSR、PCR 和 PRM)用于預測赤霞珠和西拉葡萄酒中單寧和花色苷的質量濃度,在理論研究的基礎上還進行了將預測模型商業化的嘗試。

本文探究赤霞珠釀酒葡萄發酵和陳釀過程中總酚、總單寧、總黃烷醇、總黃酮醇、總花色苷及顏色參數的變化規律,基于紫外可見吸收光譜結合PCA(主成分分析)和偏最小二乘法區分發酵進程并構建發酵過程中酚類化合物和顏色參數的預測模型,通過校正集和驗證集參數證明基于紫外可見光譜監測葡萄酒發酵和陳釀過程中酚類物質和顏色參數演變的可信性與可行性。通過紫外-可見光譜代替繁瑣復雜的化學法和精密儀器檢測法,實現葡萄酒生產過程中質量指標的快速監測,以期為葡萄酒產業紅葡萄酒發酵和陳釀過程的控制提供簡便經濟的方案。

1 材料與方法

1.1 葡萄原料

赤霞珠葡萄于2021年10月采摘自寧夏賀蘭山東麓葡萄酒產區。漿果的pH值為3.83,還原糖(葡萄糖)質量濃度為262.83 g/L,可滴定酸度(酒石酸)質量濃度為6.85 g/L。

1.2 試劑與儀器

沒食子酸、咖啡酸、(+)-兒茶素為國產分析純試劑,購于天津一方科技有限公司;二甲花翠素-3-O-葡萄糖苷標準品購于上海阿拉丁生化科技有限公司;釀酒酵母BV818購自湖北安琪酵母股份有限公司; 果膠酶購于上海源葉生物科技有限公司。

Cary 60 UV-Vis型紫外可見分光光度計,美國安捷倫公司。

1.3 發酵和陳釀過程中樣品采集

1.3.1發酵過程

釀酒葡萄經粒選、除梗、破碎后轉入5 L規格的玻璃發酵罐中(設置3個重復),入罐期間分3次添加60 mg/L的二氧化硫。然后,添加20 mg/L果膠酶,在4℃下浸漬48 h。通過添加200 mg/L活化后的安琪酵母BV818啟動酒精發酵。發酵溫度控制在(25±1)℃。通過測定溫度和比重監測發酵過程。當發酵自然終止后(殘糖質量濃度低于4 g/L),加入60 mg/L的SO2。酒精發酵期間,從3個發酵罐中每天取一次樣,每個罐采集17個樣品,共采集51個樣品。將采集的樣品經300目的尼龍布過濾后,于-80℃條件下冷凍保存。在光譜分析和化學分析前,樣品在室溫(20℃)條件下解凍,并使用離心機在4℃下以7 500 r/min離心15 min。

1.3.2陳釀過程

發酵結束后的葡萄酒分裝在250 mL規格棕色瓶中,于酒窖貯存(溫度:15～18℃;相對濕度:55%～65%),貯藏過程中每月取1次樣品,共采集了30個樣品。將采集的樣品于-80℃條件下冷凍保存。在光譜分析和化學分析前,樣品在室溫條件下解凍,并使用離心機在4℃下以7 500 r/min離心15 min。

1.4 紫外-可見吸收光譜采集

樣品經離心后,由1 mol/L HCl溶液稀釋10倍,在室溫黑暗條件下反應1 h,采用光程1 mm的石英比色皿,通過紫外-可見分光光度計掃描200～780 nm范圍內樣品的紫外-可見吸收光譜,掃描間隔為1 nm,1 mol/L HCl溶液作為參比溶液,每個樣品重復3次。

1.5 顏色參數測定

1.6 酚類成分測定

總酚、總黃酮醇、總花色苷質量濃度的測定:取0.5 mL酒樣,用10%的乙醇溶液稀釋10倍。吸取0.25 mL稀釋酒樣,加入0.25 mL的0.1% HCl-95%乙醇溶液,加入4.55 mL的2% HCl溶液,搖勻,室溫靜置15 min。采用10 mm光程、2 mm狹縫寬的比色皿,用紫外分光光度計測定280、360、520 nm下的吸光度,分別對應總酚(A280)、黃酮醇(A360)、總花色苷(A520)的吸光度,由標準曲線計算出質量濃度,濃度乘以稀釋倍數進行矯正[16]。

總黃烷醇質量濃度的測定:首先量取(+)-兒茶素母液配制標準溶液加定量的p-DMACA(對二甲氨基肉桂醛),然后用分光光度計滴定各溶液在640 nm波長處的吸光度,繪制總黃烷醇質量濃度的標準曲線。樣品中總黃烷醇的測定根據吸光度選取合適的稀釋倍數,經與標準溶液相同的處理后在640 nm波長下測定其吸光度,以去離子水調零[17]。重復測定3次,結果以兒茶素等價值表示(mg/L)。

總單寧質量濃度的測定:準確吸取0.5 mL甲醇稀釋后的酒樣(紅葡萄酒需稀釋10倍)于試管中,依次加入3 mL的4%的香草醛甲醇溶液和1.5 mL濃鹽酸,混勻,避光靜置40 min,于510 nm波長下測定吸光度,計算質量濃度[18],結果以兒茶素等價值表示,單位mg/L。

聚合花色苷相對質量濃度的測定:將20 μL 10%乙醛加入到2 mL葡萄酒樣品中,在室溫下保存45 min,然后用光程1 mm的玻璃比色皿在520 nm處測量吸光度Aacet。將160 μL 0.05 g/mL SO2加入到2 mL葡萄酒樣品中,室溫下反應10 min后用光程1 mm的玻璃比色皿測定520 nm處的吸光度ASO2[19]。

多聚體花色苷相對質量濃度按ASO2/Aacet×100%計算。

1.7 預測模型構建與驗證

2 結果與分析

2.1 發酵和陳釀過程中酚類物質演變

在紅葡萄酒的發酵過程中,酚類物質如黃烷醇、花色苷、黃酮醇、單寧等的變化對于葡萄酒的感官品質(如口感、顏色乃至香氣)都有著重要的影響。總酚在浸漬24 h后質量濃度增加為658.01 mg/L,啟動酒精發酵后,質量濃度迅速增加,釀造的第11天質量濃度增加為1 606.67 mg/L,而后增加速率減緩(圖1a)。總單寧在浸漬24 h后質量濃度為359.26 mg/L,啟動酒精發酵的第8天較浸漬結束質量濃度增加了1 896.02 mg/L,而后增加速率略有減緩(圖1b)。總黃烷醇在釀造的前7 d質量濃度穩步增加,第8天到第12天之間質量濃度急劇增加,5 d內質量濃度增加376.86 mg/L,而后增加速率明顯減緩(圖1c)。總黃酮醇在發酵5 d后質量濃度增加到96.43 mg/L,發酵12 d后質量濃度為136.86 mg/L,第13天開始質量濃度逐漸減小,發酵結束后質量濃度為121.86 mg/L(圖1d)。總花色苷在發酵的前 7 d質量濃度急劇增加,第7天時質量濃度為212.65 mg/L,而后的第8天到第10天增加速率明顯減緩,從第11天到發酵結束,質量濃度逐漸降低,發酵結束時質量濃度為179.73 mg/L(圖1e)。聚合花色苷相對質量濃度在發酵的前4 d變化很小,第5天開始占比逐漸增加,發酵結束時聚合花色苷相對質量濃度為34.65%(圖1f)。

圖1 葡萄酒發酵和陳釀過程中酚類物質的演變Fig.1 Evolution of phenolics during wine fermentation and aging

葡萄酒在貯藏過程中酚類化合物的演變是復雜的。年輕的赤霞珠紅葡萄酒在陳釀過程中酚類物質質量濃度逐漸減小,聚合花色苷相對質量濃度逐漸增加。貯藏3個月后,總酚質量濃度減小7.52%,而后,總酚質量濃度減少速率逐漸降低(圖1a)。單寧在陳釀2個月后,由2 798.33 mg/L減少為2 358.06 mg/L,而后降解速率變緩,呈穩定緩慢減少的趨勢(圖1b)。黃烷醇質量濃度在陳釀期間逐漸減少,黃烷醇由最初的716.08 mg/L降為552.63 mg/L。在黃烷醇貯藏的前5個月降解速率大于后5個月(圖1c)。黃酮醇在最初陳釀時的質量濃度為121.57 mg/L,陳釀10個月后,黃酮醇質量濃度降為88.86 mg/L,陳釀過程中,黃酮醇質量濃度穩步減少(圖1d)。陳釀過程中花色苷質量濃度逐漸減少,尤其是在貯藏的前7個月,從貯藏前的178.90 mg/L降低到102.45 mg/L,貯藏8個月后,花色苷質量濃度緩慢降低,直至貯藏10個月后,花色苷質量濃度僅為69.80 mg/L(圖1e)。通過SO2漂白法估算聚合花色苷對總花色苷的貢獻。新釀造的葡萄酒中聚合花色苷占總花色苷的34.65%,隨著葡萄酒的陳釀,聚合花色苷相對逐漸增加,貯藏10個月后,聚合花色苷占總花色苷的56.27%(圖1f)。

在葡萄酒發酵過程中總酚、總單寧、總黃烷醇、總黃酮醇和總花色苷在浸漬過程中質量濃度逐漸增加。酚類物質在低溫條件以及無酒精環境(水介質)下從漿果的固體部分轉移到葡萄汁中。尤其是總花色苷,在浸漬48 h后,由最初的64.69 mg/L增加到131.84 mg/L。聚合花色苷比例在浸漬過程中變化很小。從這個意義上講,為了改善葡萄酒的一些重要品質特征,如酚類物質,在受控條件下對破碎后的葡萄進行發酵前的冷浸漬是一種重要方法。在浸漬過程中,不同的因素,如浸漬時間、浸漬溫度等會強烈影響果皮和種子中酚類物質的提取進程[22]。接種酵母后,酚類化合物質量濃度急劇增加,酵母釋放的果膠酶增加葡萄中酚類物質的提取,并且由于酵母對酚類化合物的吸附作用加速了酚類化合物的提取[23],隨著酒精發酵的進行,乙醇、二氧化碳、二氧化硫以及溫度等都會影響酚類物質的浸提,通常較高溫度會增加酚類物質的提取率,因為升高溫度可以增加葡萄皮細胞的滲透性[24]。在酒精發酵后期直到發酵結束,隨著酒糟的再吸附以及發生的一系列氧化、降解、酒石酸鹽沉淀、酚類化合物間的聚合反應等,酚類物質提取速率逐漸變緩,甚至出現質量濃度逐漸減小的趨勢,尤其是總黃酮醇和總花色苷。葡萄酒是一個復雜的體系,在儲存期間經歷許多復雜的變化。這些復雜的變化對葡萄酒的質量和經濟價值具有非常重要的影響[25]。年輕的赤霞珠紅葡萄酒在陳釀過程中酚類物質質量濃度逐漸減小,聚合花色苷比例逐漸增加。總酚、總單寧、總黃酮醇和總黃烷質量濃度的降低主要歸因于陳釀過程中的氧化和聚合反應。其中,黃酮醇極易與花色苷發生聚合反應,對于穩定顏色具有積極作用。花色苷是葡萄酒呈紫紅色的主要原因,隨著葡萄酒的陳釀,花色苷逐漸聚合,形成聚合花色苷,使得花色苷質量濃度減少,顏色逐漸喪失,紅葡萄酒的紫紅色逐漸變為橙紅色[26]。在紅葡萄酒的儲存和陳釀過程中,葡萄中存在的游離花色苷和無色多酚(特別是單體和聚合物黃烷醇)之間逐漸形成聚合花色苷。這些化合物在有氧和無氧條件下形成,因此在瓶中儲存葡萄酒期間發生的聚合反應基本上是厭氧的,并且受溫度的影響比溶解氧濃度的影響更大[27]。

2.2 發酵和陳釀過程中顏色演變

圖2 發酵和陳釀過程中顏色的演變Fig.2 Evolution of color during fermentation and aging

2.3 發酵和陳釀過程中紫外-可見光譜分析

圖3展示了發酵和陳釀過程中樣品的紫外-可見吸收光譜特征。在浸漬和發酵初期,在520 nm附近觀察到顯著變化,吸收強度隨發酵進程顯著增加。由于花色苷在可見光譜的 490～550 nm區域表現出特征吸收帶,因此這一現象與葡萄皮中的游離花色苷浸提到葡萄酒中有關。在整個釀造過程中,280 nm附近的吸收強度隨發酵進程逐漸增強,說明酚類物質也在快速地浸提到葡萄酒中,280 nm處的吸光度被提議作為葡萄酒中酚類質量濃度的最佳預測指標,因為該波長處具有特征吸光峰。并且以520 nm和280 nm為中心出現輕微紅移現象。在酒精發酵即將結束時,發現花色苷的吸收帶在逐漸降低,這可能是由于聚合花色苷的形成、酵母細胞壁的再吸收以及形成酒石酸鹽沉淀等[32]。

圖3 發酵和陳釀過程中紫外-可見吸收光譜的演變Fig.3 Evolution of UV-Vis absorption spectra during fermentation and aging

隨著葡萄酒的陳釀,520～535 nm區域的吸光度逐漸降低,在400～420 nm處的黃色/棕色區域的吸光度沒有顯著變化。因此,陳釀過程中葡萄酒的420 nm和520 nm處的吸光度增加,這也是紅葡萄酒陳釀的主要特征之一。并且,紅葡萄酒在陳釀期間270～283 nm處的吸光度略有降低,280 nm附近處的吸光度通常與總酚質量濃度和呋喃化合物(如糠醛、乙酰呋喃、5-甲基糠醛)的存在有關,意味著陳釀過程中酚類化合物的聚合,導致總酚質量濃度在減少。這種聚合使得低分子量多酚物質濃度降低,同時聚合多酚濃度增加,進而影響葡萄酒顏色。對這些變化的分析,以及其他不太明顯的變化,是為了找到一個簡潔的模型來表征葡萄酒的發酵和陳釀過程,特別是預測葡萄酒發酵和陳釀過程中酚類物質和顏色的變化。

為了更進一步研究發酵和陳釀過程中的紫外-可見光譜特征,對200～780 nm范圍的光譜采用主成分分析(PCA),得到PC1、PC2和PC3貢獻率分別為51.9%、33.2% 和3.8%,前3個主成分的累計貢獻率達到88.9%。發酵樣品的PCA發現,隨著發酵進程樣品出現明顯的分布差異(圖4a),發酵的前7 d,樣品得分由第一象限逐漸向第二象限移動,且PC2的影響越來越小。這可能與浸漬和發酵初期酚類物質的浸提有關。發酵后10 d,樣品得分由PC1的負半軸逐漸向中心移動,PC1的影響越來越小,而PC1的影響逐漸明顯,尤其在發酵的第11天到第17天。這可能與酚類物質的提取基本完成,開始發生一系列復雜的生物化學反應有關。在陳釀過程中,樣品得分由第四象限向第一象限移動,主成分的貢獻率越來越大。圖4b顯示了前3個主成分的載荷,即每個波長對該區域方差的影響,PC1和PC2表明200～780 nm的整個紫外-可見光譜都在影響樣品光譜的方差,在建立PLSR校正模型時需要考慮這一因素。PC3顯示280 nm和520 nm附近區域對光譜方差有很大影響,可能與酚類物質和花色苷有很大關系。結果表明,基于紫外-可見光譜的PCA可用于對發酵和陳釀階段進行區分,對釀造過程中酚類物質質量濃度變化的定量預測需要進一步建立偏最小二乘回歸(PLSR)預測模型。

圖4 葡萄酒釀造過程中紫外-可見光譜的主成分分析Fig.4 Principal component analysis of UV-Vis spectra during winemaking

2.4 基于紫外-可見光譜構建酚類物質和顏色參數的PLSR預測模型

表1 酚類物質和顏色參數的最佳模型性能指標Tab.1 Best model performance indicators for phenolic substances and color parameters

3 結論

(1)浸漬階段和發酵初期是紅葡萄酒酚類物質浸提和顏色形成的關鍵時期。

(2)在發酵和陳釀過程中,酚類物質和顏色的演變與葡萄酒的紫外-可見光譜之間具有非常緊密的聯系。

(3)基于紫外-可見光譜的PCA可以很好地區分發酵和陳釀進程。

(4)基于干紅葡萄酒發酵和陳釀過程中的UV-Vis光譜特征構建酚類物質和CIELAB顏色參數的PLSR預測模型,發現PLSR預測模型可以成功地代替化學法和復雜儀器對發酵和陳釀過程中酚類物質和顏色的變化進行定量分析。特別適用于處理大批量樣品,實現實時檢測。這種方法可以幫助釀酒廠在葡萄酒發酵和陳釀過程快速、簡便、準確、經濟地監測總酚、總黃酮、總黃烷醇、總單寧、總花色苷、聚合花青素比例和CIELAB顏色參數的變化,進而更好地控制葡萄酒的質量。