廈門地區醫院感染大腸埃希菌及肺炎克雷伯菌產KPC的調查研究

王夙昕 邸玥瑩 鄒慧青 陳旭 張勇翔 張玲

廈門大學附屬成功醫院檢驗科，廈門 361003

2017年2月27日，世界衛生組織將碳青霉烯類藥物耐藥、產超廣譜β-內酰胺酶（ESBL）腸桿菌科列為最重要的“重點病原體”。CHINET 中國細菌耐藥性監測報告顯示［1］，歷年來監測的革蘭陰性桿菌大腸埃希菌和肺炎克雷伯菌的分離率分居第一和第二，且對常見抗生素的耐藥率逐年攀升，為臨床抗菌治療帶來一定的挑戰。碳青霉烯類抗生素主要針對革蘭陰性桿菌有極強的抗菌活性，是治療臨床感染最重要的一類抗生素［2］，是臨床治療革蘭陰性菌感染的“最后一道防線”，然而大量碳青霉烯類抗生素在臨床的使用誘導細菌對該類抗生素產生耐藥性［3］，產碳青霉烯酶是其中最重要的機制，肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶（KPC）型碳青霉烯酶是目前引起腸桿菌科細菌對其耐藥的主要原因［4］，幾乎水解全部β-內酰胺藥物［5-6］，且存在局部暴發流行的潛在威脅［7］。我們收集了廈門地區對碳青霉烯類抗生素耐藥的大腸埃希菌和肺炎克雷伯菌，對其產KPC 的情況進行調查研究，現將結果報道如下。

材料與方法

1.菌株來源

從廈門地區大型三甲醫院2020年11月至2021年11月分離到18 株耐碳青霉烯類抗生素肺炎克雷伯菌和大腸埃希菌，Hodge 試驗陽性。采用VITEK 2-COMPACT 細菌全自動鑒定儀進行鑒定及藥敏實驗。16株耐碳青霉烯類抗生素肺炎克雷伯菌和2 株耐碳青霉烯類抗生素大腸埃希菌，經過聚合酶鏈反應（PCR）及測序鑒定，美國國家生物技術信息中心（NCBI）數據庫比對，確定為產KPC-2 型碳青霉烯酶。標準菌株ATCC25922 購自梅里埃生物公司，廈門大學附屬中山醫院的產KPC 型肺炎克雷伯菌K-1 為陽性對照，全敏感的大腸埃希菌J53（301醫院惠贈）為陰性對照。

2.方法

2.1.改良Hodge 試驗 對VITEK 2-COMPACT 系統檢出的耐藥菌采取美國臨床和實驗室標準化協會（CLSI）推薦的改良Hodge 法進行表型確證。 將大腸埃希菌ATCC25922菌株調成0.5麥氏單位濁度的菌懸液，把菌液涂抹于MH 板上，將亞胺培南紙片貼于MH 平板表面，刮取待測菌株從平板中心紙片邊緣向平板邊緣劃線，35 ℃過夜培養［8-9］。如果待測菌株與大腸埃希菌ATCC25922 在抑菌環交匯處，大腸埃希菌生長增強，即表明待測菌株產碳青霉烯酶。

2.2.PCR基因擴增及測序

2.2.1.模板提取 培養菌液加熱裂解留取上清，用蒸餾水調整DNA 濃度為200～300 ng/μl，置于-20 ℃冰箱保存備用［10］。

2.2.2.PCR 擴增檢測 引物參照文獻［11-14］設計（耐藥基因引物由上海生工合成）。KPC F：ATG TCA CTG TAT CGC CGT CTA，R：TTA CTG CCC GTT GAC GCC CAA，目的片段886 bp；擴增體系為50 μl（大連寶生物Taq 酶擴增體系）；93 ℃ 5 min，93 ℃ 30 s，59 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，30 個循環，72 ℃ 7 min；陽性產物送往上海生工生物工程股份有限公司核苷酸序列分析，測序結果在NCBI序列數據庫進行檢索比對，確認表型。

2.3.脈沖場凝膠電泳技術（PFGE） 步驟參照《醫院中心實驗室操作指南》［15-16］，用XbaI 酶酶切，大腸埃希菌脈沖條件6.76～35.38 s，18 h，肺炎克雷伯菌操作步驟基本一致，脈沖條件為5.00～40.00 s，19 h，采集圖像后用Bionumeric軟件進行聚類分析，按照Tenover 等［17］建立的標準，將3 條以下（包括3 條）DNA 條帶差異的菌株，界定為同一個克隆不同亞種的細菌［18］。

實驗結果

分離菌株的耐藥情況見表1，耐碳青霉烯類抗生素菌株對常見的抗生素耐藥性較高，僅對多黏菌素存在敏感性。

表1 18株耐碳青霉烯類抗生素菌株對抗生素的耐藥情況

將收集的菌株進行KPC 特異基因PCR 擴增，2 株大腸埃希菌和16 株肺炎克雷伯菌均擴增陽性，陽性圖片見圖1；擴增產物進行基因測序，均為KPC-2基因型。

圖1 16株耐碳青霉烯類抗生素肺炎克雷伯菌和2株耐碳青霉烯類抗生素大腸埃希菌KPC基因擴增電泳圖

KPC 擴增陽性菌株進行脈沖場擴增后進行聚類分析，分析圖譜見圖2和圖3。

圖2 16株產KPC的肺炎克雷伯菌的聚類分析結果

圖3 2株產KPC的大腸埃希菌的聚類分析結果

討論

碳青霉烯類抗生素是一類抗菌活性極強的抗生素，可以用來治療腸桿菌科細菌引發的嚴重感染，但是一旦細菌誘發產生耐藥性，就會給臨床治療帶來嚴峻的考驗［19-20］。從表1 的結果可知，碳青霉烯類抗生素耐藥的細菌對常見的抗生素呈現較高的耐藥性，僅對多黏菌素敏感性較高，提示臨床在治療這類細菌引發的臨床感染時需要聯合使用多黏菌素類抗生素。在本研究中，對碳青霉烯類抗生素耐藥且Hodge 試驗陽性的16 株肺炎克雷伯菌和2 株大腸埃希菌攜帶KPC 耐藥基因，通過KPC 特定引物擴增測序可知，18 株菌株均產KPC-2，耐藥表型基本一致。KPC-2 也是在亞洲特別是中國地區腸桿菌科細菌中出現最多的KPC編碼基因型別［21］，廈門地區對碳青霉烯類耐藥的大腸埃希菌和肺炎克雷伯菌主要分離產KPC-2 型碳青霉烯酶，呈現較高的耐藥性，在治療這類細菌引發的感染時可以聯合使用多黏菌素。

PFGE 從整體上反映不同菌株全部基因之間的相關性［22］，同時具有區分能力強、可重復性好、結果穩定的特點，便于標準化操作，被廣泛運用于流行病學的分析中。本次實驗在實驗室已有的基礎上采用XbaI酶作為大腸埃希菌和肺炎克雷伯菌染色體DNA 的限制性內切核酸酶，其所產生的電泳條帶比較清晰，可以進行細菌的聚類分析。從聚類分析圖中可以發現，產KPC 的肺炎克雷伯菌的基因型并不相同，2 株產KPC 的大腸埃希菌的基因型也不相同。不同科室來源為同一基因型菌株，多數分離自神經醫學中心重癥監護病房，不同科室間不排除存在同一型菌株的不同亞型，多基因型并存，說明KPC基因可存在同一種細菌的不同基因型。暴發流行從目前的數據來看是不存在的，只是在醫院內散發存在。醫院的相關部門需要采取相應的措施對菌株的分離科室進行院感檢查，密切院感監測，調查來源并采取措施防止這類細菌的播散［23］。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突

作者貢獻聲明王夙昕：直接參與，參與論文選題和設計，實施試驗，采集分析數據，文章撰寫，對文章的知識性內容做批評性審閱，工作支持，統計分析，按編輯部的修改意見進行核修；邸玥瑩：直接參與，參與論文選題和設計，實施試驗，采集分析數據，工作支持，統計分析；鄒慧青：直接參與，參與論文選題和設計，實施試驗，采集分析數據，工作支持，統計分析；陳旭：直接參與，參與論文選題和設計，實施試驗，采集分析數據，工作支持，統計分析；張勇翔：直接參與，參與論文選題和設計，實施試驗，采集分析數據，文章撰寫，工作支持，統計分析；張玲：直接參與，參與論文選題和設計，實施試驗，采集分析數據，對文章的知識性內容做批評性審閱，工作支持，統計分析，獲取經費，行政、技術及材料支持，對學術問題進行解答