太平洋亞歷山大藻對凡納濱對蝦的急性毒性效應

楊惠婕，張玉蕾，劉碧洪，李長玲，黃翔鵠

（廣東海洋大學水產學院，廣東 湛江 524088）

赤潮生物包括原生動物，細菌及如甲藻、硅藻等藻類。其中有毒、有害赤潮藻類以甲藻居多，其次為硅藻、藍藻、金藻和隱藻等[1]。藻華有害的原因是有毒微藻的大量增殖，產生的藻毒素可能會污染水環境或魚、蝦、貝類等的食物，導致其窒息死亡，食用此類水產品也可能造成人類患病[2-5]。甲藻作為典型的赤潮生物種，能夠產生甲藻毒素。例如，短裸甲藻（Gymnodinium breνe）分泌的毒素為神經性貝毒；利馬原甲藻（Prorocentrum lima）可產生腹瀉性貝毒。太平洋亞歷山大藻（Alexandrium pacificum）是塔瑪亞歷山大藻（Alexandrium tamarense）復合體中的一種[6]，其毒素類型為麻痹性貝毒（PSP），毒素譜主要成分為N-磺基氨基甲酰基衍生物(C1/C2，B1)、膝溝藻毒素（GTX1/GTX4）和新石房蛤毒素（NEO）[7-8]。亞歷山大藻一旦暴發，其產生的PSP 可經過食物鏈在魚、蝦、貝類等生物體內蓄積，會造成嚴重的水環境問題，對水產養殖業造成經濟損失[9-11]。更甚者，從甲藻中提取的PSP 毒素可導致凡納濱對蝦的死亡[12]。研究表明，水生生物暴露于PSP 后，主要的應激反應包括產生大量活性氧（ROS），誘導抗氧化應激（包括酶促和非酶促防御）反應[13]、細胞內氧化還原穩態失衡[14]和導致細胞損傷（即脂質過氧化）[15]。

作為評估環境脅迫對生物體產生氧化脅迫的一類生物標志物，抗氧化系統通過監測脂質過氧化水平和抗氧化酶活力的改變，從而評估污染物的毒性效應[16-17]。研究表明，亞歷山大藻會影響魚、蝦、貝類的生長及免疫功能[10,18-20]。但太平洋亞歷山大藻對凡納濱對蝦（Litopenaeus νannamei）的整體抗氧化酶系的影響還未見報道。因此，本研究將凡納濱對蝦急性暴露在高濃度的太平洋亞歷山大藻破碎液中72 h，從對蝦重要的解毒器官和代謝中心——肝胰腺入手，檢測其丙二醛（MDA）、谷胱甘肽（GSH）含量以及超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽—S 轉移酶（GST）、堿性磷酸酶（AKP）、多酚氧化酶（PPO）多種抗氧化酶活力的變化；同時觀察對蝦重要器官組織的病理損傷情況。通過抗氧化水平和病理兩方面的結果，分析太平洋亞歷山大藻對凡納濱對蝦的毒性效應，以期為研究赤潮有毒藻對水產動物的毒性作用機制提供思路，為甲殼類動物在太平洋亞歷山大藻脅迫下存在的解毒機制提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料

太平洋亞歷山大藻的基本培養條件：溫度22 ℃，鹽 度25，光 照50 μmol·m-2·s-1，光暗比14 h∶10 h，采用f/2培養基培養置于光照培養箱中培養，每天定時搖瓶3次。

凡納濱對蝦由廣東省湛江市東海島試驗基地提供，體長（5.3 ± 0.3）cm，體質量（2.5 ± 0.5）g，對蝦在實驗室暫養一周，養在消毒處理的海水中。待處于穩定狀態后，選取健康、活潑、生長狀況相似的對蝦進行實驗。

養殖海水采自廣東省湛江市東海島，鹽度調至25后消毒處理。

1.2 太平洋亞歷山大藻破碎液制備

將太平洋亞歷山大藻藻液在4 ℃、4 000 r/min條件下離心2 min，分別收集上清以及藻細胞，濃縮藻細胞到5.0×105/mL。濃縮后混入0.5 mm 氧化鋯珠，用組織破碎儀進行破碎，破碎條件為70 Hz、2 min。

1.3 太平洋亞歷山大藻暴露實驗

1.4 酶活測定

在0、3、6、9、12、24、48、72 h 分別從對照組和實驗組的每個平行中各隨機選取6 尾蝦，取其肝胰腺液氮速凍，-80 ℃保存備用。

肝胰臟解凍后準確稱取組織重量，按質量（g）∶體積（mL）=1∶10比例加入預冷生理鹽水，高速研磨儀處理，然后以2 500 r/min離心10 min，取上清液用于酶活力測定?？偟鞍滓耘Ｑ灏椎鞍譈SA 為標準，Bradfords 法測定。SOD、GST、AKP、PPO 活力和MDA、GSH 含量采用南京建成生物工程研究所的試劑盒，按照各說明書進行測定。每項酶促測定均進行3個重復。

1.5 病理切片觀察

在暴露72 h 后分別從對照組和實驗組的每個平行中各隨機選取2尾蝦，取其腸道、肝胰腺、鰓、神經和肌肉，置于Bouins固定液，4 ℃保存。石蠟包埋切片，HE 染色，Olympus顯微鏡拍照，觀察其組織病理變化。

1.6 數據處理統計

所有實驗均重復3 次。使用GraphPad Prism 軟件繪制存活率曲線圖。對于不符合正態分布的存活率結果，對數據進行平方根反正弦轉換處理。所有數據采用“平均值±標準誤（X±SD）”表示，酶活以及存活率數據均采用SPSS 20.0 軟件進行單因素方差（One-way ANOⅤA）分析和Duncan 多重比較檢驗處理，有統計學意義的顯著性差異用星號表示（*P＜0.05，**P＜0.01）。

2 結果

2.1 太平洋亞歷山大藻對凡納濱對蝦存活的影響

如圖1 所示，太平洋亞歷山大藻對凡納濱對蝦的存活率具有顯著影響（P＜0.01）；在實驗進行9 h后，實驗組的對蝦出現死亡，且存活率隨暴露時間的增加而降低。

圖1 太平洋亞歷山大藻破碎液對凡納濱對蝦存活的影響Fig.1 Effect of Alexandrium pacificum on the survival of Litopenaeus νannamei

2.2 太平洋亞歷山大藻脅迫下凡納濱對蝦的抗氧化酶的變化

在實驗處理3 h 時，SOD 活力極顯著低于對照組（P＜0.01）；在處理6 h 時，實驗組對蝦的SOD 活力顯著高于對照組（P＜0.01）；在9 h 時，實驗組SOD 活力極顯著低于對照組（P＜0.01）；在48 h 時，實驗組SOD 活力與對照組相比顯著升高（P＜0.05）；在72 h 時，實驗組的SOD 活力顯著低于對照組（P＜0.01）（圖2(A)）。

由此可見，努力提高失地農民再就業培訓的“參與比率”，對于建構長效再就業培訓系統、緩解失地農民結構性失業問題、落實“就業是最大民生”的治國理念而言，都具有重要的實踐意義。

圖2 太平洋亞歷山大藻破碎液處理對凡納濱對蝦肝胰腺抗氧化水平的影響Fig.2 Effects of solution of crushed Alexandrium pacificum on antioxidant levels in hepatopancreas of Litopenaeus νannamei

太平洋亞歷山大藻對凡納濱對蝦MDA 質量摩爾濃度的影響如圖2(B)。在實驗處理3 h 時，MDA質量摩爾濃度極顯著低于對照組（P＜0.01）；在連續處理6 h 時，實驗組對蝦的MDA 質量摩爾濃度顯著高于對照組（P＜0.01）；在9、12、24和48 h時，實驗組MDA質量摩爾濃度均極顯著低于對照組（P＜0.01）。

太平洋亞歷山大藻對凡納濱對蝦GST 活力的影響如圖2(C)。在實驗處理3、6 h 時，GST 活力極顯著高于對照組（P＜0.01）；在9、12、24 和72 h 時，GST 活力極顯著低于對照組（P＜0.01）；在48 h 時，實驗組的GST活力顯著低于對照組（P＜0.05）。

太平洋亞歷山大藻對凡納濱對蝦GSH 質量摩爾濃度的影響如圖2(D)。在實驗處理6 h 時，GSH質量摩爾濃度極顯著高于對照組（P＜0.01）；在連續處理12 h 時，GSH 質量摩爾濃度極顯著低于對照組（P＜0.01）；在48 h 時，GSH 質量摩爾濃度與對照組相比顯著下降（P＜0.05）；72 h 時，實驗組的GSH 質量摩爾濃度極顯著低于對照組（P＜0.01）。

太平洋亞歷山大藻對凡納濱對蝦AKP 活力的影響如圖2(E)。在實驗處理3 h 時，AKP 活力顯著低于對照組（P＜0.05）；6 h 時，實驗組AKP 活力極顯著高于對照組（P＜0.01）；在9、12、48 和72 h 時，實驗組AKP的活力均顯著低于對照組（P＜0.05）。

太平洋亞歷山大藻對凡納濱對蝦PPO 活力的影響如圖2(F)。PPO 活力在實驗處理9 h 時開始被誘導。在9 h 時，實驗組極顯著低于對照組（P＜0.01）；在48 h 時，實驗組的PPO 活力與對照組相比顯著升高（P＜0.05）。

2.3 太平洋亞歷山大藻脅迫下凡納濱對蝦的組織病理變化

對照組對蝦的腸上皮細胞緊密連接，排列整齊、致密，外層結締組織厚，可見血竇分布（圖3(A)）；暴露在太平洋亞歷山大藻破碎液中72 h后，對蝦腸上皮細胞間黏附力下降，細胞空泡化或自溶，組織細胞間隙變大、解體（圖3(B)）。

圖3 太平洋亞歷山大藻暴露72 h后凡納濱對蝦組織結構的變化Fig.3 Changes in tissue structure of Litopenaeus νannamei after 72 h exposure to Alexandrium pacificum

對照組對蝦的鰓絲排列整齊，結構清晰，細胞和核明顯（圖3(C)）；暴露在太平洋亞歷山大藻破碎液中72 h 后，對蝦的鰓絲排列紊亂，有的區域出現黏連，核固縮，變小或消失（圖3(D)）。

對蝦的肝胰腺為復管狀腺，由多級分支的小管組成；肝小管外壁由單層柱狀上皮細胞構成，其上皮細胞按功能分為吸收細胞和分泌細胞。各肝胰腺小管之間有結締組織與脂肪組織包裹與分隔，管腔呈五角或四角星形。對照組對蝦的肝胰腺小管結構完整，基底膜完整，邊界清晰，管腔呈星形（圖3(E)）；暴露在太平洋亞歷山大藻破碎液中72 h后，對蝦肝小管管腔擴大，形狀不規則，吸收細胞和分泌細胞出現空泡化（圖3(F)）。

對照組對蝦肌肉組織及肌纖維紋路清晰、排列致密（圖3(G)）；暴露在太平洋亞歷山大藻破碎液中72 h 后，對蝦肌束萎縮，相鄰肌束間距較大，肌纖維排列雜亂（圖3(H)）。

對照組腹神經由多個節間神經纖維束連成的神經節構成，兩側融合，纖維束分成兩束，縱向把各個神經節聯系起來，髓質明顯(圖3(I))；暴露在太平洋亞歷山大藻破碎液中72 h 后，對蝦神經束間隙變大，神經節分布散亂（圖3(J)）。

3 討論

太平洋亞歷山大藻是一種喜高光微藻，實驗室培養的照度一般為50 μmol·m-2·s-1[21]，在溫度為17～25 ℃[22]、鹽度為23～27 條件下生長最佳[23]；當溫度低于10 ℃或者高于30 ℃，藻細胞則會停止生長甚至短時間內死亡[22]。根據本實驗室前期培養情況，溫度22 ℃，鹽度25，照度50 μmol·m-2·s-1，光暗比為14 h∶10 h 時藻生長最佳。太平洋亞歷山大藻及其產生的毒素，如麻痹性貝毒、溶血素等，可對水生動物產生急性毒性作用，導致水生動物行為改變、生殖中斷、生長遲緩和酶活力降低，甚至直接造成海洋生物死亡[24]。研究發現，亞歷山大藻對黑褐新糠蝦（Neomysis awatschensis）有致死作用[25]，其去藻過濾液也能顯著提高糠蝦的死亡率；亞歷山大藻對凡納濱對蝦蚤狀幼體的96 h 致死半濃度LC50為7 500 mL-1[26]；斑節對蝦（Penaeus monodon）暴露于10 000 mL-1亞歷山大藻中，12 h 后出現蝦死亡現象[27]，并且在死亡對蝦的鰓和胃里發現亞歷山大藻細胞。結合前期預實驗，選擇1.0×104mL-1作為急性研究濃度。

在甲殼類動物中，肝胰腺是重要的解毒器官，也是清除多余ROS 的重要代謝中心，在免疫系統中發揮著關鍵作用[28-29]。凡納濱對蝦體內ROS的產生和代謝之間存在動態平衡。受到太平洋亞歷山大藻毒素PSP 氧化脅迫時，對蝦體內ROS 和抗氧化防御系統之間的平衡被打破[30]，表現為氧化應激，可誘導抗氧化酶活力的改變。抗氧化酶通過滅活ROS和修復氧化生物分子來保護生物體免受氧化損傷[31]。因此，抗氧化酶活力的變化能夠反映機體氧化損傷的水平[32-33]。

丙二醛（MDA）作為機體脂質過氧化作用的終產物，其含量變化水平能直接反映出PSP引起的組織細胞膜損傷情況[18]。研究表明，微囊藻（Microcystis）可導致羅非魚（Oreochromis mossambicus）組織脂質過氧化[34]；有毒裸甲藻可誘導扇貝過氧化脂質增加[14]。本研究中，6 h 時，對蝦肝胰腺組織MDA 含量顯著高于對照組，表明太平洋亞歷山大藻誘導了凡納濱對蝦的肝胰腺脂質過氧化，這也是造成對蝦組織細胞的膜溶解、破裂的重要原因。超氧陰離子（O2-）是ROS 主要的自由基，過氧化物歧化酶（SOD）的作用是把O2-歧化成H2O2和O2，免除多余的高活性氧化物質對機體的迫害[35]。本研究中，6 h 時，對蝦肝胰腺組織SOD 活力較于對照組顯著增高，表明對蝦發生脂質過氧化后，SOD 能積極發揮作用清除生物體內過量的O2-；有研究表明，在大量O2-被SOD 歧化過程中，生成的H2O2會抑制SOD 活力[36]。本研究中，9 h 時，實驗組中SOD 活力以及MDA 含量顯著低于對照組，表明對蝦受到氧化脅迫后，SOD 被迅速誘導，一定程度上抑制了脂質過氧化作用；同時，清除活性氧所產生的H2O2也使SOD活力降低。

谷胱甘肽S-轉移酶（GST）不僅能抑制脂質過氧化，清除體內氧自由基，還有解毒功能。GST 催化谷胱甘肽（GSH）與多種內源性和外源性親電化合物的偶聯，減少親電分子與細胞內生物大分子（如DNA）等結合形成脂類過氧化物，從而抑制脂質過氧化作用[37-39]。GST還可催化GSH與毒性化合物的活力產物共軛結合，從而達到解毒作用。本研究中，6 h 時，實驗組對蝦的GST 活力顯著高于對照組。GST 活力被誘導是機體對氧化脅迫的適應性反應[40-42]，表明凡納濱對蝦受到太平洋亞歷山大藻毒素脅迫后，一方面為清除大量產生的氧自由基，對蝦肝胰腺增強GST 活力來抵抗傷害，抑制脂質過氧化；另一方面，GST 被激活參與了太平洋亞歷山大藻所產有毒物質的代謝及解毒過程[24,43]。GST 活力變化與GSH結果相呼應，GSH可作為反應底物通過GST 催化清除自由基和過氧化物，具有抗氧化作用和整合解毒作用，在免疫系統中發揮著關鍵作用[44-45]。此外，GSH 還會在甲殼動物代謝過程中誘導毒素轉化[46-47]。江天久等[48]研究發現，中國龍蝦（Panulirus stimpsoni）受PSP 脅迫后，GSH 誘導毒素由GTX2,3 轉換成了GTX1,4。本研究中，實驗組對蝦肝胰腺組織GSH含量在6 h時顯著高于對照組，表明對蝦在太平洋亞歷山大藻的脅迫下，機體產生了過量的氧自由基，誘導了GSH 的生成以加速消除多余的氧自由基，對抗氧自由基對肝胰腺的損害。這與梁忠秀等[49]將中國對蝦（Fenneropenaeus chinensis）暴露于亞歷山大藻中測得結果一致。

堿性磷酸酶（AKP）能有效地清除入侵甲殼動物的污染物和毒素[50]。AKP 作為溶酶體酶的重要組成部分，參與一系列的生理代謝活動，如膜的分子滲透、細胞生長和分化，以及一些磷素和其他營養物質的消化、吸收和運輸等。本研究中，6 h時，實驗組AKP活力顯著高于對照組，表明在氧化應激狀態下，溶酶體膜的通透性增強，溶酶體酶進入胞漿后AKP被激活。

在72 h，SOD、GST、AKP 活力以及GSH 含量均顯著低于對照組，表明對蝦暴露在高濃度的太平洋亞歷山大藻后受到了嚴重的氧化脅迫，高強度脅迫導致對蝦應激系統紊亂，溶酶體失去穩定，這可能是一種潛在的細胞凋亡的早期信號，說明隨后產生積累的氧自由基會促使細胞發生凋亡[51]。此外，GST活力被抑制，可影響機體的解毒功能[24]，增強對蝦對需經GST代謝的外源性毒物的敏感性[52]。

多酚氧化酶（PPO）是一種雙功能的含銅酶[53]，是酚氧化酶原激活系統識別異物和免疫反應的起點，其活力高低影響著對蝦免疫系統對進入體內的異物反應速度和強度，以及激活后續反應如凝集、吞噬、黑化等作用的效率。在甲殼動物中，PPO 以酚氧化物酶原的形式存在，能夠被一些蛋白質或多糖激活而轉變成活力的多酚氧化物酶。在9 h 時，實驗組肝胰腺的PPO 活力顯著低于對照組。分析其原因，一方面可能是由于對蝦在受到氧化脅迫時，誘導了GSH 等抗氧化酶的活力，肝胰腺內蛋白質、多糖等生物大分子與GSH 發生共軛反應，酚氧化酶原無法被激活；另一方面可能是在氧自由基的催化下，PPO 被活化，迅速黏附異物進行識別，誘導有關底物由酚轉化到醌，最終產生黑色素，抑制病原體胞外蛋白酶和幾丁質酶的活力。48 h 時，實驗組肝胰腺的PPO 活力顯著高于對照組，表明對蝦防御體外物質入侵的過程大量PPO 被活化，以抑制氧自由基的脅迫。由此可見，在太平洋亞歷山大藻的脅迫下，凡納濱對蝦肝胰腺的SOD、GSH、GST、AKP 和PPO 均會被誘導發揮作用，清除過量的活性氧，抑制脂質過氧化，抵御外來毒性。

太平洋亞歷山大藻所產的PSP 毒素，是特異性鈉離子通道阻斷劑，可導致膜內外的滲透壓不平衡，從而使膜部分溶解。PSP毒素進入生物體后，機體產生的大量活性氧自由基會導致細胞膜脂質過氧化[49,54]，生成的脂質過氧化物（如MDA）等與膜上蛋白質反應會增加膜的通透性,引起膜結構溶解。此外，GSH 還會誘導PSP 毒素發生毒素成分的轉化[55-56]，這種轉化會產生大量的活性氧自由基[49]，導致細胞膜脂質過氧化[54]，造成細胞膜溶解。此外，膜結構的破損會加速PSP 的侵入，使更多的藻毒素進入細胞內。本研究中，將凡納濱對蝦暴露于太平洋亞歷山大藻后，其腸道、鰓和肝胰腺的上皮細胞均出現空泡化，細胞出現了黏連，膜出現了溶解，這正是細胞膜脂質過氧化的結果。梁忠秀等[57]將中國對蝦暴露于亞歷山大藻中，發現對蝦肝胰腺中的吸收細胞和分泌細胞均出現了空泡化，與本實驗結果一致。其中，對蝦鰓組織腫脹、鰓絲部分黏連，這和鰓直接與藻接觸或是直接接觸了太平洋亞歷山大藻分泌的其他藻毒素有關[58]。亞歷山大藻對鰓的機械損傷已在魚類的研究中得到證實[10,19]。鰓是蝦類的呼吸器官，是太平洋亞歷山大藻最初作用的器官，鰓的病變會直接導致對蝦窒息死亡。神經作為靶器官之一，PSP會損傷蝦的神經節，導致神經節髓質分裂以及細胞溶解，從而導致麻痹、痙攣等異常行為或死亡[10]。神經系統麻痹后，對蝦肌束萎縮，肌纖維排列雜亂。這也是造成對蝦神經束間隙變大，神經節分布散亂，神經細胞溶解的原因。因此，高濃度的PSP毒素暴露會造成對蝦重要組織及器官的損傷。其中，鰓的病變以及神經系統的受損均會導致對蝦死亡。此外，由于對蝦的抗氧化和解毒代謝能力有限，機體抗氧化酶系在高濃度的PSP 毒素暴露下會嚴重受損，導致對蝦死亡。這些都是太平洋亞歷山大藻對凡納濱對蝦的急性毒性影響，將有助于解釋其對對蝦的致毒機制。

4 結論

太平洋亞歷山大藻毒素會降低凡納濱對蝦的存活率；對凡納濱對蝦肝胰腺具有脂質過氧化作用，會誘導MDA 含量增加，導致對蝦氧化應激和組織損傷。凡納濱對蝦在太平洋亞歷山大藻暴露下，SOD、GSH、GST、AKP 和PPO 均被激活以清除過量的活性氧，抑制脂質過氧化，抵御外來毒性。在嚴重的氧化脅迫下，凡納濱對蝦的腸道、肝胰腺、鰓、肌肉和神經組織嚴重受損，對蝦氧化-抗氧化系統的平衡遭到破壞，對蝦的免疫功能遭到損傷，多種免疫酶活力均被抑制。