氨氮對牛糞厭氧消化中四環素類抗性基因豐度及其驅動因子的影響

王秀君，朱文博，朱天嬌，張秋萍，龐小可，許繼飛*

（1.內蒙古大學生態與環境學院，呼和浩特 010021；2.內蒙古自治區環境污染控制與廢物資源化重點實驗室，呼和浩特 010021；3.山西師范大學生命科學學院，太原 030031；4.南開大學環境科學與工程學院，天津 300350）

畜禽糞便作為抗生素抗性基因（Antibiotic resis?tance genes，ARGs）的儲存池已成為當下的研究熱點[1]。四 環 素類ARGs（Tetracycline resistance genes，TRGs）在畜禽糞便中頻頻檢出，為糞源ARGs 的主要門類[2-3]。同時，畜禽糞便也是一種應用價值高且常見的農業有機肥料[4]。由此，糞源ARGs 可能會隨著畜禽糞便應用和養殖廢水排放進入土壤、水體等自然環境，并經食物鏈傳遞等途徑進入植物、動物體中，進而對生態環境和人體健康造成潛在威脅。

厭氧消化是糞便資源化的常用方式之一，可對糞源ARGs 在環境中的傳播和擴散起控制作用[5]。作為消化基質，畜禽糞便的理化性質將影響厭氧消化對糞源ARGs 的作用效果，其中，氨氮可為ARGs 宿主微生物提供氮源，也可作為厭氧消化系統的緩沖劑，增強消化系統穩定性，然而，氨氮濃度高會抑制微生物的生命活動，進而導致消化失敗[6]。朱文博等[7]的研究表明氨氮濃度對厭氧消化中糞源ARGs 的相對豐度變化有顯著影響。Zhang 等[8]的研究發現豬糞中的ARGs經中溫厭氧消化后的總相對豐度隨糞便中氨氮濃度的升高而升高，且ARGs 發生水平基因轉移的概率也隨之增加。對于養殖場中的畜禽糞便，其氨氮濃度可能會隨著養殖單元、養殖規模和清糞方式的不同而有差異。美英等[9]研究發現從產奶牛舍和待產牛舍收集的糞便中氨氮濃度高于其他養殖單元，且大規模養殖場的氨氮濃度高于中小規模養殖場。此外，高溫會促進畜禽糞便中氨氮的釋放，夏季奶牛糞便中氨氮濃度高于冬季。于厭氧消化而言，高溫厭氧消化較中溫厭氧消化更有利于減少ARGs 的豐度[10-11]，然而，畜禽糞便中氨氮濃度對高溫厭氧消化中糞源ARGs豐度變化及其驅動因子的影響尚有待闡明。

本研究以TRGs為目的基因，以牛糞為消化基質，并外源添加尿素以形成牛糞氨氮濃度梯度；在確保高溫厭氧消化可運行的情況下，探究氨氮濃度對牛糞高溫厭氧消化系統中TRGs豐度變化的影響，分析TRGs、可移動遺傳元件（Mobile genetic elements，MGEs）和微生物群落結構的相關性以揭示TRGs豐度變化的驅動因子，以期進一步加深對畜禽糞便理化性質與厭氧消化工藝削減ARGs效果相互作用關系的理解。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與設計

本試驗利用無菌聚乙烯塑料瓶于內蒙古呼和浩特某規模化奶牛養殖場采集新鮮牛糞（記為U0），4 ℃保存運回實驗室。牛糞理化性質于48 h內測定，其余樣品于-80 ℃保存。新鮮牛糞初始理化性質：可溶性COD（SCOD）濃度為7 575.00 mg·L-1；氨氮濃度為595.30 mg·L-1；pH 為6.08；總揮發酸（TVFAs）濃度為3 092.47 mg·L-1。為避免引入其他化學元素，采用尿素（CH4N2O）為外源添加物調節牛糞中氨氮濃度，并以牛糞和尿素的混合物作為厭氧消化基質。一般認為，當厭氧消化中的氨氮濃度超過1 500 mg·L-1時會對厭氧消化產生不利影響[12]，基于此，本試驗消化基質中氨氮濃度最終設定為600、1 100 mg·L-1和1 600 mg·L-1，記為U1、U2 和U3。選用500 mL 厭氧培養瓶為厭氧消化反應器。培養瓶內添加400 mL 新鮮牛糞和尿素混合物后通氮氣5~8 min。發酵濃度為8%。以未檢出ARGs 的厭氧微生物菌劑（廣州微生源，中國）為接種物，接種率為0.1%（m/m）。利用水浴法保證反應溫度為（55±1）℃，每組處理設置3個重復。

1.2 樣品采集與理化性質測定

采用排水法收集氣體，并每日記錄日產氣量。當日產氣量小于5%反應體積（25 mL·d-1）時，視作厭氧消化反應終點。在反應前、反應第6 天、第16 天、第28 天和第45 天（反應結束）時采集樣品。將1 mL 樣品收集于離心管內，12 000 r·min-1離心5 min，上清液用于理化性質測定，沉淀物于-80 ℃保存，用于TRGs、MGEs 和16S rRNA 的定量分析以及微生物群落分析。

沼氣成分采用沼氣分析儀（MRU Optima7，德國）分析測定；SCOD 采用重鉻酸鉀法測定；氨氮采用納氏試劑光度法測定；pH 值采用pH 計（PHS-3E，上海雷磁）測定；TVFAs采用酸性氯化鐵比色法測定；堿度采用滴定法測定。

1.3 ARGs與MGEs定量分析

基因組DNA 的提取：采用糞便基因組DNA 提取試劑盒（天根DP-328，北京）提取每毫升樣品沉淀物中的DNA，詳細步驟參見試劑盒說明書。所提取的DNA 用超微量紫外分光光度計（Nanodrop-2000，美國）檢測其含量和純度（A260/280為1.7~2.0）。

實時熒光定量PCR（qPCR）：通過普通PCR 儀（ABI 9902，美國）檢測樣品中的TRGs 和MGEs，目的基因為編碼外排泵基因（tetA、tetC、tetG），編碼核糖體保護蛋白基因（tetO、tetQ、tetT），轉座酶修飾基因（tetX）以及MGEs（intI1，intI2和Tn916/1545）。采用熒光定量系統（Bio-Rad CFX96，美國）對上述目的基因進行定量分析，qPCR 所用引物序列、退火溫度和反應程序等詳見文獻[10，13]。

1.4 高通量測序與微生物群落結構分析

委托上海派森諾生物公司利用Illumina Novaseq平臺進行16S rRNA 高通量測序。測序區域為V3~V4區，引 物 為338F（ACTCCTACGGCAGGCAGCA）和806R（GGACTACHVGGGTWTCTAAT）。基于測序獲得的原始序列經Qiime 2 平臺中的dada 2 軟件質控去噪獲得擴增子序列變異（Amplicon sequence variants，ASVs），將代表序列ASV 與SILVA 16S rRNA 數據庫進行比對，使用Na?ve Bayes 分類器對物種進行注釋，獲得每個分類水平下的物種豐度信息。

1.5 數據分析

采用Microsoft Excel 軟件整理原始試驗數據；利用SPSS 22.0 進行單因素方差分析及Pearson 相關性分析；采用Origin Pro 9.0 繪制柱狀圖和折線圖；采用R3.5.3繪制熱圖。

2 結果與討論

2.1 氨氮濃度對牛糞厭氧消化性能的影響

圖1 為不同氨氮濃度下牛糞高溫厭氧消化產氣速率和氨氮累積情況。當氨氮濃度為600 mg·L-1和1 100 mg·L-1時，厭氧消化分別在第4天和第5天達到產氣峰值，最大產氣速率分別為933 mL·d-1和800 mL·d-1，總產氣量分別為8 036 mL 和7 696 mL。雖然氨氮濃度為1 100 mg·L-1的厭氧消化較600 mg·L-1的厭氧消化在產氣性能方面略有降低，但未表現出顯著差異（P>0.05）。然而，當氨氮濃度升高至1 600 mg·L-1時，厭氧消化的產氣峰值推遲至第12天，其最大產氣速率（280 mL·d-1）與其余兩試驗組相比分別下降了70%和65%，且其總氣量（4 773 mL）較另兩組厭氧消化也分別下降了40%和38%，這可能是因為牛糞中較高的氨氮濃度及其后續累積對系統中的產甲烷菌活性造成了不良影響，進而影響了厭氧消化性能[14]。各試驗組的產氣速率均在第30 天趨于穩定，并于第44 天結束。消化結束時，600、1 100 mg·L-1和1 600 mg·L-1處理的氨氮濃度分別累積至790、1 428 mg·L-1和2 201 mg·L-1（圖1b）。

圖1 牛糞高溫厭氧消化過程中日產氣速率和氨氮累積情況Figure 1 Biogas production rate and the concentration of ammonia during thermophilic anaerobic digestion based on diary manure

2.2 氨氮濃度對TRGs絕對豐度的影響

圖2 為TRGs 的絕對豐度在厭氧消化中的變化。如圖2a 所示，7 種目的基因均在牛糞中檢測出，包括tetA、tetC、tetG、tetO、tetQ、tetT 和tetX，總絕對豐度為5.02×109copies·mL-1。tetQ的絕對豐度在7種目的基因中占比最大，為53%。這可能與多數tetQ 潛在宿主菌能夠在常溫環境下存活有關[15]。消化過程中，不同氨氮濃度條件下TRGs的總絕對豐度均隨消化反應的進行先下降后升高，但氨氮濃度為600 mg·L-1的拐點發生在消化晚期（第28~45 天），而氨氮濃度為1 100 mg·L-1和1 600 mg·L-1的拐點發生在消化初期（第6~16 天），且1 600 mg·L-1的反應體系中TRGs 總絕對豐度始終高于600 mg·L-1和1 100 mg·L-1的反應體系（P<0.05）。這可能與在較高氨氮濃度（1 600 mg·L-1）的厭氧消化體系中微生物的停滯期延長有關[16]。各TRG 在氨氮濃度為600 mg·L-1和1 100 mg·L-1的消化過程中均被削減，但tetA和tetG卻在氨氮濃度為1 600 mg·L-1的消化過程中大量增加。消化結束后，TRGs的總絕對豐度在氨氮濃度為1 600 mg·L-1條件下最高，為1.70×109copies·mL-1；在氨氮濃度為600 mg·L-1和1 100 mg·L-1條件下TRGs 的總絕對豐度接近，分別為4.56×108copies·mL-1和4.6×108copies·mL-1。箱線圖中的中位數可表示TRGs絕對豐度在厭氧消化后的平均水平（圖2b）。在氨氮濃度為1 600 mg·L-1時，厭氧消化后TRGs 的平均水平最高，為7.50 logs，該水平與氨氮濃度為1 100 mg·L-1的試驗組接近（7.36 logs），當氨氮濃度為600 mg·L-1時，厭氧消化后TRGs 的平均水平最低，為6.67 logs，該結果表明高氨氮濃度的厭氧消化削減的TRGs 較少（P<0.05）。此外，對各TRG 在不同條件下厭氧消化后的絕對豐度進行對比可知，tetA、tetG、tetQ、tetT 和tetX 的絕對豐度在氨氮濃度為1 600 mg·L-1的條件下最高，特別是te?tA 和tetG，這兩個基因經此條件下的厭氧消化后變為消化前的1.05 倍和1.85 倍。TetO 的絕對豐度在氨氮濃度為1 100 mg·L-1的條件下最高。僅tetC 的絕對豐度在氨氮濃度為600 mg·L-1的條件下最高，但其絕對豐度在數值上與其他條件下的結果無顯著差異（P>0.05）。

圖2 牛糞厭氧消化過程中不同時間和不同處理的TRGs絕對豐度Figure 2 Absolute abundance of TRGs during anaerobic digestion based on diary manure

2.3 氨氮濃度對MGEs絕對豐度的影響

MGEs 是ARGs 在不同微生物之間轉移的重要媒介，對ARGs 在環境中的擴散起重要作用，因此，檢控其在厭氧消化中的絕對豐度變化十分重要。如圖3a所示，在牛糞原料中，目的MGEs（intI1、intI2和Tn916/1545）均存在，其總絕對豐度為1.46×108copies·mL-1，其中Tn916/1545 的占比最高，為66%。隨著消化反應的進行，MGEs 的總絕對豐度均先升高后下降。消化過程中，氨氮濃度為1 600 mg·L-1的試驗組中MGEs 的總絕對豐度始終顯著高于其他兩試驗組。消化結束時，氨氮濃度為600、1 100 mg·L-1和1 600 mg·L-1條件下的總絕對豐度分別為3.40×107、2.26×107copies·mL-1和6.01×108copies·mL-1。圖3b 為各MGEs 絕對豐度在厭氧消化前后的倍數變化值（值大于1表示基因增加，小于1表示基因減少）。氨氮濃度為1 100 mg·L-1和600 mg·L-1的厭氧消化反應體系中各MGE 及其總絕對豐度均表現為削減，而氨氮濃度為1 600 mg·L-1的條件下MGEs 的總絕對豐度在消化后增加了4.11 倍，這是因為在該條件下intI1 和intI2較厭氧消化前分別增加了10.55 倍和11.85 倍（圖3b）。整合子（intI1 和intI2）被認為是ARGs 發生水平轉移的關鍵因子[17-18]。上述結果表明牛糞厭氧消化中氨氮濃度高時MGEs 將增加，由此TRGs 在不同微生物之間轉移風險也將升高。

圖3 厭氧消化過程中MGEs絕對豐度及其變化Figure 3 Absolute abundance of MGEs and their changes during anaerobic digestion based on diary manure

2.4 微生物群落結構變化

微生物是ARGs 豐度變化的主要驅動因子[19]，其可能造成不同氨氮濃度條件下厭氧消化中TRGs絕對豐度變化差異。圖4 為厭氧消化過程中門水平微生物群落結構變化。在牛糞原料中，Bacteroidetes 為優勢菌門，占比為34%，其次為Firmicutes和Proteobacte?ria，占比分別為32%和17%。消化過程中，不同處理中的優勢菌門發生改變。在消化初期（第6 天），氨氮濃度為600 mg·L-1和1 100 mg·L-1的厭氧消化系統中Firmicutes 變為第一優勢菌門，占比高達71%和80%，而在氨氮濃度為1 600 mg·L-1的條件下消化系統中第一優勢菌門為Proteobacteria（51%），Firmicutes 僅占34%。隨著消化反應的進行，Firmicutes 的占比逐漸增大并變為第一優勢菌門，Bacteroidetes 逐漸消失。這與Firmicutes 對氨氮濃度的耐受性高而Bacteroide?tes 的生長會受到氨氮濃度的抑制有關[20]。不同處理間微生物群落結構的差異主要由第二優勢菌門造成。消化結束時，氨氮濃度為600 mg·L-1的系統中次要優勢菌門為Spirochaetes，而氨氮濃度為1 600 mg·L-1的系統中次要優勢菌門為Proteobacteria。研究表明Fir?micutes 對厭氧消化中纖維素的分解起關鍵作用，其優勢地位也反映出氨氮濃度較高時反應體系中乙酸的積累[21]。Spirochaetes 多出現在底物匱乏的厭氧消化器中，能夠發酵葡萄糖為乙酸、乙醇等[22]，而Proteo?bacteria 多為寡營養厭氧菌，其在有機質較少的環境中易生存[7]。Wang 等[23]的研究表明上述菌門均為ARGs 的常見潛在宿主菌門，其豐度的差異可能是不同氨氮水平下TRGs絕對豐度差異的原因。

圖4 厭氧消化過程中門水平細菌群落結構Figure 4 Relative abundances of bacterial community at the phylum level during anaerobic digestion

圖5 為厭氧消化過程中屬水平微生物（前50）的相對豐度變化，其中按行（樣本）對數據進行標準化。經厭氧消化后，屬水平微生物變化較為明顯。一些菌屬經厭氧消化后相對豐度顯著降低甚至被消滅，如Acinetobacter、Coprococcus和Clostridium等，而一些菌屬經厭氧消化后相對豐度顯著增加，如Syntrophomon?as、Ruminococcus和Treponema等。不同氨氮濃度條件下厭氧消化體系中屬水平微生物差異也較為明顯。消化初期（第6 天），Comamonas、Pusillimonas和Sedi?mentibacter的相對豐度隨氨氮濃度的升高而降低，而unidentified_Desulfovibrionaceae、 unidentified_MBA08

圖5 厭氧消化過程中屬水平細菌物種豐度Figure 5 Relative abundances of bacteria the genus level during anaerobic digestion

和Pusillimonas的相對豐度則呈相反趨勢，且unidenti?fied_Pseudomonadaceae和unidentified_Thermoanaero?bacterales在氨氮濃度為1 100 mg·L-1的體系中最高。隨著消化反應的進行，同一階段不同處理的優勢菌屬均不同，表明微生物的群落結構受到了氨氮濃度的影響。消化結束時，unclassified_Planococcaceae、uniden?tified_MBA08和Arcobacter為氨氮濃度1 600 mg·L-1條件下的優勢菌屬，而unidentified_Bacteroidales和BF311為氨氮濃度1 100 mg·L-1條件下的優勢菌屬，unidentified_Porphyromonadaceae和Sphaerochaeta為氨氮濃度600 mg·L-1條件下的優勢菌屬。上述結果表明，不論消化過程中還是消化結束時，不同牛糞氨氮濃度條件下厭氧消化體系中的屬水平微生物均存在差異。當這些微生物攜帶TRGs 時，勢必會在一定程度上造成TRGs的豐度差異。由此，微生物與TRGs的關系需進一步分析。

2.5 TRGs、MGEs和微生物的相關性分析

在厭氧消化體系中ARGs 可通過垂直基因轉移（Vertical gene transfer，VGT）和水平基因轉移（Hori?zontal gene transfer，HGT）兩種方式在微生物間傳播，其中，HGT 是ARGs 在環境中被獲得和傳播的主要途徑，具有更大環境危害性[24]。為考察不同氨氮濃度條件下TRGs 絕對豐度變化的驅動因子，對TRGs 與MGEs和屬水平微生物進行相關性分析（圖6）。TRGs與微生物之間的相關性分析可識別TRGs的潛在宿主菌。潛在宿主菌的相對豐度變化可在一定程度解釋TRGs的豐度變化[25]。如圖6 所示，tetO、tetQ、tetT 和tetX 擁有較多的潛在宿主，且多為共同宿主菌，如Clostridium、Comamonas和Coprococcus等。這些潛在宿主菌的相對豐度隨著氨氮濃度的升高而降低（圖5），與上述TRGs經不同氨氮濃度條件的厭氧消化之后絕對豐度的表現一致。tetC 與其潛在宿主菌也具有類似關系。tetA 和tetG 擁有的潛在宿主較少。不同氨氮濃度厭氧消化體系中tetA 和tetG 的潛在宿主菌的分布情況也有較明顯差異。tetA 的潛在宿主菌主要存在于氨氮濃度為600 mg·L-1的反應體系中，而tetG 的潛在宿主菌則主要分布在氨氮濃度為1 100 mg·L-1的反應體系中。tetA 和tetG 的大部分潛在宿主菌在氨氮濃度600 mg·L-1條件下的相對豐度較高，在氨氮濃度為1 600 mg·L-1的反應體系中較少，如Paludibacter和Bacteroides，這與厭氧消化后tetA 和tetG 的絕對豐度變化矛盾。對MGEs 和TRGs 進行相關性分析可知，在氨氮濃度為1 600 mg·L-1的反應體系中，tetA 與intI1呈顯著正相關（P<0.05），而tetG與intI2呈顯著正相關（P<0.05），表明tetA 和tetG 的增加與intI1 和intI2 的增加有關。這可能是因為牛糞中較高的氨氮濃度對微生物的DNA 造成了損傷，引發了微生物的SOS 反應，因此，在形成質粒的過程中整合子及其上的TRGs 也被快速復制[26-27]。上述結果表明潛在宿主菌的相對豐度變化可在一定程度上解釋TRGs 絕對豐度的變化，但氨氮濃度為1 600 mg·L-1的牛糞厭氧消化反應體系中部分TRGs 可能主要以HGT 途徑增加，不利于通過厭氧消化方式控制TRGs 在環境中的傳播。

圖6 TRGs、MGEs和屬水平微生物的相關性分析Figure 6 Correlation analysis among TRGs，MGEs and bacterial community the genus level

3 結論

（1）氨氮濃度為1 600 mg·L-1時，tetA 和tetG 的絕對豐度在牛糞高溫厭氧消化后增加。不同氨氮濃度條件下，tetC、tetO、tetQ、tetT 和tetX 的絕對豐度在消化后均減少。

（2）不同氨氮濃度條件下牛糞厭氧消化后體系中的第一優勢菌門均為Firmicutes。氨氮濃度為1 600 mg·L-1條件下消化后體系中的第二優勢菌門為Proteobac?teria，而氨氮濃度為1 100 mg·L-1和600 mg·L-1條件下消化后體系中的第二優勢菌門為Spirochaetes。

（3）四環素類抗生素抗性基因（TRGs）潛在宿主菌的種類和數目差異可在一定程度上解釋TRGs在消化過程中絕對豐度的變化。相關性分析表明，在氨氮濃度為1 600 mg·L-1的厭氧消化反應中tetA 和tetG 的增加主要與intI1 和intI2 的增加有關，說明利用含有較高氨氮濃度的牛糞進行厭氧消化時，TRGs 進行水平基因轉移的可能性較大，TRGs 在環境中進一步擴散的風險較高。