大豆低聚肽的分離純化及呈鮮序列鑒定

穆偉豪，石可歆，胡海玥，楊 晨，汪建明

(天津科技大學食品科學與工程學院，天津 300457)

大豆富含蛋白質、脂肪、碳水化合物等營養素及鈣、磷、鐵等礦物質，是自然界中蛋白質含量最高的植物[1].大豆低聚肽是大豆蛋白通過酶解而獲得的小分子水解產物[2]，具有抗氧化、抗疲勞、降血糖、提高免疫力、調節腸道功能等多種生理功能[3].大豆低聚肽不僅具有大豆蛋白質所不具備的良好的溶解性及吸水性[4]，而且其含有的鮮味肽序列對于食品的鮮味具有非常重要的貢獻[5].大豆的鮮味也被證實與其他味道存在相互作用，其中一個顯著特點就是抑制苦味[6].Kim等[7]從大豆中提取了5種鮮味肽，其中Glu-Glu鮮味肽序列可以通過與苦味受體結合抑制苦味.因此，探究大豆低聚肽的分離純化以及鮮味肽的序列對大豆低聚肽的開發應用非常必要.

目前低聚肽的分離純化方法主要有大孔樹脂層析法[8]、膜分離法[9]、凝膠過濾層析(gel filtration chromatography，GFC)法[10]、反相高效液相色譜(reversed-phase high performance liquid chromatography，RP-HPLC)法[11]、離子交換色譜法[12]等.隨著生物技術的發展，使用單一的分離純化技術很難將低聚肽從樣品中準確分離，必須結合多種方法從而達到最好的分離和純化效果.Rhyu等[3]使用膜分離技術對韓國豆醬中的低聚肽進行分離純化，結果表明一種相對分子質量在500～1000的低聚肽具有較高的鮮味強度.Kim等[13]通過離子交換色譜法結合高效液相色譜法對鱈魚皮水解物中的抗氧化肽進行分離純化，結果表明抗氧化肽C端存在Gly-Pro-Hyp的重復序列.Zhuang等[14]結合感覺引導分離法、大孔樹脂層析法、中壓液相色譜法和反相高效液相色譜法，從醬油中分離出5種鮮味肽，并通過超高效液相色譜-串聯質譜鑒定肽序列為ALPEEV、LPEEV、AQALQAQA、EQQQQ和EAGIQ.Deng等[15]采用連續超濾、凝膠過濾層析和反相高效液相色譜對蝦肉進行分離純化，使用納米高效液相色譜-質譜聯用技術鑒定了5條肽段，氨基酸序列分別為APAP、ASEFFR、AEASALR、LGDVLVR、WDDMEK.鄧靜[16]通過超濾、凝膠過濾層析、反相高效液相色譜法對雅魚鮮味肽進行分離純化，得到組分F4的鮮味值和鮮味提升值最高.

前期研究[5,7]表明，大豆低聚肽的不同氨基酸序列在一定程度上影響了食物的鮮味，而通過多種方法結合進行分離純化得到的低聚肽可以使鮮味肽的呈鮮序列更加準確.該方法優化大豆低聚肽的生產工藝，指導大豆低聚肽作為鮮味劑的開發應用.本研究將納濾分離法、凝膠過濾層析、反相高效液相色譜3種方法進行結合，依次對大豆低聚肽進行分離純化，縮小鮮味肽的相對分子質量，并結合鮮味、增鮮效果等感官評價對其呈味特性進行分析，得到呈鮮效果最好的組分；利用超高效液相色譜-串聯質譜法(ultra performance，liquid chromatography-tandem mass spectrometry，UPLC-MS/MS)[17]從中鑒定出鮮味肽的氨基酸序列，對納濾分離后的鮮味肽進行抑苦作用的研究.本研究旨在為大豆低聚肽調味品的開發應用提供一定的理論依據，為改善食品風味的研究提供新的選擇.

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 原料與試劑

大豆低聚肽(Pb)購自山東天博食品配料有限公司.

葡聚糖凝膠Sephadex G-15，分析純，上海源葉生物技術有限公司；乙腈、甲酸，色譜純，天津市津科精細化工研究所；三氟乙酸(TFA)，色譜純，上海麥克林生化科技有限公司.

1.1.2 儀器與設備

FD-1A-50型冷凍干燥機，北京博醫康實驗儀器有限公司；U120Pro型紫外-可見分光光度計，翱藝儀器(上海)有限公司；BS-100A型凝膠柱層析系統，上海青浦滬西儀器廠；半制備反相高效液相色譜儀，德國安捷倫公司；U3000型高效液相色譜儀，美國Waters公司；U3000型超高效液相色譜-串聯質譜儀，美國布魯克公司.

1.2 方法

1.2.1 大豆低聚肽相對分子質量分布測定

根據GB/T 22492—2008《大豆肽粉》，在220nm的紫外吸收波長下，使用高效凝膠過濾法進行測定，得到大豆低聚肽的相對分子質量及其分布范圍.

1.2.2 納濾分離法分離大豆低聚肽

納濾分離法具有操作便捷、條件溫和等優點，隨著膜技術以及制造工藝的發展，納濾分離法已經應用于食品、醫學等各個領域[18].將質量分數為2%的Pb溶液依次透過截留相對分子質量為1000、500、300的納濾膜進行分離，得4個組分，分別為Pb-1(Mr＞1000)，Pb-2(500＜Mr≤1000)，Pb-3(300≤Mr≤500)，Pb-4(Mr＜300)，各組分濃縮、冷凍干燥后(質量為m)，放于干燥器中保存待用.按照式(1)計算各組分的得率(R)，即各個組分在Pb溶液(Pb的質量為m0)中的占比.

1.2.3 凝膠過濾層析(GFC)分離呈味肽

根據Kong等[19]、梁佳明[20]的方法加以改進.凝膠層析柱(1.6cm×70cm)填料為葡聚糖凝膠Sephadex G-15，超純水平衡3h.Pb組分用超純水配制成質量濃度為20mg/mL的溶液，進樣量2mL，超純水洗脫流量為2mL/min，在214nm波長下檢測紫外吸收峰，混合收集同一峰下的組分，以Fb命名，經濃縮、冷凍干燥后，放于干燥器中備用.

1.2.4 反相高效液相色譜法分離呈味肽

根據Kong等[19]、Zhuang等[14]的方法加以改進.對經凝膠過濾層析得到的感官評分最高的Fb組分用半制備反相高效液相色譜法進行分離純化.用超純水配制成質量濃度20mg/mL的溶液，使用色譜柱為Shim-pack GIST C18(10mm×250mm，5μm)，流動相為0.05% TFA-乙腈溶液(A)和0.05% TFA-水溶液(B)，流量5mL/min，進樣量100μL.洗脫梯度：0～＜10min，20% A；10～20min，20%～50% A，洗脫液在紫外檢測器214nm波長下檢測，混合收集同一峰下的組分，以Kb命名，經濃縮、冷凍干燥后，在-20℃條件下保存備用.

1.2.5 感官評價

20名專業的感官評價人員(10名男士，10名女士，年齡25～35歲)在溫度為(23±2)℃的感官評價室內采用定量分析法對分離純化的Pb組分進行感官評價[21]，比較分離后各組分與標準組分的味道，感官評價人員對分離后的各組分進行0～20分的味覺評分，并以標準組分的味道評分為10分進行比較.大豆低聚肽的感官評價標準見表1.

表1 大豆低聚肽的感官評價標準Tab.1 Sensory evaluation of soybean oligopeptide

在納濾分離實驗中，以質量分數為1%的Pb溶液為標準品，以酸味、甜味、苦味、咸味、鮮味及增鮮作用為標準指標，進行感官評價.在凝膠過濾層析分離純化中，以質量分數1%的感官評價最好的納濾分離組分為標準品，以鮮味及增鮮作用為標準指標進行感官評分，對凝膠過濾層析分離各組分的滋味特性與標準品的對應滋味進行比較.在半制備反相高效液相色譜分離純化過程中，分別以質量分數為1%的鮮味和增鮮作用最好的組分為標準品，對其鮮味及增鮮效果進行感官評分，其RP-HPLC分離各組分的滋味特性與標準品的對應滋味進行比較.

1.2.6 超高效液相色譜-串聯質譜法鑒定鮮味肽結構

根據Liu等[22]的方法加以改進.經過納濾分離、凝膠過濾層析、反相高效液相色譜三步分離所得的鮮味和增鮮效果評分最高的組分Kb進行UPLCMS/MS鑒定.色譜條件：進樣質量濃度為2mg/mL，色譜柱為RP-C18(0.15mm×150mm，1.8μm)，流動相為0.1%甲酸-水溶液(A)和0.1%甲酸-乙腈溶液(B)，柱溫30℃，進樣量5μL，洗脫流量0.2mL/min，檢測波長220nm.洗脫梯度：0～＜50min，4%～50% B；50～＜54min，50%～100% B；54～60min，100% B.質譜條件：電噴霧離子源(ESI)正離子模式掃描，霧化氣壓力150kPa，干燥氣溫度180℃，干燥氣流量8.0L/min，質荷比(m/z)掃描范圍50～2000，并根據一級質譜信號強度選取前10個母離子進行碰撞誘導裂解(CID)獲得二級質譜.

1.3 數據處理

采用Origin 2018、SPSS 26.0軟件進行數據統計分析.每組實驗平行3次，測定結果以平均值表示.

2 結果與分析

2.1 大豆低聚肽的納濾分離

低聚肽往往采用超濾或納濾等膜分離技術進行初次分離[23].本研究采用截留相對分子質量≤1000的不同納濾膜依次對Pb溶液進行分離，按照1.2.2節的方法，將20mg/mL的Pb溶液依次通過截留相對分子質量為1000、500、300的納濾膜，得到Pb-1(Mr＞1000)、Pb-2(500＜Mr≤1000)、Pb-3(300≤Mr≤500)、Pb-4(Mr＜300).大豆低聚肽納濾分離各組分得率如圖1所示.

圖1 大豆低聚肽納濾分離各組分得率Fig.1Separation rates of each component in Pb nanofiltration separations

由圖1可知，Pb-3(300≤Mr≤500)為Pb中占比最多的組分.納濾分離法是一種依靠壓力推動的機械過濾過程，分離過程比較粗糙，受氨基酸的極性、納濾分離過程中的肽聚集、肽分子本身具有的吸附性、溶液中鹽離子帶有的正負電荷、納濾膜孔隙形狀等多種因素的影響，在這種過程中很難分離出相對分子質量精確的多肽，所以進一步采用凝膠過濾層析進行純化，以獲得更精確的組分[24].

按照1.2.4節的方法對經過納濾分離后的大豆低聚肽組分Pb-1、Pb-2、Pb-3、Pb-4進行感官評價，結果如圖2所示.

圖2 大豆低聚肽納濾分離各組分感官評價結果Fig.2 Sensory evaluation results of each component in Pb nanofiltration separation

經納濾分離得到的4個組分感官評價的酸味、苦味、咸味、鮮味強度和增鮮效果都隨著相對分子質量的增大呈先增強后減弱的趨勢，Pb-2的苦味最強，Pb-3的咸味、鮮味和增鮮效果則顯著高于其他3個組分，Pb-4的各種滋味評分均為所有組分中的最低值.不同的呈味效果與低聚肽的相對分子質量密切相關，而Pb-4組分的相對分子質量過小，溶液中幾乎不含有其他類呈味物質，呈味效果并不明顯.類似的有，Feng等[25]對雙孢蘑菇中呈鮮低聚肽成分進行了分離優化，結果表明，通過超濾分離的小分子肽U-Ⅱ(300≤Mr≤3000)具有較強的鮮味，U-Ⅰ(Mr＞3000)具有微弱的鮮味和苦味，U-Ⅲ(Mr＜300)幾乎不具有呈鮮作用；Liu等[6]對不同相對分子質量組分A1(Mr≤3000)、A2(Mr＞3000)進行了感官評價，發現與A2相比，A1的鮮味更強，苦味強度相對較弱，結果表明低相對分子質量組分A1是影響鮮味的關鍵活性組分.因此說明，不同相對分子質量的低聚肽對于組分的感官評價起著重要的作用，可以通過膜分離技術得到具有不同風味的低聚肽.

上述結果表明，Pb-3具有最高的鮮味強度和鮮味增強作用，由此可以推斷300≤Mr≤500的低聚肽對樣品的鮮味起到重要作用，因此收集組分Pb-3進行下一步的分離純化.

2.2 大豆低聚肽的凝膠過濾層析分離

將Pb經納濾分離后鮮味強度最高、增鮮效果最好的組分Pb-3通過Sephadex G-15凝膠過濾層析分離純化.如圖3所示，Pb-3經凝膠過濾層析后，在保留時間10～60min內被洗脫出3個峰，分別標記為Fb-1、Fb-2、Fb-3.分別收集多次凝膠過濾層析分離后同一吸收峰下的組分進行感官評價分析.

圖3 凝膠過濾層析分離純化組分Pb-3色譜圖Fig.3Separation and purification of component Pb-3 by Gel filtration chromatography

組分Pb-3凝膠過濾層析分離純化各組分的鮮味及鮮味增強特性如圖4所示.將Pb-3組分與凝膠分離組分進行分析對比，以Pb-3組分為10分標準，通過凝膠色譜分離得到的Fb-2的鮮味得分為10.5分，增鮮得分為14.9分，是組分中最高的且均大于Pb-3組分，說明Fb-2具有較高的鮮味強度和較強的鮮味增強效果.與前期研究結果[26]保持一致，即低相對分子質量的組分是食品中的主要味覺活性化合物.凝膠過濾層析分離是利用凝膠的網狀結構，相對分子質量大的組分在介質中滲透路徑越短，在色譜柱中的保留時間就越短，從而達到分離的目的[27]，其對低聚肽的分離效果受到過濾介質、過濾柱高度、流速等不同因素的影響[28].選取鮮味和增鮮效果都較好的組分Fb-2繼續進行下一步的分離純化.

圖4 組分Pb-3凝膠過濾層析分離純化各組分的鮮味及鮮味增強特性Fig.4Umami flavor and umami enhancement characteristics of component Pb-3 and Pb-3 separated by gel filtration chromatography

2.3 大豆低聚肽的反相高效液相色譜分離

反相高效液相色譜分離是通過分子疏水性的強弱對物質進行分離純化，具有安全、高效等優點.李曉明[29]通過RP-HPLC對白玉菇中的鮮味肽進行分離純化，得到組分P1、P2、P3、P4，其中P1的出峰時間最短，其疏水作用較弱，具有最佳的鮮味和鮮味增強效果.莊明珠[30]對醬油中的鮮味肽進行分離純化后得到組分HPLC-1、HPLC-2、HPLC-3、HPLC-4，結果表明分離的HPLC-3組分的鮮味比其他組分的好.將本研究的凝膠過濾層析分離所得的最優組分Fb-2進一步通過反相高效液相色譜法進行分離純化，共得到3個組分，分別為Kb-1、Kb-2、Kb-3，其色譜圖如圖5所示.

圖5 反相高效液相色譜法分離純化組分Fb-2色譜圖Fig.5 Separation and purification of component Fb-2 by RP-HPLC

分別收集多次分離后的各個組分進行鮮味及增鮮效果感官評價分析，RP-HPLC分離純化組分Fb-2各組分的鮮味及鮮味增強特性結果如圖6所示，3個組分中Kb-2的鮮味和增鮮效果最佳，其次為Kb-1，而Kb-3的鮮味評分低于未經過RP-HPLC分離的組分Fb-2，表明呈鮮效果較差.選取組分Kb-2采用UPLC-MS/MS進一步鑒定其氨基酸序列.

圖6 RP-HPLC分離純化組分Fb-2各組分的鮮味及鮮味增強特性Fig.6 Umami flavor and umami enhancement characteristics of component Fb-2 separated by RPHPLC

2.4 UPLC-MS/MS對鮮味肽的鑒定

組分Kb-2經UPLC-MS/MS鑒定出的肽序列結構圖如圖7所示.通過UPLC-MS/MS對經過納濾分離、GFC分離、RP-HPLC分離純化得到的鮮味和增鮮效果最佳的Kb-2組分進行鑒定，得到了2個相對分子質量分別為446.24、503.26的四肽Val-Thr-Val-Glu(VTVE)、Leu-Glu-Lys-Asp(LEKD)和1個相對分子質量為489.23的三肽Trp-Glu-Arg(WER).3種大豆低聚肽的相對分子質量集中在440～510之間，表明大豆低聚肽具有良好的呈鮮效果.梁佳明[20]使用納升級超高效液相色譜-串聯質譜對牛肝菌中的鮮味肽序列進行分析，共鑒定出2條多肽分別為LEFKQIAGSF、TVIDAPGHRD，其中含有較高的鮮味氨基酸，其水溶液有明顯的鮮味.溫志鵬[31]通過UPLC-MS/MS對海帶鮮味組分進行分析鑒定，發現3種海帶鮮味肽，其氨基酸序列分別為TDIRPY、KMGYWDA、ESGVIPY.已有研究[14]表明VE、LE、EK、KD、ER這些氨基酸組成結構都具有強烈的鮮味作用，而在Kb-2組分中鑒定出的VTVE、LEKD、WER這3條肽鏈中含有上述氨基酸序列，因此，這3條肽鏈對鮮味有重要的貢獻.從氨基酸組成來看，鮮味氨基酸以天冬氨酸(D)和谷氨酸(E)為主，組氨酸(H)和纈氨酸(V)可能引起多肽的鮮味.此外，谷氨酰胺(Q)、絲氨酸(S)、丙氨酸(A)、甘氨酸(G)和蘇氨酸(T)被認為是甜氨基酸，它們也能引起鮮味[32-33].精氨酸(R)或賴氨酸(K)作為C端氨基酸有助于多肽和鮮味受體的相互作用，導致多肽的鮮味強度更高[31].

圖7 組分Kb-2經UPLC-MS/MS鑒定出的肽序列結構圖Fig.7Peptide sequence structure of component Kb-2 identified by UPLC-MS/MS

3 結 語

使用納濾分離、凝膠過濾層析、RP-HPLC依次對大豆低聚肽進行三步分離純化，結合感官評價結果，得到了鮮味和增鮮效果最強的組分Kb-2，顯示大豆低聚肽具有較強的鮮味和增鮮效果，且相對分子質量集中在300～500.對比單一的分離純化方法，對大豆低聚肽進行逐步分離純化，更加準確地分離出大豆低聚肽呈鮮部分序列，用UPLC-MS/MS對大豆低聚肽進一步鑒定，得出2個四肽Val-Thr-Val-Glu(VTVE)、Leu-Glu-Lys-Asp(LEKD)和1個三肽Trp-Glu-Arg(WER).

研究表明，大豆低聚肽中特定的氨基酸序列具有較高的風味活性，可以作為一種新型鮮味劑使用.同時，在鮮味肽分離純化過程中，區別于目前應用廣泛的超濾，采用截留相對分子質量≤1000的納濾膜進行低聚肽的第一次分離純化，使分離效果更精準.對鮮味肽的鑒定只通過UPLC-MS/MS法進行分析，因此需要進一步通過不同的分離鑒定方法對其肽序列進行鑒定.文章重點研究了不同相對分子質量低聚肽的不同呈味效果，對于分離后的低聚肽的純度并沒有研究，接下來需進一步研究不同分離方法對大豆低聚肽分離純度的影響，為大豆低聚肽的進一步開發利用提供一定的理論依據.