催產素受體在山羊結狀神經節的分布

陳文東,朱秀娟,何玉鵬,王 昱,徐永平

(1.隴南師范高等專科學校 農林技術學院,甘肅成縣 742500;2.西北農林科技大學 動物醫學學院,陜西楊凌 712100)

催產素(Oxytocin,OT)是在動物機體下丘腦室旁核(Paraventricular nucleus)和視上核(Supraoptic nucleus)中產生的一種九肽類激素,其分泌主要受神經反射弧調節,經神經垂體釋放進入血液或腦脊液中,在血液循環中以自由肽的形式存在,催產素的功能是通過其與催產素受體(Oxytocin receptor,OTR)的特異性結合激活信號通路后而實現的。Caldwell 等[1]發現了一些新的催產素受體表達位點,包括內皮細胞、胰島細胞、幾種類型的癌細胞、脂肪細胞、心肌細胞、骨細胞和成肌細胞,這些發現擴大了傳統催產素的作用不僅僅是子宮收縮和排乳反射誘導物的范圍,當應用催產素時,這些不同位點的催產素受體表達可以激活各自組織胞內信號轉導通路[2]。最新對OTR定位數據表明,催產素受體在消化道內廣泛存在,比如腸吸收上皮細胞和腸腺上皮細胞,平滑肌和腸神經細胞特別是肌間神經叢,催產素可促進人類的胃排空,催產素受體抑制劑延遲人類的胃排空[3],但是,催產素延遲鼠的胃排空[4],表明催產素可以以內分泌調節的方式對胃腸道發揮 作用。

結狀神經節(nodose ganglion,NG)中的神經細胞為假單極神經細胞,這些假單極神經細胞分為兩部分,下行樹突為分布在大范圍消化道、心血管和呼吸器官的感覺神經末梢,是迷走神經的感覺神經纖維成分,上行樹突(中樞突)向腦干投射[5],在胃腸道、呼吸器官和心血管內形成的信號可以通過迷走神經傳遞到腦干。有文獻報道食道、心、肺、胃和腸等內臟傳入神經細胞主要分布在結狀神經節內。賁門、幽門和胃底等部位的感覺傳導是通過迷走神經完成的[6-7]。關于催產素通過外周神經對內臟活動影響的研究中,陳文東等[8-9]和任妮等[10-11]運用免疫組織化學技術分別在腹腔腸系膜前、后神經節,頸前神經節和頸胸神經節上發現了催產素受體的分布,并推斷催產素除了以分泌方式對一些內臟器官發揮調節作用外,還有可能通過影響支配這些內臟器官的外周交感神經細胞活性而發揮神經調節作用,這表明催產素可能通過內臟器官反射弧上的傳出神經纖維對內臟器官發揮調節作用。那么催產素是否同樣可通過與NG內催產素受體特異性結合,從而通過內臟器官反射弧上的傳入纖維對內臟器官發揮神經調節作用呢?本研究采用免疫組化方法檢測山羊NG內催產素受體的表達分布特點,為探索山羊NG是否具有成為OT對內臟器官進行內分泌調節和通過自主神經對內臟器官進行神經調節兩者相互協調作用節點的條件提供形態學依據。

1 材料與方法

1.1 試驗動物

楊凌農戶養殖的成年關中奶山羊,雌雄各5只,健康,雌性未懷孕。

1.2 試劑及儀器

免疫組化SP超敏試劑盒和內源性生物素阻斷試劑盒(邁新生物);一抗兔抗OTR多克隆抗體(北京康為世紀);四鹽酸3,3-二氨基聯苯胺(DAB)試劑盒(金橋生物);Leica石蠟切片機;顯微成像系統(賽默飛世爾)。

1.3 試驗方法

頸總動脈放血致死山羊,找出頸部迷走交感干,小心分離迷走神經和交感神經,然后順著迷走神經向胸部找到左右兩側結狀神經節,在靠近神經節處剪斷上下連接的神經纖維,取下結狀神經節,迅速放入裝有4%多聚甲醛溶液的廣口瓶里固定。按陳文東等[8]方法制作石蠟切片。制作出的石蠟切片分別進行HE染色和免疫組織化學染色,HE染色用于觀察NG組織形態學特點,其染色步驟為:脫蠟,梯度酒精復水,蘇木精染色,自來水反藍,伊紅染色,酒精脫水,二甲苯透明,最后中性樹膠封片。用于免疫組織化學染色的石蠟切片分成3 組,第一組為免疫組織化學SP法染色,用于OTR陽性染色定位及圖像分析,OTR陽性著色為棕褐色、黃褐色或淡黃色,第二組為免疫組織化學SP法染色,蘇木精復染,用于觀察OTR陽性細胞分布特點,第三組為空白對照,用于確定OTR染色的特異性。免疫組織化學SP法染色步驟為:石蠟切片經過脫蠟,復水,抗原修復后,按免疫組化SP超敏試劑盒說明書進行染色,試劑盒A液(內源性過氧化物酶阻斷劑)、B液(羊非免疫血清)、C液(生物素標記的羊抗兔IgG)和D液(鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化酶)在濕盒內分別孵育15、15、20、20 min,第一組在B液之后滴加兔抗OTR多克隆抗體(以1∶200的體積比稀釋),4 ℃冰箱過夜,D液之后加DAB顯色5 min,以上每個步驟完成后均需用0.01 mol/L PBS充分漂洗(連續3次,每次5 min)。第二組在免疫組化SP法染色后用蘇木精復染,其他步驟同SP法染色,第三組在B液孵育后滴加抗體稀釋液替代兔抗OTR多克隆抗體,其他步驟同第二組。以上切片經常規脫水、透明、封片后,Motic生物顯微鏡下觀察,拍照,并記錄試驗結果。

1.4 圖片分析及統計分析

用motic生物顯微鏡觀察免疫組織化學染色后的組織切片,并在顯微成像系統下拍照。選出10張免疫組織化學切片,每張切片再隨機拍5張400×照片,用Image-pro plus 6.0對照片進行光密度測定,操作步驟為首先設置光密度校正、測量項目(IOD和area)和分色選擇參數,然后在Count/Size窗口選擇Manual選項,點Select Colors調出segmentation工具選擇AOI (area of interest),最后點擊Count測定結狀神經節神經細胞和非神經細胞結構的平均光密度(平均光密 度=光密度累加值IOD/目標分布區域面積 area)[12]。用SPSS 20分析數據,數據表示形式為“平均數±標準差”,用單因子方差分析(One- way ANOVA,LSD)法檢驗比較結狀神經節內神經細胞和非神經細胞結構的OTR分布差異性。

2 結果與分析

2.1 HE染色結果

由圖1可知,結狀神經節中可見神經細胞成群分布,相對于其他細胞,神經細胞體積較大,胞體結構各異,各神經細胞之間及神經細胞與周圍組織之間邊界清晰,結構完整,還可見部分無核神經細胞。神經細胞胞質著色為紫紅色;胞核呈圓形或卵圓形,在神經細胞的邊緣或正中央位置,著色為藍色,少部分胞核內可見核仁結構,染色較核質顏色更深,此外可見到部分多核或雙核神經細胞。神經細胞周邊有支持細胞環繞,其形態扁平狀,結構清晰。在眾多神經細胞之間有神經纖維和微血管通過,神經纖維上包裹有雪旺細胞,胞核呈長卵圓狀;微血管內壁上的血管內皮細胞清晰可見,微血管管腔內可見有少量血細胞存在,著色為紅色。

1-1.免疫組織化學SP法對照組山羊結狀神經節HE染色;1-2.免疫組織化學SP法染色及蘇木精復染組山羊結狀神經節HE染色;1-3.免疫組織化學SP法染色組山羊結狀神經節HE染色;A.神經細胞;B.神經細胞胞質;C.神經細胞胞核;D.支持細胞;E.微血管;F.血管內皮細胞;G.過路神經纖維;H.雪旺細胞

2.2 免疫組織化學染色結果

對照組切片復染結果(圖2-1)可見,神經細胞胞體著色為淺紫色,神經細胞胞核著色為深紫色,整個切片背景為淺藍色,沒有其他著色。試驗組切片復染結果(圖2-2)可見,神經細胞胞體著色為棕褐色或黃褐色,其他非神經細胞結構胞核著色為紫色,證明催產素受體免疫組化SP染色結果沒有非特異性著色。

免疫組織化學染色結果(圖2-3)可見,結狀神經節各種細胞著色深淺不一,根據著色深淺將OTR表達分為4 個等級:棕褐色為強陽性;黃褐色為中等陽性;淡黃色為弱陽性;無著色為陰性。試驗組免疫組化SP染色結果可知,結狀神經節內OTR免疫陽性產物分布廣泛,神經細胞、過路神經纖維、血管內皮細胞、支持細胞和雪旺細胞均有不同程度的著色。神經節內著色神經細胞大小不等,最大神經細胞直徑達61 μm,最小直徑為32 μm(測量圖片內有核神經細胞,Image-pro plus 6.0測量)。神經細胞的胞核和支持細胞著色最深,為棕褐色,OTR分布強陽性。大部分神經細胞胞質(圖2-B)著色為黃褐色,OTR分布中等陽性,這部分神經細胞胞質約占神經細胞總數的78%。血管內皮細胞、細胞膜,以及一小部分神經細胞胞質著色較淺,為淡黃色,OTR分布弱陽性。神經細胞胞核的核仁呈圓形,著色極淺或不著色,OTR分布陰性。

2-1.OTR的免疫組織化學SP法對照組及蘇木精復染;2-2.OTR的免疫組織化學SP法染色及蘇木精復染;2-3.OTR的免疫組織化學SP法染色;A.神經細胞;B.神經細胞胞質;C.神經細胞胞核;D.支持細胞;E.微血管;F.血管內皮細胞;G.過路神經纖維;H.雪旺細胞

2.3 NG中OTR的表達量

圖像分析結果表明,結狀神經節中神經細胞內的OTR表達量極顯著大于非神經細胞結構 (P<0.01,表1)。

表1 結狀神經節OTR免疫組化染色的平均光密度值Table 1 Mean density of OTR stained by immunohisto chemistry in nodose ganglions

3 討 論

OT是第一個被確定生物活性和化學結構的性激素,它經垂體后的下丘腦神經終末進入血液循環,可以加強雌性動物子宮收縮和促進乳腺排乳。Jankowski 等[13]研究發現,大鼠皮下注射不同劑量的OT可引起血漿催產素濃度在生理學范圍內升高,增加低鈉飲食大鼠的尿鈉排泄作用,且這種作用可以被OTR抑制劑所阻斷,證明OT誘導的鈉尿排泄是依賴OTR而實現的。研究發現,人類和大鼠的所有心臟腔室、血管內皮細胞、血管平滑肌細胞[14]和腎臟[15]均有催產素受體存在,OT通過G1或Gq蛋白偶聯通路與這些受體相互作用調節心率和心肌收縮力、舒縮血管,以及調節腎小球的血流量。催產素誘導豚鼠胃竇平滑肌細胞放松[16],且降低狗和大鼠的胃動力[17-19]。上述資料表明,催產素可以直接與相應組織器官上的催產素受體特異性結合而發揮調節作用。OTR還存在于大鼠胰腺內胰島周邊及頸動脈體內[20],因此,OT可調節胰島素或胰高血糖素的產生而間接對大鼠血糖指數產生影響。

有關催產素受體在人類體內分布的研究發現,催產素受體基因位于3p25和3p26染色體區域上,包含4 個外顯子和3 個內含子,跨越19 210 個堿基對,其在人類下丘腦、杏仁核和海馬等“社會”腦區分布密度最大[21],單劑量催產素給藥時可顯著提高孤獨癥譜系障礙(ASD)患者對面部表情的識別能力、提高采訪者面部眼睛區域的注視點數和注視時間、增加社會注意加工等[22]。鼻吸催產素可以增加人類個體對面孔眼區部分的注意,增加自我知覺,提高男性的情緒共情和觀點采擇能力,調節人類的應激反應,提高對morphing面孔圖片中自我面孔的識別邊界[23]。研究表明,除了盲腸和膽囊外,人類胃腸道的各部分均表達催產素和催產素受體的mRNA[24],人類催產素全身用藥可增加胃排空,吸入催產素可以使患有嚴重慢性便秘的婦女排便次數增加一倍[25]。以上資料表明,催產素可與人類中樞神經系統及外周組織內分布的催產素受體特異性結合而發揮調節作用。此外,催產素受體在人的成骨細胞和破骨細胞表面也有存在,催產素通過與這些受體結合而對骨代謝發揮調解作用[26-27]。

OTR在動物中樞神經系統中廣泛表達分布[28],對于嚙齒動物類,OTR主要在嗅球和嗅結節、新皮層、海馬結構、中央和外側杏仁核、伏隔核、終紋床核和下丘腦腹內側核表達分布[29-30]。催產素通過與上述部位的催產素受體特異性結合發揮減少焦慮和壓力,促進社會交往、孕產婦保健和避免條件性逃避行為。Huber 等[31]對中央杏仁核的急性腦切片應用高度特異性的OTR激動劑,可使224個神經細胞中21%的自發峰值頻率增加,50%的神經細胞峰值頻率下降,且兩種反應是完全可逆的、可重復的,而且應用OTR阻斷劑對這種反應具有拮抗作用。Yoshida 等[32]發現,中縫核中相當數量的血清胺神經細胞表達OTR,這些受體可能通過刺激血清素釋放發揮抗焦慮作用。直接將OT注入到大鼠腦室或側腦室內,動物表現出明顯的鎮痛功效,誘發丘腦束旁核內關于痛興奮的神經細胞放點頻率表現一定程度的降低,縮短關于痛的抑制性神經細胞放電時間[33],以上作用均在OTR的介導下完成的。

催產素受體在外周神經也有表達分布,GABA受體和催產素受體可共存于背根神經節細胞膜,在動物處于某些刺激條件下的時候,垂體釋放OT與背根神經節細胞膜上的OTR結合,在脊髓水平對感覺信息,特別是痛覺信息進行調節[34]。有研究表明,催產素的鞘內給藥可激活存在于脊髓交感節前神經細胞的催產素受體,而起到增加心率,引起血壓輕微升高的作用[35]。支配陰莖的副交感神經節前神經細胞有催產素受體存在,催產素注入脊髓副交感神經核可引起大鼠陰莖勃起,阻斷催產素受體可去勃起作用[36-37]。以上資料提示,催產素可通過與神經細胞內的催產素受體特異性結合,從而通過神經細胞纖維對支配器官發揮作用。本研究通過免疫組織化學試驗技術證實,OTR免疫陽性產物在山羊結狀神經節內廣泛表達分布,且結狀神經節神經細胞內的OTR陽性產物表達量極顯著大于其他非神經細胞結構(P<0.01)。表明催產素受體主要表達分布在山羊結狀神經節內臟感覺神經細胞中,內臟感覺神經細胞具備對催產素刺激作出反應的條件,提示OT發揮作用的主要靶細胞為山羊結狀神經節中的內臟感覺神經細胞。盆腔和腹腔內大多數臟器的內臟痛覺傳入主要來自交感神經,迷走神經感覺纖維與血管運動反射、內分泌反射和特殊的內臟運動反射等有關系[38]。NG內的內臟傳入神經細胞中樞突與腦干連接,與孤束核、三叉神經脊束核、迷走神經背運動核和網狀巨細胞核等核團有廣泛的聯系[39]。內臟傳入沖動可以引起內臟活動改變,還可引起內臟軀體反射(即引起軀體的活動)。因此,調整內臟活動主要受源于內臟感覺神經沖動的改變來完成。本試驗采用免疫組織化學SP法發現山羊NG中催產素受體廣泛分布表達,表明山羊NG具有OT對內臟器官進行內分泌調節和通過自主神經對內臟器官進行神經調節兩者相互協調作用節點的條件,但催產素通過自主神經對內臟器官活動產生什么樣的影響,還有待進一步研究。

4 結 論

OTR免疫陽性產物在山羊NG中廣泛表達分布,且主要分布在NG內臟感覺神經細胞內,提示催產素有可能作用于NG內臟感覺神經細胞,從而通過內臟反射弧的傳入神經纖維影響內臟器官活動,而NG可能成為OT對內臟器官進行內分泌調節和通過自主神經對內臟器官進行神經調節兩者相互協調作用的節點。