球毛殼菌固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)抗植物病原真菌活性物質(zhì)的工藝優(yōu)化

廖宏娟，江玉梅，冶霞，張志斌，馬童雨，朱篤,2

球毛殼菌固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)抗植物病原真菌活性物質(zhì)的工藝優(yōu)化

廖宏娟1，江玉梅，冶霞1，張志斌1，馬童雨1，朱篤

1江西師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院/江西省亞熱帶植物資源保護(hù)與利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南昌 330022；2江西科技師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院/江西省生物加工過(guò)程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南昌 330013

【目的】?jī)?yōu)化球毛殼菌（）秸稈固態(tài)發(fā)酵的培養(yǎng)基組成和發(fā)酵條件，提高發(fā)酵粗提物的抗真菌活性，為球毛殼菌生物農(nóng)藥的開(kāi)發(fā)及秸稈綠色資源化提供參考。【方法】首先，以粗提物抗9種植物病原真菌菌絲生長(zhǎng)的抑制率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，對(duì)培養(yǎng)基中的秸稈（水稻、小麥、玉米、油菜）和氮源（豆粕、麥麩、氯化銨）進(jìn)行篩選，確定最適發(fā)酵培養(yǎng)基組成。隨后進(jìn)行發(fā)酵條件的單因素優(yōu)化，以粗提物對(duì)辣椒疫霉的抑制率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，初步確定各發(fā)酵條件的較優(yōu)范圍及對(duì)粗提物抗真菌活性影響的程度。基于單因素優(yōu)化的結(jié)果，利用正交設(shè)計(jì)對(duì)發(fā)酵條件進(jìn)行正交優(yōu)化，各參數(shù)的范圍如下：發(fā)酵時(shí)間18—36 d、發(fā)酵溫度26—32 ℃、培養(yǎng)基初始含水量70%—85%、秸稈與麥麩質(zhì)量比4﹕1—1﹕1、秸稈粒徑20—＞100目。最后，獲得球毛殼菌秸稈固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)抗真菌活性物質(zhì)的最優(yōu)發(fā)酵條件并進(jìn)行驗(yàn)證。【結(jié)果】在篩選固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基組成時(shí)發(fā)現(xiàn)，球毛殼菌以小麥秸稈和麥麩組成的培養(yǎng)基進(jìn)行發(fā)酵所獲得的粗提物的抗真菌效果總體上優(yōu)于其他組成的培養(yǎng)基。在發(fā)酵條件單因素優(yōu)化中，菌液接種量對(duì)粗提物抗真菌效果影響不顯著，故不對(duì)其進(jìn)行后續(xù)的正交優(yōu)化。正交優(yōu)化中各發(fā)酵條件對(duì)球毛殼菌發(fā)酵粗提物抗真菌活性的影響極為顯著（＜0.001），其影響程度依次為小麥秸稈與麥麩質(zhì)量比>發(fā)酵時(shí)間>培養(yǎng)基初始含水量>發(fā)酵溫度>小麥秸稈粒徑。正交優(yōu)化獲得的最優(yōu)發(fā)酵條件為發(fā)酵時(shí)間24 d、發(fā)酵溫度26 ℃、培養(yǎng)基初始含水量80%、小麥秸稈與麥麩質(zhì)量比4﹕1、小麥秸稈粒徑60—100目。經(jīng)發(fā)酵條件優(yōu)化后，1 mg·mL-1的球毛殼菌發(fā)酵粗提物對(duì)核盤(pán)菌、辣椒疫霉、稻瘟病菌、桃褐腐病菌、尖鐮孢、黃色鐮孢、鞘腐霉、禾谷鐮孢、水稻紋枯病菌的抑制率分別為100%、92.86%、85.94%、83.90%、76.12%、73.02%、66.18%、58.96%、52.99%。【結(jié)論】經(jīng)過(guò)發(fā)酵培養(yǎng)基組成和發(fā)酵條件優(yōu)化后，球毛殼菌的發(fā)酵粗提物具有較高的抗真菌活性，可為后續(xù)分離、純化球毛殼菌利用秸稈固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)生的抗真菌活性物質(zhì)打下基礎(chǔ)。

球毛殼菌；秸稈；植物病原真菌；固態(tài)發(fā)酵；抗真菌活性

0 引言

【研究意義】秸稈是主要的農(nóng)業(yè)廢棄物，富含可利用的纖維素資源，但秸稈具致密的木質(zhì)纖維素結(jié)構(gòu)，因而存在難降解和難以資源化的問(wèn)題[1]。球毛殼菌（）具有水解酶基因，可產(chǎn)生纖維素酶、半纖維素酶和木質(zhì)素酶來(lái)降解纖維素類物質(zhì)[2-5]。此外，球毛殼菌是研究最早的生防菌之一，其次級(jí)代謝產(chǎn)物種類多樣、結(jié)構(gòu)新穎，對(duì)多種植物病原真菌有良好的抑制效果[6-8]。因此，利用球毛殼菌以秸稈為底物進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵，既可以生產(chǎn)拮抗植物病原真菌的活性物質(zhì)，在一定程度上減少化學(xué)農(nóng)藥的使用；又可對(duì)秸稈進(jìn)行綠色資源化利用，將其變廢為寶，這對(duì)環(huán)境保護(hù)和農(nóng)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展均具有非常重要的價(jià)值和意義。【前人研究進(jìn)展】球毛殼菌隸屬于子囊菌門（Ascomycota）核菌綱（Pyrenomycetes）糞殼菌目（Sordariales）毛殼菌科（Chaetomiaceae）毛殼菌屬（），是公認(rèn)的生產(chǎn)碳水化合物活性酶和抗生素的重要家族，能有效降解纖維素和有機(jī)物，同時(shí)對(duì)其他微生物產(chǎn)生拮抗作用[9-10]。鐮孢菌屬（spp.）、絲核菌屬（spp.）、核盤(pán)菌屬（spp.）、鏈格孢屬（spp.）和刺盤(pán)孢屬（spp.）是常見(jiàn)植物病原真菌，球毛殼菌可通過(guò)產(chǎn)生具有抗真菌活性的次級(jí)代謝產(chǎn)物、產(chǎn)生細(xì)胞壁降解酶、誘導(dǎo)植物自身產(chǎn)生系統(tǒng)抗性、促進(jìn)植物生長(zhǎng)發(fā)育、重寄生和競(jìng)爭(zhēng)等多種機(jī)制對(duì)這些病原菌引起的植物病害進(jìn)行生物防治[8]。目前，球毛殼菌可利用玉米秸稈[11-12]和水稻秸稈[13]生產(chǎn)具有抑菌和抗腫瘤等多種生物活性的球毛殼菌素A（chaetoglobosin A），還可利用小麥秸稈[14-15]生產(chǎn)一種具有良好抗氧化和抑菌活性的新型胞外多糖，且秸稈基本能夠滿足球毛殼菌的生長(zhǎng)需求，僅需補(bǔ)充少量氮源[11]，因而秸稈可作為球毛殼菌的發(fā)酵底物。【本研究切入點(diǎn)】球毛殼菌DX-THS3是從江西省撫州市東鄉(xiāng)野生稻莖中分離出的植物內(nèi)生真菌，該菌在分解甘草秸稈的同時(shí)可生產(chǎn)甘草次酸3--單---葡萄糖醛酸和木質(zhì)纖維素酶[5,16]。球毛殼菌不僅可分解秸稈等纖維素類物質(zhì)，還是常見(jiàn)的生防菌，其產(chǎn)生的球毛殼菌素類和嗜氮酮類物質(zhì)多具有抗真菌活性[2-5,8]。但目前用于球毛殼菌產(chǎn)抗真菌代謝產(chǎn)物的培養(yǎng)基絕大多數(shù)是合成或半合成的液體培養(yǎng)基，鮮見(jiàn)使用秸稈進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)抗真菌活性物質(zhì)。且與液態(tài)發(fā)酵相比，固態(tài)發(fā)酵在降低原料成本、降低能耗、提高產(chǎn)物濃度和無(wú)廢水排放方面具有顯著優(yōu)勢(shì)[17-20]，因此亟需對(duì)球毛殼菌利用秸稈固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)抗真菌活性物質(zhì)的工藝進(jìn)行探索。【擬解決的關(guān)鍵問(wèn)題】以球毛殼菌DX-THS3為試驗(yàn)對(duì)象，對(duì)其固態(tài)發(fā)酵的秸稈種類、氮源種類、發(fā)酵時(shí)間、發(fā)酵溫度、培養(yǎng)基初始含水量、菌液接種量、秸稈粒徑、秸稈與氮源質(zhì)量比進(jìn)行工藝優(yōu)化，獲得球毛殼菌秸稈固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)抗真菌活性物質(zhì)的最優(yōu)發(fā)酵培養(yǎng)基和固態(tài)發(fā)酵條件。

1 材料與方法

試驗(yàn)于2021年10月至2022年8月在江西師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院/江西省亞熱帶植物資源保護(hù)與利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室完成。

1.1 材料

1.1.1 菌株 球毛殼菌DX-THS3為實(shí)驗(yàn)室前期從東鄉(xiāng)野生稻莖部分離出的植物內(nèi)生真菌[16]。該菌于2016年1月4日保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號(hào)為CCTCCNO：M2016005。

植物病原真菌：核盤(pán)菌（YC-24）、尖鐮孢（HG-5）、水稻紋枯病菌（SDS-12）和辣椒疫霉（FU-4）均由江西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院向妙蓮教授贈(zèng)送；禾谷鐮孢（L51）、黃色鐮孢（S18）、稻瘟病菌（R10）、鞘腐霉（L99）和桃褐腐病菌（F11）為本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 固態(tài)發(fā)酵基質(zhì) 水稻秸稈、小麥秸稈、玉米秸稈、油菜秸稈、麥麩末和豆粕末均購(gòu)于南昌縣沃爾得秸稈回收專業(yè)合作社。水稻秸稈的總碳和總氮含量分別為372.15、23.59 g·kg-1，小麥秸稈的總碳和總氮含量分別為420.57、19.20 g·kg-1，玉米秸稈的總碳和總氮含量分別為426.91、25.81 g·kg-1，油菜秸稈的總碳和總氮含量分別為367.59、26.93 g·kg-1，麥麩的總碳和總氮含量分別為435.6、44.07 g·kg-1，豆粕的總碳和總氮含量分別為444.76、85.13 g·kg-1。氯化銨（分析純）購(gòu)于西隴科學(xué)股份有限公司。

1.1.3 培養(yǎng)基 馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）培養(yǎng)基（g·L-1）：200 g馬鈴薯，葡萄糖20 g，瓊脂18 g，pH自然。

馬鈴薯葡萄糖肉湯（PDB）培養(yǎng)基（g·L-1）：不加瓊脂，方法同上。

秸稈固態(tài)培養(yǎng)基（優(yōu)化前）：取16 g秸稈與氮源混合物（秸稈與麥麩和豆粕質(zhì)量比為2﹕1、與氯化銨質(zhì)量比為20﹕1）和40 mL蒸餾水于1 L錐形瓶中，121 ℃滅菌20 min。

1.2 主要儀器與試劑

ZWY-2112B恒溫?fù)u床（上海智城有限公司），RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠），KQ5200超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司），LDZM-80KCS高壓自動(dòng)滅菌鍋（上海申實(shí)醫(yī)療器械廠），F(xiàn)N2004電子天平（上海精密科學(xué)儀器有限公司），PQX-280A-12HM恒溫培養(yǎng)箱（寧波萊福科技有限公司）、BCM-1300A生物潔凈工作臺(tái)（蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司）、800A粉碎機(jī)（永康市紅太陽(yáng)機(jī)電有限公司）。分析純丙酮、甲醇（西隴科學(xué)股份有限公司）、乙酸乙酯（成都市科隆化學(xué)品有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 菌株活化及培養(yǎng) 將球毛殼菌接種至PDA培養(yǎng)基中，在28 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)一周使其活化。待菌株活化后，少量多次刮取菌絲接入到含有150 mL PDB培養(yǎng)基的錐形瓶中，并于28 ℃、160 r/min搖床中培養(yǎng)4—5 d，即可得到種子液。然后將種子液接種到秸稈固態(tài)培養(yǎng)基中并拌勻，每瓶接種量為8 mL，于28 ℃培養(yǎng)箱中靜置避光發(fā)酵14 d。

1.3.2 粗提物制備 發(fā)酵結(jié)束后，將兩瓶發(fā)酵物攪碎并合為一瓶，在瓶中加入500 mL丙酮，超聲輔助提取30 min，重復(fù)3次，收集丙酮提取液并減壓濃縮。然后用乙酸乙酯1﹕1萃取3次，收集乙酸乙酯層，將其減壓濃縮制得浸膏，用于抗真菌活性測(cè)定。

1.3.3 抗真菌活性測(cè)定 采用菌絲生長(zhǎng)抑制法測(cè)定不同固態(tài)發(fā)酵條件下粗提物的抗真菌活性。將浸膏（粗產(chǎn)物）用甲醇充分溶解，溶液經(jīng)0.22 μm無(wú)菌濾頭過(guò)濾后與50 ℃左右的PDA培養(yǎng)基混勻，制成1 mg·mL-1的含藥平板，以含有等體積甲醇的PDA培養(yǎng)基為空白對(duì)照。用直徑為6 mm的圓形打孔器在已活化好的植物病原真菌菌落邊緣上取相同大小的菌餅，并分別接種于含藥和空白對(duì)照平板中央，每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)，于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中黑暗培養(yǎng)。待空白對(duì)照組中病原真菌生長(zhǎng)至近培養(yǎng)皿邊緣時(shí)，采用十字交叉法測(cè)量菌絲生長(zhǎng)直徑（除去菌餅直徑6 mm），抑菌率按如下公式計(jì)算：抑制率（%）=100×（對(duì)照組菌落直徑-含藥組菌落直徑）/（對(duì)照菌落直徑-6 mm）。

1.3.4 固態(tài)培養(yǎng)基組成優(yōu)化 選擇水稻秸稈、小麥秸稈、玉米秸稈和油菜秸稈分別作為發(fā)酵底物，添加的氮源分別為豆粕、麥麩和氯化銨，對(duì)4種秸稈和3種氮源進(jìn)行全因素試驗(yàn)。在培養(yǎng)基中接入球毛殼菌后，于28 ℃培養(yǎng)箱中靜置避光發(fā)酵14 d。待發(fā)酵結(jié)束后，提取發(fā)酵粗產(chǎn)物（方法同1.3.2），采用菌絲生長(zhǎng)法測(cè)定粗提物抗真菌活性，以確定抗真菌活性最高的培養(yǎng)基基質(zhì)種類。

1.3.5 固態(tài)發(fā)酵條件優(yōu)化 固態(tài)發(fā)酵條件單因素優(yōu)化：使用抗真菌活性最高的培養(yǎng)基基質(zhì)（小麥秸稈+麥麩），以發(fā)酵時(shí)間14 d、發(fā)酵溫度28 ℃、培養(yǎng)基初始含水量70%、菌液接種量50%、小麥秸稈粒徑40—60、小麥秸稈與麥麩質(zhì)量比2﹕1為基礎(chǔ)發(fā)酵條件，辣椒疫霉為指示菌。對(duì)發(fā)酵時(shí)間（10、14、18、22、26 d）、發(fā)酵溫度（24、26、28、30、32 ℃）、培養(yǎng)基初始含水量（50%、60%、70%、80%、90%）、菌液接種量（25%、37.5%、50%、62.5%、75%）、小麥秸稈粒徑（10—20、20—40、40—60、60—100、＞100目）、小麥秸稈與麥麩質(zhì)量比（3﹕1、2﹕1、1﹕1、1﹕2、1﹕3）這6個(gè)發(fā)酵條件進(jìn)行單因素優(yōu)化，研究不同發(fā)酵條件下粗提物抗真菌活性的高低，以此確定最優(yōu)發(fā)酵條件范圍。

固態(tài)發(fā)酵條件正交優(yōu)化：采用SPSS 21.0軟件，在單因素優(yōu)化的基礎(chǔ)上，選擇發(fā)酵時(shí)間、發(fā)酵溫度、培養(yǎng)基初始含水量、小麥與麥麩質(zhì)量比、秸稈粒徑進(jìn)行5因素4水平的正交試驗(yàn)，并以辣椒疫霉為指示菌，優(yōu)化球毛殼菌粗提物的抗真菌活性，所設(shè)計(jì)的因素水平如表1所示。

表1 正交試驗(yàn)因素水平

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

每個(gè)處理至少進(jìn)行3次平行試驗(yàn)，利用Excel 2019軟件進(jìn)行基本的數(shù)據(jù)整理和統(tǒng)計(jì)。利用IBM SPSS Statistics 21軟件并采用單因素（one-way ANOVA）和最小顯著差異法（LSD）進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)，以＜0.05作為差異顯著性判斷標(biāo)準(zhǔn)。利用Origin 2018軟件進(jìn)行圖像繪制，圖中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤。

2 結(jié)果

2.1 固態(tài)培養(yǎng)基組成優(yōu)化

在微生物發(fā)酵過(guò)程中，不同培養(yǎng)基基質(zhì)對(duì)微生物次級(jí)代謝產(chǎn)物的影響相當(dāng)明顯。由表2可知，對(duì)于同一種秸稈而言，以麥麩為氮源進(jìn)行發(fā)酵時(shí)所獲得的粗提物的抗真菌活性總體上比其他兩種氮源高，因此后續(xù)試驗(yàn)選擇麥麩作為秸稈培養(yǎng)基的氮源。此外，以麥麩為氮源時(shí)，發(fā)酵小麥、水稻和玉米這3種秸稈所得粗提物對(duì)植物病原真菌的抑制率均較高，但總體上以小麥秸稈+麥麩組合的粗提物抑菌活性最好，特別是對(duì)辣椒疫霉、桃褐腐病菌、黃色鐮孢和鞘腐霉的抑制效果均顯著高于水稻秸稈+麥麩和玉米秸稈+麥麩這兩個(gè)組合。因此，后續(xù)以麥麩為氮源，對(duì)球毛殼菌固態(tài)發(fā)酵小麥秸稈的發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化。

2.2 固態(tài)發(fā)酵條件單因素優(yōu)化

2.2.1 發(fā)酵時(shí)間對(duì)粗提物抗真菌活性的影響 由圖1-A可知，在設(shè)定的發(fā)酵時(shí)間范圍內(nèi)，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，粗提物對(duì)辣椒疫霉的抑制率總體上呈上升趨勢(shì)，在26 d時(shí)抑制率最大。后續(xù)選擇發(fā)酵時(shí)間18—36 d為正交試驗(yàn)因素水平。

表2 秸稈與氮源種類對(duì)球毛殼菌粗提物抗真菌活性的影響

A：核盤(pán)菌YC-24YC-24；B：稻瘟病菌R10R10；C：辣椒疫霉FU-4FU-4；D：桃褐腐病菌F11F11；E：尖鐮孢HG-5HG-5；F：黃色鐮孢S18S18；G：鞘腐霉L99L99；H：禾谷鐮孢L51L51；I：水稻紋枯病菌SDS-12SDS-12。同列數(shù)據(jù)后不同小寫(xiě)字母表示處理間在＜0.05水平差異顯著Different lowercase letters after the data in the same column indicate significantly different among treatments at＜0.05 level

2.2.2 發(fā)酵溫度對(duì)粗提物抗真菌活性的影響 由圖1-B可知，在設(shè)定的發(fā)酵溫度范圍內(nèi)，隨著發(fā)酵溫度的升高，粗提物對(duì)辣椒疫霉的抑制率呈先上升后下降的趨勢(shì)，在28 ℃時(shí)抑制率最大。發(fā)酵溫度為32 ℃時(shí)抑制率急劇下降的原因可能是培養(yǎng)基中的水分蒸發(fā)過(guò)快，使球毛殼菌菌絲生長(zhǎng)困難，造成球毛殼菌提前死亡。后續(xù)選擇發(fā)酵溫度26—32 ℃為正交試驗(yàn)因素水平。

2.2.3 培養(yǎng)基初始含水量對(duì)粗提物抗真菌活性的影響 固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基的初始含水量對(duì)培養(yǎng)基中的氣體交換和菌體生長(zhǎng)具有重要作用。由圖2-A可知，在設(shè)定的培養(yǎng)基初始含水量范圍內(nèi)，培養(yǎng)基初始含水量過(guò)高或過(guò)低都不利于球毛殼菌產(chǎn)生具有抗真菌活性的代謝產(chǎn)物。在初始含水量為80%時(shí)粗提物對(duì)辣椒疫霉的抑制率最大。后續(xù)選擇培養(yǎng)基初始含水量70%—85%為正交試驗(yàn)因素水平。

2.2.4 菌液接種量對(duì)粗提物抗真菌活性的影響 由圖2-B可知，在設(shè)定的菌液接種量范圍內(nèi)，隨著菌液接種量的增加，粗提物對(duì)辣椒疫霉的抑制率呈先上升后下降的趨勢(shì)，在菌液接種量為50%和62.5%時(shí)抑制率較大。此外，各菌液接種量處理間的差異不太明顯，故不對(duì)其進(jìn)行后續(xù)優(yōu)化，后續(xù)試驗(yàn)的接種量確定為50%。

2.2.5 小麥秸稈粒徑范圍對(duì)粗提物抗真菌活性的影響 秸稈粒徑大小直接影響到菌絲與秸稈的接觸面積，進(jìn)而影響菌絲的生長(zhǎng)。由圖3-A可知，在設(shè)定的小麥秸稈粒徑范圍內(nèi)，隨著小麥秸稈粒徑目數(shù)的升高，粗提物對(duì)辣椒疫霉的抑制率總體呈上升的趨勢(shì)，在100目時(shí)抑制率最大。后期將選擇小麥秸稈粒徑20—40、40—60、60—100、＞100目為正交試驗(yàn)因素水平。

柱上不同小寫(xiě)字母表示處理間在P＜0.05水平差異顯著。下同

圖2 培養(yǎng)基初始含水量和菌液接種量對(duì)粗提物抗真菌活性的影響

圖3 小麥秸稈粒徑和小麥秸稈與麥麩質(zhì)量比對(duì)粗提物抗真菌活性的影響

2.2.6 小麥秸稈與麥麩質(zhì)量比對(duì)粗提物抗真菌活性的影響 麥麩可以提供良好的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)促進(jìn)微生物生長(zhǎng)，但培養(yǎng)基中麥麩含量過(guò)高可能不利于微生物生產(chǎn)抑菌活性物質(zhì)。由圖3-B可知，在設(shè)定的小麥秸稈與麥麩質(zhì)量比范圍內(nèi)，隨著小麥秸稈與麥麩質(zhì)量比的下降，粗提物對(duì)辣椒疫霉的抑制率總體呈下降的趨勢(shì)，說(shuō)明過(guò)多的麥麩不利于球毛殼菌產(chǎn)生抗真菌活性物質(zhì)。后續(xù)選擇小麥秸稈與麥麩質(zhì)量比4﹕1—1﹕1為正交試驗(yàn)因素水平。

2.3 固態(tài)發(fā)酵條件正交優(yōu)化

根據(jù)單因素試驗(yàn)的結(jié)果，建立了5因素4水平的正交試驗(yàn)因素和水平表（表1）。用L16(45)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)對(duì)球毛殼菌秸稈固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)抗真菌活性物質(zhì)的發(fā)酵工藝進(jìn)行優(yōu)化，以粗提物對(duì)辣椒疫霉的抑制率為考察指標(biāo)，正交試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3，方差分析結(jié)果見(jiàn)表4。

在表3中，通過(guò)對(duì)各因素的R值和K值進(jìn)行直觀分析可知，各因素對(duì)球毛殼菌發(fā)酵粗提物抗真菌活性影響大小的主次順序?yàn)镈（小麥秸稈與麥麩質(zhì)量比）＞A（發(fā)酵時(shí)間）＞C（培養(yǎng)基初始含水量）＞B（發(fā)酵溫度）＞E（小麥秸稈粒徑）；由K值大小確定球毛殼菌固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)抗真菌活性物質(zhì)的最優(yōu)條件為A2B1C3D1E3，即發(fā)酵時(shí)間24 d、發(fā)酵溫度26 ℃、培養(yǎng)基初始含水量80%、小麥秸稈與麥麩質(zhì)量比4﹕1、小麥秸稈粒徑60—100目。此外，由表4可知正交試驗(yàn)所優(yōu)化的5個(gè)因素對(duì)球毛殼菌秸稈固態(tài)發(fā)酵粗提物抗真菌活性的影響極顯著（＜0.001）。

表3 正交試驗(yàn)方案及結(jié)果

A：發(fā)酵時(shí)間fermentation time；B：發(fā)酵溫度f(wàn)ermentation temperature；C：初始含水量initial water content；D：小麥秸稈與麥麩質(zhì)量比mass ratio of wheat straw to wheat bran；E：秸稈粒徑straw particle size。表4同The same as Table 4

表4 正交試驗(yàn)方差分析

2.4 正交優(yōu)化結(jié)果的驗(yàn)證

為了驗(yàn)證正交試驗(yàn)結(jié)果，按照正交試驗(yàn)所得到的最優(yōu)發(fā)酵條件，探討發(fā)酵條件優(yōu)化后球毛殼菌的發(fā)酵粗提物對(duì)植物病原真菌的抗菌效果是否有顯著提升，重復(fù)試驗(yàn)3次。結(jié)果表明，在最優(yōu)發(fā)酵條件，1 mg·mL-1的球毛殼菌發(fā)酵粗提物對(duì)核盤(pán)菌、辣椒疫霉、稻瘟病菌、桃褐腐病菌、尖鐮孢、黃色鐮孢、鞘腐霉、禾谷鐮孢、水稻紋枯病菌的抑制率分別為100%、92.86%、85.94%、83.90%、76.12%、73.02%、66.18%、58.96%、52.99%，抑菌圖見(jiàn)圖4。

A—I依次為核盤(pán)菌YC-24、辣椒疫霉FU-4、稻瘟病菌R10、桃褐腐病菌F11、尖鐮孢HG-5、黃色鐮孢S18、鞘腐霉L99、禾谷鐮孢L51、水稻紋枯病菌SDS-12的空白對(duì)照A-I are blank control pictures of S. sclerotiorum YC-24, P. capsica FU-4, M. oryzae R10, M. fructicola F11, F. oxysporum HG-5, F. culmorum S18, S. oryzae L99, F. graminearum L51, R. solani SDS-12, respectively；a—i依次為粗提物處理上述病原真菌生長(zhǎng)的結(jié)果a-i are the treatment results of crude extracts against each pathogenic fungus

此外，如圖5所示，與等濃度的對(duì)照粗提物（指僅優(yōu)化培養(yǎng)基組成，但未優(yōu)化發(fā)酵條件所獲得的粗提物）相比，發(fā)酵條件優(yōu)化后球毛殼菌粗提物對(duì)9種植物病原真菌的抗菌活性有不同程度的提升，其中對(duì)辣椒疫霉、稻瘟病菌、桃褐腐病菌、尖鐮孢、黃色鐮孢、禾谷鐮孢和水稻紋枯病菌這7種病原菌抑制率的提升效果顯著。在最優(yōu)發(fā)酵條件下獲得的粗提物對(duì)核盤(pán)菌的抑制率至少增加2.03%，對(duì)辣椒疫霉、稻瘟病菌、桃褐腐病菌、尖鐮孢、黃色鐮孢、鞘腐霉、禾谷鐮孢、水稻紋枯病菌的抑制率分別增加了15.81%、13.26%、12.60%、12.88%、10.86%、4.89%、9.81%、10.13%。

3 討論

3.1 培養(yǎng)基組成對(duì)球毛殼菌固態(tài)發(fā)酵粗提物抗真菌活性的影響

選擇合適的發(fā)酵培養(yǎng)基和發(fā)酵條件是固態(tài)發(fā)酵的關(guān)鍵因素，因?yàn)槠鋵?duì)微生物代謝產(chǎn)物的種類和產(chǎn)量有重要影響。據(jù)報(bào)道，球毛殼菌W7在玉米秸稈和氯化銨組成的培養(yǎng)基中進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵可產(chǎn)生球毛殼菌素A，該物質(zhì)對(duì)擬分枝鐮孢（）和立枯絲核菌的抑制效果顯著[11-12]。球毛殼菌CGMCC 6882在僅含有小麥秸稈的液體培養(yǎng)基中可產(chǎn)生一種具有抗氧化和抗菌活性的多糖，在含有水稻秸稈和其他多種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的液體培養(yǎng)基中可產(chǎn)生球毛殼菌素A[13-15]。前人的研究說(shuō)明，球毛殼菌利用農(nóng)業(yè)廢棄物秸稈產(chǎn)生具有生物活性的物質(zhì)是可行的，同時(shí)球毛殼菌能產(chǎn)生不同的活性物質(zhì)，其原因可能是不同培養(yǎng)基成分和培養(yǎng)狀態(tài)下激活了球毛殼菌的某些沉默基因簇。本試驗(yàn)在前人研究基礎(chǔ)上對(duì)培養(yǎng)基的組成進(jìn)行優(yōu)化，并發(fā)現(xiàn)小麥秸稈和麥麩組成的培養(yǎng)基有利于球毛殼菌產(chǎn)生具有抗真菌活性的物質(zhì)。PAN等[21]利用PDB培養(yǎng)基對(duì)球毛殼菌28進(jìn)行培養(yǎng)，所獲得的粗提物（1 mg·mL-1）對(duì)核盤(pán)菌、尖鐮孢、辣椒疫霉和禾谷鐮孢的抑菌率分別為59.66%、61.68%、64.90%和59.06%；KUMAR等[22]使用MPG液態(tài)培養(yǎng)基對(duì)球毛殼菌EF-18進(jìn)行發(fā)酵，所得粗提物（0.5 mg·mL-1）對(duì)核盤(pán)菌的抑制率為70.08%；LIU等[23]也利用PDB培養(yǎng)基對(duì)球毛殼菌LB-2進(jìn)行培養(yǎng)，所得粗提物（1 mg·mL-1）對(duì)尖鐮孢的抑制率為70.08%。本研究利用小麥秸稈和麥麩組成的秸稈固態(tài)培養(yǎng)基對(duì)球毛殼菌DX-THS3進(jìn)行發(fā)酵，所得粗提物的抗菌活性較高，不遜于常見(jiàn)的PDB培養(yǎng)基發(fā)酵。值得注意的是，本研究的粗提物（1 mg·mL-1）對(duì)核盤(pán)菌和辣椒疫霉的抑制率分別為100%和92.86%，顯著高于球毛殼菌在PDB培養(yǎng)基中發(fā)酵所得粗提物的抑制率。因此，球毛殼菌可利用小麥秸稈生產(chǎn)抗真菌活性物質(zhì)，對(duì)秸稈進(jìn)行綠色資源化利用。

CK：僅優(yōu)化培養(yǎng)基組成，但未優(yōu)化發(fā)酵條件所獲得的粗提物the crude extract obtained by optimizing the medium composition, but not the fermentation conditions；PT：優(yōu)化培養(yǎng)基組成和發(fā)酵條件后所獲得的粗提物the crude extract obtained after optimizing medium composition and fermentation conditions。*：同一植物病原真菌的PT與CK相比在P＜0.05水平差異顯著PT and CK of the same plant pathogen fungus are significantly different at P＜0.05 level。SS：核盤(pán)菌YC-24 S. sclerotiorum YC-24；PC：辣椒疫霉FU-4 P. capsica FU-4；MO：稻瘟病菌R10 M. oryzae R10；MF：桃褐腐病菌F11 M. fructicola F11；FO：尖鐮孢HG-5 F. oxysporum HG-5；FC：黃色鐮孢S18 F. culmorum S18；SO：鞘腐霉L99 S. oryzae L99；FG：禾谷鐮孢L51 F. graminearum L51；RS：水稻紋枯病菌SDS-12 R. solani SDS-12

3.2 發(fā)酵條件對(duì)球毛殼菌固態(tài)發(fā)酵粗提物抗真菌活性的影響

在確定最優(yōu)培養(yǎng)基組成后，有必要進(jìn)行發(fā)酵條件的優(yōu)化。溫度能直接影響微生物源蛋白酶及纖維素酶活性，從而間接影響發(fā)酵效果[24]。前人報(bào)道球毛殼菌的最適生長(zhǎng)溫度為25 ℃，最高生長(zhǎng)溫度為39 ℃[25]。本研究?jī)?yōu)化所得的最優(yōu)溫度為26 ℃，與姜成[11]所優(yōu)化的產(chǎn)球毛殼菌素A的溫度25.45 ℃接近。培養(yǎng)基含水量是影響微生物活性的重要因素，也是固態(tài)發(fā)酵時(shí)必須要考量的發(fā)酵條件。Gao等[5]研究表明，75%的含水量是球毛殼菌產(chǎn)生甘草次酸3--單---葡萄糖醛酸的最優(yōu)含水量。而本研究發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)基的初始含水量為80%有利于球毛殼菌抗真菌物質(zhì)的產(chǎn)生。因?yàn)楹刻撸瑫?huì)使培養(yǎng)基空隙空間充滿水，空氣被排出，進(jìn)而形成缺氧環(huán)境[26]；而水分含量太低會(huì)限制養(yǎng)分的溶解度，阻礙微生物的發(fā)育[20]。發(fā)酵基質(zhì)的粒徑在固態(tài)發(fā)酵中有舉足輕重的地位，本研究結(jié)果表明，小麥秸稈的最優(yōu)粒徑為60—100目。雖然較小的秸稈顆粒可以為微生物附著提供較大的表面積，但也會(huì)導(dǎo)致秸稈顆粒團(tuán)聚，從而影響氧氣轉(zhuǎn)移，阻礙微生物的發(fā)育[20]。另外，大粒徑秸稈能使培養(yǎng)基通氣效率提高，但卻限制著微生物附著的表面積[27-28]。麥麩營(yíng)養(yǎng)成分豐富主要包括粗蛋白質(zhì)、淀粉、粗脂肪和粗纖維等[29]。本研究結(jié)果表明，球毛殼菌發(fā)酵粗提物的抗真菌活性與麥麩的添加量呈負(fù)相關(guān)，這與孫佳靜等的研究結(jié)果類似[30]，其原因可能在于麥麩纖維含量高[29]，過(guò)多添加會(huì)反而不利于球毛殼菌的正常生長(zhǎng)。此外，接種量對(duì)球毛殼菌固態(tài)發(fā)酵粗提物抗真菌活性的影響不顯著，這可能是因?yàn)殡S著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，各接種量最終都會(huì)到達(dá)基質(zhì)容量?jī)?nèi)的最大微生物量[24]。

后續(xù)可利用本研究建立的發(fā)酵工藝進(jìn)行大規(guī)模發(fā)酵，借助天然產(chǎn)物分離手段對(duì)球毛殼菌發(fā)酵產(chǎn)物進(jìn)行分離、純化，以明確抗真菌物質(zhì)的結(jié)構(gòu)與類型，并進(jìn)一步探討抗真菌物質(zhì)拮抗植物病原真菌的作用機(jī)制。此外，有研究表明，球毛殼菌ND35接種于麥粒上制成的菌肥能促進(jìn)楊樹(shù)、板栗和核桃幼苗的生長(zhǎng)[31-33]，球毛殼菌D38在麥麩和棉籽殼的混合物中發(fā)酵制得的菌肥可以極大地促進(jìn)丹參的生長(zhǎng)，并提高丹參的丹酚酸和丹參酮產(chǎn)量[34]，因此利用該發(fā)酵工藝或許可以制備出一種具有良好促生作用的球毛殼菌菌肥。

4 結(jié)論

利用球毛殼菌DX-THS3對(duì)秸稈進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵，其發(fā)酵粗提物有較好的抗植物病原真菌活性，進(jìn)而對(duì)其培養(yǎng)基組成及發(fā)酵條件進(jìn)行了一系列的優(yōu)化。培養(yǎng)基的最優(yōu)組成為小麥秸稈和麥麩，且在發(fā)酵時(shí)間為24 d、發(fā)酵溫度為26 ℃、培養(yǎng)基初始含水量為80%、小麥秸稈與麥麩質(zhì)量比為4﹕1、小麥秸稈粒徑為60—100目的發(fā)酵條件下，球毛殼菌發(fā)酵粗提物的抗真菌活性最高。研究結(jié)果可為球毛殼菌生物農(nóng)藥的開(kāi)發(fā)及秸稈綠色資源化利用提供參考。

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Optimization of solid state fermentation for production of active substances against plant pathogenic fungi from

LIAO HongJuan1, JIANG YuMei, YE Xia1, ZHANG ZhiBin1, MA TongYu1, ZHU Du

1College of Life Sciences, Jiangxi Normal University/Key Laboratory of Protection and Utilization of Subtropic Plant Resources of Jiangxi Province, Nanchang 330022;2College of Life Sciences, Jiangxi Science and Technology Normal University/Key Laboratory of Bioprocess Engineering of Jiangxi Province, Nanchang 330013

【Objective】The objective of this study is to optimize the medium composition and fermentation conditions of straw solid-state fermentation of, improve the antifungal activity of fermentation crude extract, and to provide references for the development of biopesticides ofand the green resource utilization of straw.【Method】Firstly, using the inhibition rate of crude extracts against the mycelia growth of 9 plant pathogenic fungi as evaluation index, straw (rice, wheat, maize, rape) and nitrogen source (bean pulp, wheat bran, ammonium chloride) in the medium were screened to determine the optimal composition of fermentation medium. Then the single factor optimization of fermentation conditions was carried out, and the inhibition rate of crude extracts againstwas taken as the evaluation index to determine the optimal range of each fermentation condition and the degree of influence on the antifungal activity of crude extracts. Based on the results of single factor optimization, orthogonal design was used to optimize the fermentation conditions. Parameters were as follows: fermentation time 18-36 d, fermentation temperature 26-32 ℃, initial water content of medium 70%-85%, mass ratio of straw to wheat bran 4﹕1-1﹕1, straw particle size 20-＞100 mesh. Finally, the optimal fermentation conditions for producing antifungal active substances by solid state fermentation of straw fromwere obtained and verified.【Result】When the composition of solid fermentation medium was screened, it was found that the antifungal effect of crude extracts obtained from the medium composed of wheat straw and wheat bran was generally better than that of other medium. In the single factor optimization of fermentation conditions, the inoculation amount of fungal solution had no significant effect on the antifungal effect of crude extract, so the subsequent orthogonal optimization was not carried out. In the orthogonal optimization, the effects of fermentation conditions on the antifungal activity of the crude extracts were extremely significant (＜0.001), and the effects were as follows: mass ratio of wheat straw to wheat bran＞fermentation time＞initial water content of medium＞fermentation temperature＞particle size of wheat straw. The optimal fermentation conditions obtained by orthogonal optimization were as follows: fermentation time 24 d, fermentation temperature 26 ℃, initial water content of medium 80%, mass ratio of wheat straw to wheat bran 4﹕1, particle size of wheat straw 60-100 mesh. After optimization of fermentation conditions, the inhibitory rates of 1 mg·mL-1crude extract from the fermentation ofagainst,,,,,,,andwere 100%, 92.86%, 85.94%, 83.90%, 76.12%, 73.02%, 66.18%, 58.96% and 52.99%, respectively.【Conclusion】After the optimization of fermentation medium composition and fermentation conditions, the crude extracts ofhad high antifungal activity, which could lay a foundation for the subsequent separation and purification of antifungal active substances produced by straw solid fermentation of

; straw; plant pathogenic fungi; solid state fermentation; antifungal activity

2023-02-27；

2023-04-11

國(guó)家自然科學(xué)基金（31760161）、江西省自然科學(xué)基金（20202BABL203048）、江西省教育廳項(xiàng)目（GJJ160314）

廖宏娟，E-mail：1774149530@qq.com。通信作者江玉梅，E-mail：leaf91626@163.com。通信作者朱篤，E-mail：zhudu12@163.com

10.3864/j.issn.0578-1752.2023.11.006

（責(zé)任編輯 岳梅）