冷藏條件下肉源莓實假單胞菌nuoB對其生物被膜形成和細(xì)胞代謝的影響

吳亞婕，譚松，陳愉平，牛阿娟，柳雨欣，王光宇，徐幸蓮，邱偉芬

冷藏條件下肉源莓實假單胞菌對其生物被膜形成和細(xì)胞代謝的影響

吳亞婕1，譚松1，陳愉平1，牛阿娟1，柳雨欣1，王光宇，徐幸蓮2，邱偉芬1

1南京財經(jīng)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院/江蘇省現(xiàn)代糧食流通與安全協(xié)同創(chuàng)新中心，南京 210023；2南京農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，南京 210095

【目的】研究對莓實假單胞菌生物被膜形成和細(xì)胞代謝的影響，進(jìn)一步揭示對莓實假單胞菌介導(dǎo)的冷鮮肉腐敗的調(diào)控機(jī)制，為優(yōu)化冷鮮肉保鮮體系提供理論基礎(chǔ)。【方法】以莓實假單胞菌NMC25野生株和突變株作為研究對象，利用共聚焦激光掃描顯微鏡（CLSM）觀察生物被膜空間結(jié)構(gòu)的差異；通過菌落細(xì)胞計數(shù)、胞外聚合物的表征解析生物被膜組分變化；基于超高效液相色譜聯(lián)合質(zhì)譜的非靶向代謝組學(xué)方法探尋與相關(guān)的代謝產(chǎn)物水平變化。【結(jié)果】CLSM顯示，原位條件下野生株生物被膜細(xì)胞呈現(xiàn)密集排列、垂直化定殖的狀態(tài)，而Δ生物被膜顯示為相對無序、松散的結(jié)構(gòu)。菌落中細(xì)胞計數(shù)結(jié)果顯示，不同生長環(huán)境下的野生型菌株和突變型菌株的生物被膜細(xì)胞數(shù)量均無顯著性差異，表明突變株在TSA或肉表面上以生物被膜形式生長的能力沒有發(fā)生大的變化。與野生株相比，原位培養(yǎng)時突變株的蛋白質(zhì)（＜0.01）和總糖（＜0.05）含量都顯著升高，表明影響了莓實假單胞菌胞外聚合物的分泌。代謝組結(jié)果顯示，野生組與突變組在正交偏最小二乘法判別分析模型中有明顯的分離（2X=0.481，2Y=0.977，Q2=0.909），說明原位培養(yǎng)時突變株的代謝產(chǎn)物發(fā)生了明顯變化。模型中組間差異顯著的代謝物包括2-羥基肉桂酸、L-酪氨酸、L-苯丙氨酸、DL-色氨酸、17-羥基-二十碳四烯酸、5-OxoETE等。這些代謝物經(jīng)過通路分析后發(fā)現(xiàn)，它們主要與脂肪酸的生物合成、不飽和脂肪酸的生物合成、核黃素代謝、2-氧代羧酸代謝、嘌呤代謝、氰基氨基酸代謝、苯丙氨酸代謝等有關(guān)。【結(jié)論】的破壞會導(dǎo)致莓實假單胞菌原位培養(yǎng)時生物被膜空間結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，促進(jìn)胞外聚合物的生物合成，影響細(xì)胞內(nèi)碳代謝、核苷酸代謝、脂質(zhì)代謝和氨基酸代謝。

莓實假單胞菌；；生物被膜；胞外聚合物；細(xì)胞代謝

0 引言

【研究意義】鮮肉中含有較高的水分活度以及豐富的營養(yǎng)物質(zhì)，極易發(fā)生腐敗變質(zhì)[1]，給食品產(chǎn)業(yè)及供應(yīng)鏈造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。除了非生物因素和內(nèi)源性自溶酶反應(yīng)，肉類的腐敗主要由含異質(zhì)細(xì)菌類群的復(fù)雜微生物動力學(xué)引起[2]，其中假單胞菌屬（spp.）作為重要的革蘭氏陰性菌，具有適應(yīng)低溫、分解蛋白和脂肪的能力[3]，是有氧儲藏條件下導(dǎo)致冷鮮肉腐敗變質(zhì)的優(yōu)勢菌屬[4]。在該屬中，莓實假單胞菌（）廣泛存在于有氧條件下的冷鮮雞肉[5]、牛肉[6-7]和水產(chǎn)品[8]等中，能夠在肉中快速生長，活躍地參與分解代謝，進(jìn)而導(dǎo)致肉品感官品質(zhì)的下降[9-10]。在前期研究中，筆者團(tuán)隊從腐敗的冷鮮雞肉中分離出了強(qiáng)致腐NMC25，并研究了該分離株的插入失活突變株在原位培養(yǎng)時致腐能力的變化，結(jié)果顯示突變株所引起的冷鮮雞肉腐敗特征減弱，表明在導(dǎo)致的腐敗進(jìn)程中起到重要作用[11]，但具體的作用機(jī)理尚不清楚。因此，深入了解如何在分子水平上調(diào)節(jié)細(xì)菌腐敗能力至關(guān)重要。【前人研究進(jìn)展】復(fù)合體I（complex I）是NADH的電子進(jìn)入大多數(shù)線粒體和許多細(xì)菌呼吸鏈的主要入口，在細(xì)胞能量代謝和維持細(xì)胞內(nèi)氧化還原平衡中起著重要作用。雖然它在真核生物線粒體呼吸鏈背景下的作用已被廣泛研究[12-13]，但對其在細(xì)菌中所起到的生理作用卻缺乏系統(tǒng)研究。在細(xì)菌門中，復(fù)合體I的共同作用是重新氧化NADH，從而維持細(xì)胞的氧化還原狀態(tài)。同時，細(xì)菌復(fù)合體I能夠作用于不同菌群的一系列生長條件和代謝過程[14]。編碼的NuoB亞基是組成復(fù)合體I的14個不同蛋白質(zhì)亞基之一[15]。在真核生物線粒體復(fù)合體I中，相應(yīng)基因的缺失通常會阻礙復(fù)合體的成熟[16]；而在細(xì)菌中，組裝NADH脫氫酶片段至少需要NuoB存在[17]。FLEMMING等[18]通過構(gòu)建缺少70%閱讀框的突變株和分析d-NADH氧化酶活性、d-NADH/鐵氰化物還原酶活性的變化，判斷出的缺失會阻止整個復(fù)合體I的組裝以及功能的正常發(fā)揮。SCHNEIDER等[19]利用插入打斷法破壞大腸桿菌的、等基因后，發(fā)現(xiàn)任何基因的失活都會導(dǎo)致膜中復(fù)合體I活性的喪失，阻止功能性復(fù)合體的產(chǎn)生或組裝。PRüSS等[20]研究發(fā)現(xiàn)在胰蛋白胨肉湯中培養(yǎng)時，大腸桿菌突變株細(xì)胞在生長后期生長緩慢，因為NADH dhⅠ缺乏的細(xì)胞會積累NADH，而且較大的NADH/NAD+比值會抑制檸檬酸合酶和蘋果酸脫氫酶的變構(gòu)作用，影響突變細(xì)胞對氨基酸的利用。這些發(fā)現(xiàn)表明可能會通過對復(fù)合體I功能的影響而改變細(xì)菌的生理代謝活動。【本研究切入點(diǎn)】雖然前期研究表明，的破壞導(dǎo)致了的部分生物學(xué)特性和原位致腐能力的改變，但冷鮮肉腐敗過程中該基因?qū)?xì)胞代謝活動的影響規(guī)律尚不明確，仍需在分子水平上進(jìn)行系統(tǒng)性研究。【擬解決的關(guān)鍵問題】以強(qiáng)致腐NMC25及其突變株為研究對象，分析對生物被膜空間結(jié)構(gòu)和基質(zhì)成分的影響，并基于超高效液相色譜聯(lián)合質(zhì)譜的非靶向代謝組學(xué)方法確定與破壞相關(guān)的代謝產(chǎn)物水平變化，以更好地闡明的對其生存和致腐效應(yīng)的影響，完善致腐機(jī)制的科學(xué)理論。

1 材料與方法

試驗于2021年在南京財經(jīng)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院國家重點(diǎn)實驗室和南京農(nóng)業(yè)大學(xué)國家肉品質(zhì)量安全控制工程技術(shù)研究中心進(jìn)行。

1.1 材料與試劑

從腐敗的冷鮮雞肉中分離到的NMC25菌株以及構(gòu)建的Δ插入失活突變株由筆者研究團(tuán)隊收集保存[21]。胰蛋白胨大豆瓊脂（TSA）、胰蛋白胨大豆肉湯（TSB）購自青島海博生物技術(shù)有限公司；硝酸纖維素膜購自上海興亞凈化材料廠；BCA蛋白定量試劑盒購自南京諾唯贊生物科技股份有限公司；LIVE/DEAD? BacLight? Bacterial Viability Kit購自美國 Invitrogen公司；冷鮮雞大胸購自南京市蘇果超市。

1.2 儀器與設(shè)備

GI54DP高壓滅菌鍋（致微，廈門）；SW-CJ-2FD超凈工作臺（AIRTECH，蘇州）；SHP-350生化培養(yǎng)箱（精宏，中國）；TCS SP8 X激光掃描共聚焦顯微鏡（Leica，德國）；SpectraMax M5多功能酶標(biāo)儀（Molecular Devices，美國）；Vanquish UHPLC system，Orbitrap Q Exactive TM HF-X mass spectrometer超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（Thermo Fisher，德國）。

1.3 方法

1.3.1 生物被膜形成及樣品制備生物被膜的形成與樣品制備參照FENG等[22]的方法并稍作修改，具體步驟如下：將NMC25與Δ突變株接種于TSB中，28 ℃、150 r/min過夜培養(yǎng)至穩(wěn)定期。取上述穩(wěn)定期菌液稀釋，調(diào)整菌液濃度約為5 log CFU/mL。將0.22 μm硝酸纖維素膜分別放置在已輻照滅菌的10 g雞胸肉切片和TSA平板上，表面接種100 μL制備好的菌液，于8 ℃下培養(yǎng)4 d。對放置于TSA平板上的硝酸纖維素膜，每24 h無菌轉(zhuǎn)移至新的瓊脂平板上。

1.3.2 菌落中細(xì)胞總數(shù)的測定 上述樣品培養(yǎng)4 d后，使用一次性塑料接種環(huán)收集在膜上形成的生物被膜，并轉(zhuǎn)移到含有1 mL 0.9%生理鹽水的無菌試管中用于計數(shù)。稱量增重后，劇烈渦旋1 min。吸取100 μL渦旋后的上清液進(jìn)行10倍梯度稀釋，選取合適的梯度用一次性涂布棒將100 μL菌液涂布于TSA平板上，28 ℃下培養(yǎng)24 h后計數(shù)，每組重復(fù)4次。

1.3.3 共聚焦激光掃描顯微鏡（CLSM）觀察 參考PANG等[23]的方法通過CLSM觀察原位培養(yǎng)時生物被膜的空間結(jié)構(gòu)。在室溫避光條件下，將3 μL來自LIVE/DEAD? BacLight? Bacterial Viability Kit的SYTO 9熒光染色劑和PI熒光染色劑（1﹕1）混合物加入到1 mL的無菌生理鹽水中并混合均勻。然后，將帶有已形成生物被膜的硝酸纖維素膜從無菌雞胸肉切片或瓊脂平板轉(zhuǎn)移到無菌培養(yǎng)皿中，并將100 μL的上述染液沉積在試樣上，室溫下避光培養(yǎng)30 min。生理鹽水洗滌3次以去除多余染料后，將試樣斑點(diǎn)面朝下放置在玻璃底皿（20 mm/35 mm）中觀察。使用倒置的CLSM觀察圖像，用10倍物鏡掃描表面總面積，選出3個有代表性的區(qū)域。然后使用63×油浸物鏡，以600 Hz掃描獲得圖像。在498—567 nm范圍內(nèi)收集SYTO9的綠色熒光信號，在567—689 nm范圍內(nèi)收集PI的紅色熒光信號。使用萊卡共聚焦軟件分析生物被膜圖像。

1.3.4 胞外聚合物（EPS）的提取與分析 將如上所述得到的生物被膜重懸于含有0.9%生理鹽水的離心管中，調(diào)整菌懸液濃度約為3 mg菌體濕重/mL，渦旋混勻。將菌懸液12 000×離心10 min，得到上清液，用0.22 μm孔徑的濾器過濾滅菌，過濾后用于檢測胞外聚合物的含量。

參照BCA蛋白質(zhì)分析試劑盒說明書分析提取的胞外聚合物蛋白質(zhì)濃度。使用苯酚硫酸法[24]測定碳水化合物含量，具體如下：準(zhǔn)確稱取104 ℃烘干的葡萄糖10 mg于100 mL容量瓶中，加水至刻度處，混勻。分別吸取0、0.2、0.4、0.6、0.8和1.0 mL的葡萄糖溶液，各加蒸餾水補(bǔ)至2.0 mL，然后加入1 mL 6%苯酚及5 mL濃硫酸，搖勻冷卻，室溫放置20 min后在96孔細(xì)胞培養(yǎng)板于490 nm波長下測吸光度。其中，用2.0 mL蒸餾水代替葡萄糖溶液，按照同樣的顯色操作作為空白，橫坐標(biāo)為總糖（μg），縱坐標(biāo)為吸光度值，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線。隨后進(jìn)行樣品含量測定，吸取2.0 mL胞外聚合物樣品，然后加入6%苯酚1.0 mL及濃硫酸5.0 mL，搖勻冷卻，室溫放置20 min，最后將培養(yǎng)板置于酶標(biāo)儀中，在490 nm測定吸光度。使用上述標(biāo)準(zhǔn)曲線計算總糖含量。在測定蛋白質(zhì)和總糖含量時，每個處理設(shè)置4個重復(fù)。

1.3.5 代謝組學(xué)樣本的制備 按照1.3.1制備原位培養(yǎng)樣品并使用一次性塑料接種環(huán)收集菌體到1 mL 0.9%生理鹽水中混勻。將細(xì)胞懸浮液低溫離心10 min（12 000×，4 ℃）后收集沉淀用于代謝組學(xué)分析。通過渦旋將預(yù)冷的80%甲醇和0.1%甲酸與EP管中的細(xì)胞顆粒混合。將混合物放入液氮中速凍5 min，冰上融化后渦旋30 s，超聲6 min。然后將樣本放入4 ℃離心機(jī)中，5 000 r/min離心1 min，取上清液到新離心管，凍干成粉末，并溶解于10%甲醇溶液中，隨后用于UHPLC-MS/MS系統(tǒng)分析。為了監(jiān)測數(shù)據(jù)的穩(wěn)定性和可靠性，從每個試驗樣本中取等體積樣本混勻作為質(zhì)量控制（QC）樣本。每組試驗設(shè)置6個重復(fù)。

1.3.6 UHPLC-MS/MS分析 色譜條件：Hypesil Gold（C18）色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.9 μm）；柱溫40 ℃；流速0.2 mL?min-1；在正電離模式下，0.1%甲酸和甲醇作為流動相A和B，而在負(fù)電離模式下，5 mmol?L-1醋酸銨（pH 9.0）和甲醇作為流動相A或B；流動相梯度洗脫程序見表1。

質(zhì)譜條件：質(zhì)譜掃描范圍，質(zhì)荷比（m/z）為100— 1 500；電噴霧電壓3.2 kV；鞘氣流速40 arb；輔助氣流速10 arb；毛細(xì)管溫度保持在320 ℃。

表1 流動相梯度洗脫程序

1.3.7 數(shù)據(jù)處理 使用Compound Discoverer 3.1軟件（Thermo Fisher）對UHPLC-MS/MS導(dǎo)出的數(shù)據(jù)進(jìn)行提取和預(yù)處理，然后通過分子離子峰和碎片離子預(yù)測分子式并與mzCloud（https://www.mzcloud.org/）、mzVault和Masslist數(shù)據(jù)庫比對，獲得準(zhǔn)確的定性和相對的定量結(jié)果；利用統(tǒng)計軟件R 3.4.3、Python 2.7.6和CentOS 6.6對所得數(shù)據(jù)進(jìn)行多元統(tǒng)計學(xué)分析，根據(jù)正交偏最小二乘法判別分析（OPLS-DA）模型中的變量投影重要性（VIP）和值篩選出差異代謝物。最后，將差異代謝物通過KEGG數(shù)據(jù)庫（https://www. kegg.jp/）比對并注釋。

2 結(jié)果

2.1 nuoB對P. fragi生物被膜空間結(jié)構(gòu)的影響

為了探究對的固氣界面生物被膜形成的影響，對NMC25及突變菌株的大菌落生物被膜進(jìn)行觀察（圖1）。在TSA培養(yǎng)2 d后，可以明顯看出所有菌株都形成了比較完整的薄層生物被膜，并且隨著培養(yǎng)時間的推移，細(xì)菌細(xì)胞逐漸向上擴(kuò)散，生物被膜厚度增加。其中，經(jīng)每24 h無菌轉(zhuǎn)移的各基因型菌株生物被膜的菌落中心厚度都明顯高于相對應(yīng)的不進(jìn)行轉(zhuǎn)移的對照組。在不同生長基質(zhì)上，野生型菌株與Δ菌株形成的生物被膜的厚度在視覺上幾乎一致。另一方面，與TSA上培養(yǎng)的生物被膜相比，原位培養(yǎng)形成的NMC25和Δ生物被膜的厚度下降，表面粗糙度升高，并且菌落邊緣明顯高于中心。

對照：TSA培養(yǎng)時不進(jìn)行轉(zhuǎn)移的生物被膜被視為對照；A：P. fragi NMC25生物被膜；B：ΔnuoB生物被膜

在此基礎(chǔ)上，利用CLSM進(jìn)一步探明在不同培養(yǎng)基上生長的NMC25和Δ生物被膜細(xì)胞分布和存活情況，以評估生物被膜空間結(jié)構(gòu)的變化（圖2）。結(jié)果顯示，與TSA培養(yǎng)相比，原位培養(yǎng)的所有菌株生物被膜的厚度都明顯減少，這與上述肉眼觀察結(jié)果一致。在不同生長環(huán)境下，NMC25生物被膜的厚度均略高于突變株。在TSA上培養(yǎng)時，野生株和突變株都形成了嚴(yán)密有序的生物被膜，大多數(shù)細(xì)菌細(xì)胞在垂直于硝酸纖維素膜表面的方向上排列；而原位培養(yǎng)時，Δ生物被膜顯示出相對雜亂的松散結(jié)構(gòu)，細(xì)胞在菌落中無序分布。

2.2 nuoB對P. fragi生物被膜的生物量及胞外聚合物成分的影響

在8 ℃培養(yǎng)4 d后，兩組雞胸肉切片或TSA上的細(xì)胞總數(shù)均在9 log CFU/colony以上；不同生長基質(zhì)上，野生株和Δ突變株的生物被膜細(xì)胞數(shù)量均無顯著差異，說明突變株在TSA或雞肉上的生物被膜細(xì)胞的數(shù)量沒有發(fā)生較大變化。如表2所示，肉樣上突變株的蛋白質(zhì)（＜0.01）和總糖（＜0.05）含量都顯著高于野生株；對于TSA上的胞外聚合物，Δ生物被膜中蛋白質(zhì)的分泌量顯著增加（＜0.01），蛋白質(zhì)與糖含量比例顯著高于野生組（＜0.01），而兩組的總糖含量無顯著差異，說明在體外或原位培養(yǎng)時突變株生物被膜基質(zhì)的分泌都會受到的影響。此外，所有菌株于原位培養(yǎng)時的蛋白質(zhì)含量均高于碳水化合物含量，而在TSA培養(yǎng)時則情況相反。

綠色細(xì)胞代表活細(xì)胞，紅色細(xì)胞代表死細(xì)胞。A：原位培養(yǎng)時，NMC25的生物被膜空間結(jié)構(gòu)；B：原位培養(yǎng)時，ΔnuoB的生物被膜空間結(jié)構(gòu)；C：TSA上培養(yǎng)時，NMC25的生物被膜空間結(jié)構(gòu)；D：TSA上培養(yǎng)時，ΔnuoB的生物被膜空間結(jié)構(gòu)

表2 不同生長環(huán)境下兩株P(guān). fragi生物被膜的細(xì)胞計數(shù)和胞外聚合物分析結(jié)果

原位培養(yǎng)或TSA培養(yǎng)中同一列數(shù)據(jù)表示野生組和突變組的差異顯著（*：＜0.05；**：＜0.01）

Within the same culture condition (or TSA cultivation), the asterisk indicates significant differences between the NMC25 group and Δgroup (*:＜0.05; **:＜0.01)

2.3 nuoB對P. fragi細(xì)胞代謝的影響

圖3顯示，兩組分別位于第一主成分（t1）軸垂直線的兩側(cè)，有明顯的分離（2X=0.481，2Y=0.977，2=0.909），說明原位培養(yǎng)時Δ突變株的代謝產(chǎn)物發(fā)生了明顯改變。得分圖提供了不同組間的分組信息，而載荷圖有助于找出對比較組間代謝物模式變化貢獻(xiàn)最大的代謝物。如圖3-B所示，對組間差異貢獻(xiàn)較大的代謝產(chǎn)物包括17-羥基-二十碳四烯酸（17(S)-HETE）、5-酮咯-6E,8Z,11Z,14Z-丁烯酸（5-OxoETE）、肌酸（Creatine）、亞精胺（Spermidine）、D-(+)-高脯氨酸（D-(+)-Pipecolinic acid）、L-賴氨酸和丁酸（1﹕1）的復(fù)合物（Lysine Butyrate）、2-羥基肉桂酸（2-Hydroxycinnamic acid）、L-苯丙氨酸（L-Phenylalanine）、L-酪氨酸（L-Tyrosine）等。OPLS-DA模型置換檢驗的結(jié)果見圖3-C，2回歸直線的y軸上截距值為負(fù)數(shù)，表明OPLS-DA模型在本研究中未過度擬合，適用且可靠。

圖3 基于P. fragi野生組和突變組間的OPLS-DA得分圖（A）、載荷圖（B）和置換檢驗圖（C）

為了進(jìn)一步篩選與突變相關(guān)的關(guān)鍵代謝物，計算OPLS-DA模型中變量投影的重要性。基于代謝物的相關(guān)系數(shù)、VIP、差異倍數(shù)（FC）和值生成的火山圖（圖4-A），其中VIP＞1，檢驗＜0.05的代謝物被認(rèn)為具有統(tǒng)計學(xué)意義。在原位培養(yǎng)的Δ突變菌株中，比較分析發(fā)現(xiàn)有29種代謝物顯著上調(diào)，22種代謝物顯著下調(diào)。與野生組相比，Δ組的2-羥基肉桂酸、L-酪氨酸、L-苯丙氨酸、DL-色氨酸等明顯增加，而17-羥基-二十碳四烯酸、5-酮咯-6E,8Z,11Z,14Z-丁烯酸、油酸酰胺、3-甲基組氨酸等代謝產(chǎn)物則呈現(xiàn)相反的趨勢（圖4-B）。

圖4 基于P.fragi野生株和nuoB突變株代謝產(chǎn)物的火山圖（A）和排名前15位重要特征代謝物的VIP分?jǐn)?shù)圖（B）

根據(jù)所鑒定出的顯著差異代謝物進(jìn)行路徑分析，以確定與相關(guān)的代謝活動（圖5）。總共涉及43條通路，其中2條途徑具有顯著意義（＜0.05），即脂肪酸的生物合成和不飽和脂肪酸的生物合成。此外，的破壞主要影響的通路還有核黃素代謝、2-氧代羧酸代謝、嘌呤代謝、氨酰tRNA生物合成和一些氨基酸代謝，包括氰基氨基酸代謝，苯丙氨酸代謝，苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸的生物合成，組氨酸代謝等。圖6概述了的破壞導(dǎo)致NMC25主要代謝途徑代謝產(chǎn)物的變化。

圖5 野生組/突變組前20位代謝通路氣泡圖

3 討論

目前，與肉品腐敗相關(guān)的研究多注重于關(guān)聯(lián)微生物種類、數(shù)量和腐敗特征[25-26]，而冷鮮肉中的特征優(yōu)勢腐敗菌與致腐相關(guān)基因的調(diào)控關(guān)系在很大程度上仍然未知，這限制了對肉源假單胞菌致腐能力相關(guān)調(diào)節(jié)因子的理解。NuoB是細(xì)菌能量生產(chǎn)過程中至關(guān)重要的復(fù)合體I的重要組成部分，它所對應(yīng)基因的缺失會導(dǎo)致NADH脫氫酶活性的喪失，細(xì)菌生長策略可能因此發(fā)生改變，失活的NADH脫氫酶將重新調(diào)配代謝通量以維持細(xì)胞內(nèi)NADH/NAD+池的氧化還原平衡[27]。

3.1 nuoB影響P. fragi生物被膜的空間結(jié)構(gòu)

生物被膜是微生物群落一種常見的存在形式，它的形成是食品污染的常見來源。在肉品工業(yè)常使用的冷藏溫度范圍內(nèi)，能于原位條件下形成生物被膜，為低溫逆境中的生存與競爭提供支持[28]。本研究中，使用硝酸纖維素膜作為固氣界面生物被膜形成的基質(zhì)，以便觀察肉上生物被膜的完整結(jié)構(gòu)。肉眼觀察顯示原位形成的生物被膜生長邊緣高于菌落中心處的表面。研究發(fā)現(xiàn)，生物被膜中的細(xì)胞分裂通常發(fā)生在菌落的邊緣，到達(dá)邊緣的細(xì)菌可以優(yōu)先獲得營養(yǎng)和空間[29-30]，這可能是細(xì)菌細(xì)胞聚集在生物被膜邊緣的原因。另外，肉片上NMC25和Δ生物被膜的厚度明顯低于TSA上對應(yīng)的生物被膜厚度，而粗糙度則呈相反趨勢。這種變化可能與基質(zhì)的營養(yǎng)成分和細(xì)菌對環(huán)境適應(yīng)性的不同有關(guān)。同時，有研究表明生物被膜的物理特性，如表面粗糙度等，在細(xì)菌生物被膜對各種應(yīng)激條件的響應(yīng)中起重要作用[31-32]。生物被膜表面越光滑，受機(jī)械剪切力的影響就越小[22]。CLSM能夠在不影響微生物組成的情況下可視化生物結(jié)構(gòu)[33]，因此，本研究利用CLSM觀察到了野生株與突變株的生物被膜空間結(jié)構(gòu)。結(jié)果顯示，野生株形成了嚴(yán)密有序、排列均勻的空間結(jié)構(gòu)，這與WICKRAMASINGHE等[34]的研究結(jié)果一致。其中，細(xì)菌細(xì)胞垂直化的現(xiàn)象可能是由于細(xì)胞快速生長產(chǎn)生的有效表面壓力超過了細(xì)胞與表面的粘附。微生物控制生物被膜抵抗外來物種入侵的一個關(guān)鍵性因素是它的緊致性[35-36]。因此，試驗中發(fā)現(xiàn)的野生株生物被膜的空間結(jié)構(gòu)將有助于阻止其他微生物入侵，這可能是它在有氧儲存肉品中長期占據(jù)優(yōu)勢地位的原因之一。此外，研究發(fā)現(xiàn)原位培養(yǎng)時突變株的排列與野生株相比相對雜亂、疏松，表明的破壞影響了肉源的生物被膜空間結(jié)構(gòu)。細(xì)菌運(yùn)動在生物被膜形成過程中必不可少[37]。操縱子此前已被證明在生物被膜形成過程中被激活，對調(diào)節(jié)生物被膜的形成和運(yùn)動至關(guān)重要[38]。研究發(fā)現(xiàn)，中的經(jīng)插入打斷后，菌株的swimming泳動能力明顯下降[11]，這可能是Δ生物被膜空間結(jié)構(gòu)雜亂無序的原因之一。

標(biāo)記代謝物的顏色代表與野生組相比，其在ΔnuoB組中的濃度高低（VIP＞1，P＜0.05），綠色表示較低水平，紅色表示較高水平。代謝物旁向上和向下的箭頭則分別表示除差異代謝物外的增加和減少（|lg2FC|＞0.58或VIP＞1）。黑色無箭頭的代謝物在野生組和突變組中的含量無顯著差異，未檢測到的代謝物用斜體表示

3.2 nuoB影響P. fragi胞外聚合物的分泌

生物被膜代表了一種相當(dāng)復(fù)雜的多細(xì)胞細(xì)菌系統(tǒng)，其特征是具有較高的細(xì)胞數(shù)量與密度以及產(chǎn)生細(xì)胞外聚合物質(zhì)基質(zhì)[39-40]。本研究中，不同生長環(huán)境下的野生株與突變株的生物被膜細(xì)胞數(shù)量均無顯著差異，細(xì)菌總數(shù)都超過了9 log CFU/colony，表明8 ℃培養(yǎng)4 d后的野生株與突變株都已形成了成熟的生物被膜。這種現(xiàn)象可能是突變株充分利用肉中豐富的營養(yǎng)物質(zhì)與調(diào)節(jié)能量代謝的結(jié)果。細(xì)菌的細(xì)胞外聚合物主要包括胞外多糖、蛋白質(zhì)、脂類和eDNA，其中的每個成分都對維持生物被膜的結(jié)構(gòu)和穩(wěn)定性做出了巨大貢獻(xiàn)[41]。在假單胞菌中，EPS中大量的胞外多糖和蛋白質(zhì)與高生物量和強(qiáng)粘附性相關(guān)[42]。本研究發(fā)現(xiàn)，原位培養(yǎng)時野生株產(chǎn)生的胞外聚合物含量顯著低于突變株，因此，推測的破壞可能導(dǎo)致加強(qiáng)對肉表面的粘附，通過水解酶的滲透獲取肉中豐富的營養(yǎng)。此外，野生株中低水平的胞外基質(zhì)可能會促進(jìn)染色劑的進(jìn)入，導(dǎo)致在CLSM觀察時野生株的生物被膜厚度增加。研究表明，除了微生物的存在外，環(huán)境條件也顯著影響胞外聚合物的產(chǎn)生[43]。試驗中發(fā)現(xiàn)體外培養(yǎng)時野生株與突變株的總糖含量無顯著差異，且均高于對應(yīng)的蛋白質(zhì)含量，這與原位培養(yǎng)時的趨勢相反。這種現(xiàn)象的產(chǎn)生可能與各培養(yǎng)基質(zhì)提供的營養(yǎng)成分不同有關(guān)。

3.3 nuoB影響P. fragi的細(xì)胞代謝

代謝組學(xué)是一種能夠揭示分子調(diào)控機(jī)制下大量代謝產(chǎn)物變化的系統(tǒng)方法，提供了對細(xì)胞生理信息的全面理解[44]。近年來，與基因突變相關(guān)的代謝組學(xué)研究成功揭示了這些基因在細(xì)菌中的相關(guān)作用[45-46]。本研究通過分析不同表達(dá)的代謝物發(fā)現(xiàn)，它們主要涉及了碳代謝、核苷酸代謝、脂質(zhì)代謝、氨基酸代謝4種途徑。SPERO等[14]研究表明細(xì)菌中的復(fù)合體I對TCA循環(huán)產(chǎn)生的NADH在氧化過程可能有廣泛的作用，并預(yù)測缺乏復(fù)合體I的細(xì)菌可能會使用改良版TCA循環(huán)為細(xì)胞提供重要的生物合成前體，同時產(chǎn)生較少的還原劑或使用其他類型的還原劑。本研究發(fā)現(xiàn)，在Δ組中檢測到的蘋果酸、檸檬酸、琥珀酸以及NADH的濃度沒有發(fā)生顯著性變化，而NAD+含量顯著性增加，因此，推測突變株可能使用其他酶或策略來保持細(xì)胞氧化還原狀態(tài)。此外，突變株中的磷酸烯醇式丙酮酸、1,6-二磷酸果糖和6-磷酸葡萄糖的含量均高于野生株，表明突變株中的糖酵解代謝可能更活躍。在枯草芽孢桿菌中，半乳糖代謝在生物被膜的形成中起著至關(guān)重要的作用，因為二磷酸尿苷半乳糖可用于EPS的合成[47]。但本研究中二磷酸尿苷半乳糖在突變組中的含量升高，這可能是原位培養(yǎng)時突變株EPS含量顯著高于野生株的原因之一。

嘌呤和嘧啶不僅是核酸的含氮堿基，而且在ATP、GTP、環(huán)單磷酸腺苷、NADH和輔酶A中也能作為能量載體分子發(fā)揮作用[48]。本研究中，突變株中大部分核苷酸及其衍生物的含量增加，包括腺嘌呤、次黃嘌呤、黃嘌呤、尿嘧啶、UMP、dAMP和IMP等。這可能是由于核苷酸代謝增強(qiáng)，導(dǎo)致合成DNA和RNA的能力升高。脂質(zhì)不僅參與生化反應(yīng)和信號通路，而且其組成的動態(tài)變化和空間分布也影響著細(xì)胞生物功能。本研究發(fā)現(xiàn)，突變組中的棕櫚酸、硬脂酸、5-OxoETE、9-KODE等不飽和脂肪酸含量顯著減少，LPE18:1和LPE18:4等磷脂的水平也下降，但作為飽和脂肪酸的癸酸含量增加。研究表明，細(xì)菌中膜流動性在調(diào)節(jié)物質(zhì)跨膜運(yùn)輸和維持細(xì)胞生理活性方面起至關(guān)重要的作用[49]，而它的維持在很大程度上取決于膜脂肪酸的組成，包括直鏈不飽和脂肪酸、飽和脂肪酸和支鏈脂肪酸[50]。同時，磷脂中脂肪酸鏈的長度和飽和度也會影響細(xì)胞膜的流動性[51]。因此，本研究推測Δ中細(xì)胞膜的流動性可能發(fā)生下降。此外，甜菜堿和膽堿在維持細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能方面也發(fā)揮著重要作用[52]。本研究中，突變株內(nèi)的甜菜堿和膽堿水平上升，說明Δ細(xì)胞可能需要它們的支持來修復(fù)細(xì)胞損傷，維持細(xì)胞膜的完整性。

氨基酸是蛋白質(zhì)的主要組成部分，在調(diào)節(jié)機(jī)體能量和蛋白質(zhì)代謝以及抗應(yīng)激方面發(fā)揮著十分重要的作用[53]。在本研究中，突變組內(nèi)的鵝肌肽含量顯著上調(diào)，表明突變株可能加強(qiáng)了對雞肉中鵝肌肽的利用。芳香族氨基酸作為一些抗氧化劑的生物合成前體，在環(huán)境脅迫下，它的增加能夠為細(xì)胞提供一些滲透保護(hù)功能。本研究發(fā)現(xiàn)，與野生株相比，Δ菌株中苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸含量顯著增加，說明突變株可能通過調(diào)節(jié)芳香族氨基酸代謝來維持細(xì)胞內(nèi)氧化還原平衡，增加對環(huán)境脅迫的抗力。此外，酪氨酸是合成酪醇的前體物質(zhì)，還在細(xì)胞信息傳遞中發(fā)揮重要作用。有研究表明，在酵母細(xì)胞中酪醇能夠促進(jìn)細(xì)胞生長，增強(qiáng)菌株毒力[54]。因此，根據(jù)本研究中酪氨酸的顯著上調(diào)推測其可能影響了酪醇的生物合成，進(jìn)而有助于突變株的生長。在地衣芽孢桿菌[55]和枯草芽孢桿菌[56]中，谷氨酸作為聚-谷氨酸的重要前體，也被發(fā)現(xiàn)為生物被膜基質(zhì)生產(chǎn)的必要氨基酸。本研究中，突變組內(nèi)谷氨酸的濃度上升，可能與Δ生物被膜基質(zhì)中胞外聚合物含量的增多有關(guān)。同時，有研究表明在單增李斯特菌中，氨基酸的生物合成與細(xì)菌的能量轉(zhuǎn)導(dǎo)和代謝有關(guān)，因為谷氨酸等氨基酸能夠通過底物水平磷酸化提供ATP[57]。因此，試驗中發(fā)現(xiàn)谷氨酸含量的升高可能表明Δ菌株能通過底物水平磷酸化調(diào)節(jié)細(xì)菌能量代謝，維持自身的生命活動。鳥氨酸不僅是多胺等細(xì)胞增殖關(guān)鍵物質(zhì)的重要原料，而且在尿素循環(huán)等代謝活動中發(fā)揮著重要作用[58]。另外，鳥氨酸還可以合成脯氨酸。本研究發(fā)現(xiàn)，突變株中鳥氨酸、精氨酸琥珀酸酯、脯氨酸、精胺和亞精胺含量增多，而突變組與野生組內(nèi)精氨酸含量無顯著差異，這表明的破壞促進(jìn)了中多胺的生成和脯氨酸的積累，并且影響了菌體內(nèi)部尿素循環(huán)的速率。而且脯氨酸具有保護(hù)細(xì)胞結(jié)構(gòu)，參與生物體氧化應(yīng)激反應(yīng)等生理功能[59]。

4 結(jié)論

經(jīng)插入打斷后，原位培養(yǎng)時的生物被膜空間結(jié)構(gòu)產(chǎn)生較大變化，基質(zhì)內(nèi)蛋白質(zhì)和總糖含量顯著增加，細(xì)胞代謝中的碳代謝、核苷酸代謝、脂質(zhì)代謝、氨基酸代謝發(fā)生改變，表明在的生物被膜形成過程和細(xì)胞的各個代謝活動中發(fā)揮著重要作用。

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Effects ofon the Biofilm Formation and Cellular Metabolism of Meat-BorneDuring Chilled Storage

WU YaJie1, TAN Song1, CHEN YuPing1, NIU AJuan1, LIU YuXin1, WANG GuangYu, XU XingLian2, QIU WeiFen1

1College of Food Science and Engineering/Collaborative Innovation Center for Modern Grain Circulation and Safety, Nanjing University of Finance and Economics, Nanjing 210023;2College of Food Science and Technology, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095

【Objective】This paper focused on the impacts ofon the biofilm formation and cell metabolism in(), so as to further reveal the regulatory mechanism ofin the spoilage of chilled meat contaminated withand to provide a theoretical basis for developing effective preservation system of chilled meat. 【Method】NMC25 and its-mutant strain were used in the present study, and the differences in the spatial structure of biofilms were observed by confocal laser scanning microscopy (CLSM). The changes in biofilm composition were tested by the cell enumeration and the analysis of the extracellular polymeric substances. In addition, theultra-high performance liquid chromatography coupled with mass spectrometry (UHPLC-MS/MS) was employed to investigate the alterations of-related metabolite abundance. 【Result】CLSM images showed that cells in the biofilms of wild-type strains cultivatedwas highly dense, nematic ordering, whereas Δdisplayed relatively disorganized and sparse arrangement. Additionally, cell enumeration revealed insignificant differences between the wild-type and mutant biofilms regardless of the difference of culture medium. The result indicated thatthe mutants did not change significantly in their ability to grow as biofilm on the surface of TSA or meat sample.For extracellular polymeric substances from biofilms, the protein and carbohydrate contents of Δwere significantly higher (＜0.01,＜0.05, respectively) than those of wild-type strains,indicating thataffected the secretion of extracellular polymers by.The metabolomics results revealed a clear separation between the wild and mutant groups in an orthogonal partial least squares discriminant analysis model (2X=0.481,2Y=0.977, Q2=0.909), which suggested that the metabolites of the mutants had changed markedly. In the model, differentially expressed metabolites were screened, including 2-hydroxycinnamic acid, L-tyrosine, L-phenylalanine, DL-tryptophan, 17(S)-HETE, and 5-OxoETE. Pathway mapping analysis was conducted based on the chosen candidates. In total, the major metabolic pathways included fatty acid biosynthesis, unsaturated fatty acid biosynthesis, riboflavin metabolism, 2-oxocarboxylic acid metabolism, purine metabolism, cyanogenic amino acid metabolism, and phenylalanine metabolism. 【Conclusion】The disruption ofstimulated significant variations in the spatial structure of thebiofilm grown, promoting the biosynthesis of extracellular polymeric substances and affecting intracellular metabolic pathways, such as carbon, nucleotide, lipid, and amino acid metabolism.

;; biofilm; extracellular polymeric substances; cell metabolism

2022-10-25；

2022-12-21

國家自然科學(xué)基金（31901759）、江蘇高校優(yōu)勢學(xué)科建設(shè)工程資助項目（PAPD）

吳亞婕，E-mail：W1270316335@163.com。通信作者王光宇，E-mail：gywang@nufe.edu.cn

10.3864/j.issn.0578-1752.2023.11.011

（責(zé)任編輯 趙伶俐）