Pladienolide B對牛胚胎干細(xì)胞多能性相關(guān)基因表達(dá)及細(xì)胞活力的影響

趙芳，丁強(qiáng)，夏淑雯，高運(yùn)東，蘭國成，林志平，王慧利，仲躋峰

Pladienolide B對牛胚胎干細(xì)胞多能性相關(guān)基因表達(dá)及細(xì)胞活力的影響

趙芳1，丁強(qiáng)1，夏淑雯1，高運(yùn)東2，蘭國成3，林志平4，王慧利，仲躋峰

1江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧研究所/江蘇省畜禽精準(zhǔn)育種工程研究中心/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部種養(yǎng)結(jié)合重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南京 210014；2山東奧克斯畜牧種業(yè)有限公司，濟(jì)南 250100；3香港大學(xué)李嘉誠醫(yī)學(xué)院，香港 999077；4江蘇優(yōu)源奶業(yè)產(chǎn)業(yè)研究院有限公司，南京 211100

【背景】牛胚胎干細(xì)胞（bovine embryonic stem cells，BESCs）因具備較高的多能性，在牛品種保存、品種選育及研究家畜胚胎發(fā)育調(diào)控機(jī)制方面具有重要的應(yīng)用價(jià)值。然而，BESCs多能性維持及分化調(diào)控的研究相對缺乏，很多機(jī)制仍不清楚。【目的】探究不同濃度Pladienolide B（PlaB）對BESCs多能標(biāo)記基因、全能標(biāo)記基因、胚胎細(xì)胞譜系基因表達(dá)及細(xì)胞活力的影響，為提高BESCs多能性提供參考和理論依據(jù)。【方法】利用免疫熒光檢測牛BESCs多能標(biāo)記基因的表達(dá)，利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（real-time fluorescence quantitative PCR，RT-qPCR）檢測不同濃度PlaB對BESCs剪接體、全能標(biāo)記基因及胚胎細(xì)胞譜系基因表達(dá)的影響，利用RT-qPCR和Western Blot分別檢測不同濃度PlaB對BESCs多能標(biāo)記基因mRNA和蛋白表達(dá)的影響，利用CCK8和EDU染色檢測不同濃度PlaB對BESCs增殖的影響。【結(jié)果】RT-qPCR 結(jié)果顯示，PlaB濃度為0.5—1.5 nmol·L-1時(shí)顯著下調(diào)EPSCM-BESCs中和的mRNA表達(dá)水平；PlaB濃度為1.5 nmol·L-1時(shí)，CTFR-BESCs中和的mRNA表達(dá)下降；PlaB濃度范圍為0.5—1.5 nmol·L-1時(shí)，CTFR-BESCs和EPSCM-BESCs的和的mRNA表達(dá)水平呈劑量依賴性增加。此外，PlaB顯著下調(diào)CTFR-BESCs中的mRNA表達(dá)。PlaB濃度為0.5—1.5 nmol·L-1時(shí)，EPSCM-BESCs和CTFR-BESCs中剪接體的mRNA表達(dá)顯著下調(diào)。PlaB濃度為0.5—1.5 nmol·L-1時(shí)，顯著下調(diào)CTFR-BESCs的mRNA表達(dá)水平；PlaB濃度為1—1.5 nmol·L-1時(shí)能顯著下調(diào)BEPSCM-BESCs的mRNA表達(dá)水平。濃度為0.5—1.5 nmol·L-1范圍內(nèi)，PlaB均以劑量依賴性上調(diào)CTFR-BESCs和EPSCM-BESCs中多能標(biāo)記基因、及的mRNA表達(dá)水平和蛋白水平。在PlaB濃度為0.5—1.5 nmol·L-1范圍內(nèi)，PlaB以劑量依賴性上調(diào)CTFR-BESCs和EPSCM-BESCs中全能標(biāo)記基因、及的mRNA表達(dá)水平，而下調(diào)和的mRNA表達(dá)水平。CTFR-BESCs中添加PlaB均上調(diào)胚胎細(xì)胞譜系基因的表達(dá)，而EPSCM-BESCs中添加PlaB顯著降低、、等胚胎細(xì)胞譜系基因的表達(dá)，但是對于沒有顯著影響。隨著PlaB劑量增加和處理時(shí)間延長，CTFR-BESCs和EPSCM-BESCs細(xì)胞活力均呈下降趨勢，但CTFR-BESCs比EPSCM-BESCs更敏感。【結(jié)論】PlaB顯著上調(diào)CTFR-BESCs和EPSCM-BESCs中多能標(biāo)記基因和部分全能標(biāo)記基因的表達(dá)；降低EPSCM-BESCs中胚胎細(xì)胞譜系基因的表達(dá)和細(xì)胞活力。PlaB對兩種BESCs發(fā)揮作用的濃度及對基因表達(dá)的影響并不完全一致。由于PlaB降低BESCs的細(xì)胞活力，仍需要進(jìn)一步研究以優(yōu)化培養(yǎng)體系。

牛胚胎干細(xì)胞；Pladienolide B；剪接體；多能性相關(guān)基因；細(xì)胞活力

0 引言

【研究意義】干細(xì)胞是一類具有自我更新和多向分化潛能的細(xì)胞群體，可在體外誘導(dǎo)條件下分化成為多種類型的細(xì)胞。在畜禽上，將多能干細(xì)胞與基因編輯、顯微注射、核移植、胚胎移植等技術(shù)結(jié)合，可應(yīng)用于畜禽育種、瀕危動(dòng)物保種、優(yōu)良種質(zhì)擴(kuò)繁、疾病防治及生物反應(yīng)器等方面，對畜禽生產(chǎn)具有重要的研究價(jià)值和應(yīng)用意義[1]。提高干細(xì)胞的多能性有助于提高早期胚胎發(fā)育的能力，并有助于更有效地生產(chǎn)用于研究和器官移植的嵌合動(dòng)物。【前人研究進(jìn)展】在真核細(xì)胞內(nèi)，大多數(shù)蛋白質(zhì)編碼基因的表達(dá)需要由DNA先轉(zhuǎn)錄為前體RNA（precursor mRNAs，pre-mRNA），再經(jīng)過重要的加工才能產(chǎn)生成熟的mRNA。其中一個(gè)基本環(huán)節(jié)是通過剪接體將非編碼序列（即內(nèi)含子）從pre-mRNA中去除，并連接兩側(cè)的外顯子以形成有功能的mRNA[2-3]。剪接體是一種多巨量核糖核蛋白（RNP）復(fù)合物，由5個(gè)小的核RNA（small nuclear RNAs，snRNAs）組成，分別是U1、U2、U4、U5和U6，每一個(gè)snRNA都與特定的蛋白質(zhì)相關(guān)聯(lián)，產(chǎn)生相應(yīng)的小核核糖核蛋白復(fù)合物（small nuclear ribonucleoprotein complexes，snRNP）[4]。snRNPs依次結(jié)合到pre-mRNA中的順式作用元件，包括5′和3′剪接位點(diǎn)、分支序列和多嘧啶束，通過E、A、B、B*和C預(yù)剪接體復(fù)合物組裝成功能性的剪接體[3]。在細(xì)胞中，剪接體通過選擇性剪接增加單個(gè)基因的表達(dá)數(shù)量，提高蛋白表達(dá)的復(fù)雜性和多樣性，并在胚胎發(fā)育及器官功能行使中發(fā)揮至關(guān)重要的作用。大量研究表明pre-mRNA的異常剪接是造成許多人類疾病發(fā)生和惡化的基礎(chǔ)[5]，亦是早期胚胎發(fā)生滯育的主要原因[6-7]。近年來，人們在牛干細(xì)胞方面開展了大量研究，先后建立了牛胚胎多能干細(xì)胞[8]和牛胚胎擴(kuò)展多能干細(xì)胞[9]。此外，在牛乳腺干細(xì)胞[10]、間充質(zhì)干細(xì)胞[11]等成體干細(xì)胞及誘導(dǎo)多能干細(xì)胞研究方面也取得了一定的進(jìn)展[12]。然而，建立能發(fā)育成完整胚胎的牛全能性干細(xì)胞仍然是一項(xiàng)極具挑戰(zhàn)的工作。越來越多的研究表明剪接體參與干細(xì)胞多能性維持及分化調(diào)控[13-14]。近期的研究發(fā)現(xiàn)，在小鼠ESCs培養(yǎng)中添加剪接體抑制劑Pladienolide B（PlaB）能驅(qū)動(dòng)小鼠ESCs多能性向全能性轉(zhuǎn)變[15]。PlaB是從培養(yǎng)的鏈霉菌工程菌株Mer-11107中分離得到的一種由12個(gè)大環(huán)內(nèi)酯組成的復(fù)合物[16]，與SF3B1結(jié)合以抑制mRNA的剪接活性。然而，在牛多能干細(xì)胞多能性維持及分化上，剪接體抑制劑的功能尚缺乏研究報(bào)道。PlaB在牛胚胎干細(xì)胞中是否存在相似的驅(qū)動(dòng)機(jī)制尚不清楚。【本研究切入點(diǎn)】本研究參考已報(bào)道的兩種牛胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)體系CTFR[8]和EPSCM[9]，建立了兩種不同的牛胚胎干細(xì)胞系，通過在培養(yǎng)液中添加不同濃度的剪接體抑制劑PlaB，分析PlaB對CTFR-BESCs和EPSCM-BESCs細(xì)胞中剪接體、全能因子、多能因子表達(dá)的影響，以及比較PlaB對CTFR-BESCs和EPSCM-BESCs細(xì)胞活力的影響。【擬解決的關(guān)鍵問題】從分子水平上揭示剪接體抑制劑PlaB對牛胚胎干細(xì)胞多能標(biāo)記基因、全能標(biāo)記基因及胚胎細(xì)胞譜系基因表達(dá)的影響，以期為提高牛胚胎干細(xì)胞多能性，優(yōu)化培養(yǎng)體系提供依據(jù)和參考。

1 材料與方法

本試驗(yàn)于2021年上半年在江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧研究所農(nóng)業(yè)農(nóng)村部種養(yǎng)結(jié)合重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室完成。

1.1 試劑

Anti-Nanog（14-5761-80，Ebioscience），Anti-Sox2（sc17320，SantaCruz），Anti-Oct4（sc5279，SantaCruz），mLIF（HY-P7084，MCE），絲裂霉素-C（HY-13316，MCE），PD0325901（S1036，Selleck），CHIR99021（S1263，Selleck），WH-4-023（S7565，Selleck），IWR-1（S7086，Selleck），F(xiàn)BS（SH30396，Hyclone），Matrigel（354277，CORNING），β-巰基乙醇（M 6250，Sigma），Vitamin C（49752-100G，Sigma），Activin A（338-AC，R&D）。高糖DMEM（11965-092），DMEM-F12（11330-032），KnockOut Serum Replacement（A3181502），GlutaMAX（35050-061），非必需氨基酸（11140-050），AF（S006100），Penicilin-Streptomycin（15140-122），TrypLE? Select（12563-029）購自Thermo Fisher Scientific公司；mTeSR?1購自STEMCELL公司；BCIP/NBT堿性磷酸酯酶顯色試劑盒（C3206）購自碧云天生物公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 牛擴(kuò)展多能胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)基配制 牛擴(kuò)展多能胚胎干細(xì)胞的培養(yǎng)基（expanded potential stem cells medium，EPSCM）以mTeSR?1為基礎(chǔ)培養(yǎng)基[9]，具體配制如下：470 mL mTeSR?1，25 mL KnockOut Serum Replacement，5 mL 100×penicillin-streptomycin，0.1 mmol·L-12-mercaptoethanol（Gibco），1 μmol·L-1CHIR99021，0.3 μmol·L-1WH-4-023，5 μmol·L-1IWR-1，50 μg·mL-1Vitamin C，20.0 ng·mL-1Activin A。

1.2.2 牛Primed胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)基配制 牛Primed胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)基（custom TeSR1 base medium supplemented with FGF2 and IWR1，CTFR）以mTeSR1 Medium Without Select Factors為基礎(chǔ)培養(yǎng)基[17]，具體配制如下：470 mL mTeSR?1，25 mL KnockOut Serum Replacement，5 mL 100×penicillin-streptomycin，0.979 mmol·L-1GABA，0.984 μmol·L-1Pipecolic Acid，0.98 mmol·L-1LiCl，20 ng·mL-1FGF2，2.5 μmol·L-1IWR-1。

1.2.3 牛胚胎干細(xì)胞分離及建系 參考Bogliotti YS的方法進(jìn)行牛胚胎干細(xì)胞分離及建系方法[8]。具體為，取擴(kuò)展的牛囊胚（如圖1所示），利用酸性臺(tái)式液處理2 min，脫掉透明帶。用CTFR細(xì)胞培養(yǎng)液將剩余囊胚細(xì)胞清洗干凈，將囊胚細(xì)胞置于鋪好飼養(yǎng)層的細(xì)胞培養(yǎng)板中，添加適量含10 μmol·L-1Y-27632的CTFR培養(yǎng)液于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，24 h后觀察細(xì)胞貼附情況，對于48 h內(nèi)未貼附細(xì)胞團(tuán)，利用30 g無菌針頭按壓細(xì)胞團(tuán)，輔助其貼附。待囊胚貼附并生成Outgrowth后，繼續(xù)培養(yǎng)4—7 d，利用TrypLE? Select消化3—4 min，添加含10% KSR的DMEM F12終止消化，將消化后的細(xì)胞懸液以1 000×離心5 min，棄上清，加入含10μmol·L-1Y-27632的CTFR培養(yǎng)液接種至含MEF飼養(yǎng)層的培養(yǎng)皿中，24 h后培養(yǎng)液更換為CTFR繼續(xù)培養(yǎng)4—6 d，待細(xì)胞克隆密度達(dá)80%匯合度時(shí)，進(jìn)行1﹕5傳代。

1.2.4 飼養(yǎng)層制備 將傳代三代以內(nèi)的原代小鼠胎兒成纖維細(xì)胞（mouse embryo fibroblast，MEF）以106/mL密度接種到細(xì)胞培養(yǎng)板上，添加適量的DMEM培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，等細(xì)胞單層覆蓋培養(yǎng)板時(shí)用濃度為10 μg·mL-1的絲裂霉素C處理3 h，用PBS清洗3遍，加入適量DMEM培養(yǎng)液，置于37℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中備用。

1.2.5 CCK8細(xì)胞活力檢測 將BESCs消化成細(xì)胞懸液，用40 μmol·L-1細(xì)胞過濾器過濾后進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，然后將細(xì)胞以每孔1 000個(gè)鋪于96孔板中，分別添加PlaB濃度為0.5、1及1.5 nmol·L-1的EPSCM培養(yǎng)液和CTFR培養(yǎng)液，每組設(shè)置4個(gè)重復(fù)孔，同時(shí)設(shè)置對照組（含細(xì)胞、培養(yǎng)基、CCK-8 溶液，不含藥物）和空白組（含培養(yǎng)基、CCK-8 溶液，不含細(xì)胞、藥物），分別處理24和72 h。檢測前每孔加入10 μL CCK-8，37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育2 h；用酶標(biāo)儀測定波長在450 nm處的吸光度（OD）值。細(xì)胞存活率=[(As-Ab) / (Ac-Ab)]×100%；As：試驗(yàn)孔吸光度（含細(xì)胞、培養(yǎng)基、CCK-8 溶液和藥物溶液）；Ac：對照孔吸光度（含細(xì)胞、培養(yǎng)基、CCK-8 溶液，不含藥物）；Ab：空白孔吸光度（含培養(yǎng)基、CCK-8 溶液，不含細(xì)胞、藥物）。

1.2.6 熒光定量PCR 根據(jù)NCBI核酸數(shù)據(jù)庫中相應(yīng)基因mRNA的全序列，利用Primer premier 5.0軟件設(shè)計(jì)引物，引物由擎科生物公司合成（引物序列見表1）。Trizol法提取細(xì)胞樣品中的總RNA，紫外分光光度計(jì)檢測RNA質(zhì)量和濃度，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄及熒光定量PCR擴(kuò)增。被檢樣品均重復(fù)3次，取平均值；以GAPDH作為內(nèi)參基因，利用2-△△Ct法計(jì)算各基因的相對表達(dá)量，△Ct = Ct目的基因-Ct內(nèi)參基因，△△Ct= （Ct處理組目的基因-Ct處理組內(nèi)參基因）-（Ct對照組目的基因-Ct對照組組內(nèi)參基因），2-△△Ct表示處理組目的基因的表達(dá)相對于對照組的變化倍數(shù)。

1.2.7 堿性磷酸酶染色 棄掉細(xì)胞培養(yǎng)液，加入DPBS清洗細(xì)胞。加入4%多聚甲醛，室溫固定15 min；棄掉多聚甲醛，用DPBS清洗兩次，每孔加入500 μL的BCIP/NBT染色工作液染液，室溫避光染色15 min至2 h，棄掉染色液；加入DPBS清洗，蒸餾水終止染色，倒置顯微鏡下觀察拍照。

1.2.8 Western Blot 收集PlaB處理48 h 后的BESCs，加入RIPA蛋白裂解液（含1% PMSF）提取總蛋白，BCA 試劑盒測定蛋白濃度，將蛋白濃度進(jìn)行均一化；加入上樣緩沖液（4﹕1）于100℃進(jìn)行變性。取電泳凝膠，將膠板裝入垂直板電泳槽，拔掉梳子加入1×Tris-Gly 電泳緩沖液，點(diǎn)樣，先80 V 電壓電泳30 min，后調(diào)電壓至 120 V，待樣品中溴酚藍(lán)遷移至凝膠最下端時(shí)，結(jié)束電泳；取出凝膠，提前用甲醛浸泡PVDF膜1—2 min，用電轉(zhuǎn)液浸泡濾紙；使用 Bio-Rad 公司的電轉(zhuǎn)儀進(jìn)行轉(zhuǎn)膜；轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，將PVDF膜放入 TBST 溶液洗10 min；加入封閉液室溫封閉1 h，封閉結(jié)束后 TBST洗3次，5 min/次；用一抗稀釋液將一抗稀釋至相應(yīng)比例：GAPDH（1﹕5000），OCT4（1﹕2000），SOX2（1﹕2000），NANOG（1﹕250），一抗4℃孵育PVDF膜過夜；TBST溶液漂洗膜3次，5 min/次；加入二抗室溫下?lián)u床上孵育膜1 h；TBST溶液漂洗膜3次，5 min/次；ECL化學(xué)發(fā)光試劑進(jìn)行顯影。

1.2.9 免疫熒光染色 用500 μL DPBS緩慢清洗細(xì)胞3次，每次5 min。加入200 μL的4%多聚甲醛固定細(xì)胞，室溫放置15—30 min；用DPBS洗細(xì)胞3次，每次5 min；0.5%Triton X-100通透20 min，PBS洗3次，每次5 min；封閉液封閉細(xì)胞1 h；添加一抗（按照一抗稀釋比例進(jìn)行稀釋），4 ℃避光過夜；然后，用PBS清洗3次，每次5 min；添加二抗（按照二抗稀釋比例進(jìn)行稀釋），室溫避光孵育1 h；PBS清洗細(xì)胞3次，每次5 min；DPBS清洗細(xì)胞1次，每次5 min；加200 μL的Hoechst33342避光染色5 min，PBS清洗細(xì)胞，在熒光顯微鏡下觀察拍照。

表1 實(shí)時(shí)熒光定量 PCR分析所用引物

1.2.10 EDU染色 根據(jù)BeyoClickTMEdU-488細(xì)胞增殖檢測試劑盒（碧云天，C0071S）操作說明書對不同處理組的BESCs進(jìn)行增殖檢測。試驗(yàn)步驟簡要如下：將BESCs消化成細(xì)胞懸液，然后將細(xì)胞以每孔10 000個(gè)鋪于24孔板中，分別添加PlaB濃度為0.5、1、1.5 nmol·L-1的EPSCM培養(yǎng)液和CTFR培養(yǎng)液處理24 h。用細(xì)胞培養(yǎng)液1﹕500稀釋EdU（10 mmol·L-1）即可得到2X的EdU工作液，將37 ℃預(yù)熱的2X的EdU工作液（20 μmol·L-1），與培養(yǎng)液以1﹕1的體積比加入24孔板中，使24孔板中的EdU終濃度變?yōu)?X，繼續(xù)孵育細(xì)胞2 h；EdU標(biāo)記細(xì)胞完成后，去除培養(yǎng)液，并加入1 mL 4%的多聚甲醛固定液，室溫固定15 min；去除固定液，每孔用1 mL洗滌液洗滌細(xì)胞3次，每次3 min；去除洗滌液，每孔加入500 μL 0.3% Triton X-100，室溫孵育10 min;去除通透液，每孔用1 mL洗滌液洗滌細(xì)胞2次，每次3 min。每孔加入0.5 mL Click反應(yīng)液，輕輕搖晃培養(yǎng)板以確保反應(yīng)混合物可以均勻覆蓋樣品，室溫避光孵育30 min；吸除Click反應(yīng)液，用洗滌液洗滌3次，每次3 min。吸除洗滌液后，每孔加1X Hoechst 33342溶液1 mL，室溫避光孵育10 min；吸除1X Hoechst 33342溶液；用洗滌液洗滌3次，每次3 min；利用熒光顯微鏡進(jìn)行檢測。

1.2.11 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析 試驗(yàn)中所有數(shù)據(jù)均進(jìn)行3次重復(fù)性檢驗(yàn)，數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，用SPSS 20軟件分析不同處理組間對比用One-Way ANOVA，以＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；本研究數(shù)據(jù)采用GraphPad Prism 7 軟件進(jìn)行作圖。

2 結(jié)果

2.1 牛胚胎干細(xì)胞建系

如圖1所示，牛早期囊胚在MEF飼養(yǎng)層上貼附后（圖1-A），1 d后長出Outgrowth（圖1-B—D）。Outgrowth生長4 d后，進(jìn)行消化傳代，建立牛胚胎干細(xì)胞。免疫熒光染色檢測BESCs多能因子的表達(dá)，結(jié)果表明BESCs中表達(dá)多能因子OCT4、SOX2及NANOG（圖2-A）。對第26代BESCs進(jìn)行畸胎瘤試驗(yàn)，結(jié)果表明BESCs具備生成三胚層的潛力（圖2-B）。對第48代BESCs進(jìn)行核型分析，結(jié)果表明BESCs具備正常核型（2n=60，32/40，80%。圖2-C）。

將建立的牛胚胎干細(xì)胞分別加入CTFR培養(yǎng)液和EPSCM培養(yǎng)液中培養(yǎng)，兩種培養(yǎng)液的成分差異見表2。結(jié)果表明，牛胚胎干細(xì)胞在不同的培養(yǎng)液中呈現(xiàn)出不同的形態(tài)特征。EPSCM-BESCs細(xì)胞排列緊密，呈集落狀生長，克隆呈突起圓頂狀，邊緣遮光性強(qiáng)，與周圍的飼養(yǎng)層細(xì)胞界限分明，形態(tài)類似Na?ve-ESCs（圖3-A，B），而CTFR-BESCs克隆呈扁平狀，形態(tài)類似Primed-ESCs（圖3-D，E），堿性磷酸酶染色均呈陽性（圖3-C，F(xiàn)）。RT-qPCR檢測CTFR-BESCs和EPSCM-BESCs中多能標(biāo)記基因的mRNA表達(dá)，結(jié)果表明，CTFR-BESCs和EPSCM- BESCs中多能標(biāo)記基因的mRNA表達(dá)顯著高于BEF，且EPSCM- BESCs中的多能標(biāo)記基因表達(dá)高于CTFR-BESCs（圖3-G）。CTFR-BESCs和EPSCM- BESCs中胚胎細(xì)胞譜系基因的表達(dá)水平均較低，但CTFR-BESCs中胚胎細(xì)胞譜系基因的表達(dá)水平高于EPSCM-BESCs（圖3-H）。

A. 貼附的囊胚；B. 第一天的Outgrowth；C. 第二天的Outgrowth；D. 第四天的Outgrowth

A. 免疫熒光染色鑒定BESCs多能因子表達(dá)；B. 傳代26代的BESCs用以制備畸胎瘤，HE染色鑒定表明畸胎瘤組織切片包含外胚層（黃色箭頭所指為有髓神經(jīng)）、中胚層（黃色箭頭所指為肌肉細(xì)胞）和內(nèi)胚層（黃色箭頭所指為柱狀上皮細(xì)胞）；C. 傳代48代的BESCs細(xì)胞具備正常核型

A. 4X鏡下EPSCM-BESCs；B. 10X鏡下EPSCM-BESCs；C. EPSCM -BESCs堿性磷酸酶染色；D. 4X鏡下CTFR-BESCs；E. 10X鏡下CTFR-BESCs；F. CTFR-BESCs堿性磷酸酶染色；G. 多能標(biāo)記基因的mRNA表達(dá)情況；H. 胚胎細(xì)胞譜系基因的mRNA表達(dá)情況

2.2 PlaB對BESCs剪接體表達(dá)的影響

分別在培養(yǎng)液中添加不同濃度PlaB培養(yǎng)CTFR-BESCs和EPSCM-BESCs，熒光定量PCR檢測各組BESCs中s各亞基的mRNA表達(dá)水平。結(jié)果如圖4所示，PlaB濃度為0.5—1.5 nmol·L-1時(shí)顯著下調(diào)EPSCM-BESCs中和的mRNA表達(dá)水平；PlaB濃度為1.5 nmol·L-1時(shí)能下調(diào)CTFR中的mRNA表達(dá)；在PlaB濃度范圍為0.5—1.5 nmol·L-1時(shí)，CTFR-BESCs中的呈劑量依賴性上調(diào)；而在EPSCM-BESCs中，PlaB濃度為1 nmol·L-1時(shí)，顯著下調(diào)，其他濃度則無顯著變化。在PlaB濃度范圍為0.5—1.5 nmol·L-1時(shí)，CTFR-BESCs和EPSCM-BESCs的和的 mRNA表達(dá)水平均呈現(xiàn)劑量依賴性增加。此外，PlaB濃度范圍為0.5—1.5 nmol·L-1時(shí)，CTFR-BESCs中的mRNA表達(dá)均顯著下調(diào)。

熒光定量PCR檢測各組BESCs中剪接體的mRNA表達(dá)水平，結(jié)果如圖5所示，PlaB濃度為0.5—1.5 nmol·L-1時(shí)，EPSCM-BESCs和CTFR-BESCs中剪接體的mRNA表達(dá)水平均顯著下調(diào)。PlaB濃度為0.5—1.5 nmol·L-1時(shí)，能顯著下調(diào)CTFR-BESCs的mRNA表達(dá)水平；PlaB的濃度為1—1.5 nmol·L-1時(shí)能顯著下調(diào)EPSCM-BESCs的mRNA表達(dá)水平。PlaB濃度為0.5—1.5 nmol·L-1時(shí)，對EPSCM-BESCs和CTFR-BESCs中的和的mRNA表達(dá)均無顯著影響。

* P＜0.05，** P＜0.01，*** P＜0.001。下同 The same as below

圖5 PlaB對BESCs中剪接體 mRNA表達(dá)的影響

2.3 PlaB對BESCs多能標(biāo)記基因表達(dá)的影響

在PlaB濃度為0.5—1.5 nmol·L-1范圍內(nèi)，PlaB均以劑量依賴性上調(diào)CTFR-BESCs和EPSCM-BESCs中多能標(biāo)記基因、及的mRNA表達(dá)水平（圖6-A—C）；此外，PlaB能顯著上調(diào)EPSCM-BESCs中多能標(biāo)記基因的蛋白表達(dá)水平（圖6-D、E）。

2.4 PlaB對BESCs全能標(biāo)記基因表達(dá)的影響

在PlaB濃度為0.5—1.5 nmol·L-1范圍內(nèi)，PlaB均以劑量依賴性上調(diào)CTFR-BESCs和EPSCM-BESCs中全能標(biāo)記基因、及的mRNA表達(dá)水平，而下調(diào)和的mRNA表達(dá)水平（圖7）。

2.5 PlaB對BESCs胚胎細(xì)胞譜系基因表達(dá)的影響

如圖8所示，CTFR-BESCs中添加PlaB均上調(diào)胚胎細(xì)胞譜系基因的表達(dá)，而EPSCM-BESCs中添加PlaB顯著抑制、、等胚胎細(xì)胞譜系基因的表達(dá)，但是對于沒有顯著影響。

2.6 PlaB對BESCs細(xì)胞增殖的影響

添加不同濃度PlaB培養(yǎng)CTFR-BESCs和EPSCM-BESCs，分別于24和72 h后檢測細(xì)胞活力，結(jié)果如圖9所示。隨著PlaB劑量增加和處理時(shí)間延長，CTFR-BESCs和EPSCM-BESCs細(xì)胞活力均呈現(xiàn)下降趨勢，且PlaB處理時(shí)間延長，CTFR-BESCs和EPSCM- BESCs細(xì)胞活力下降顯著。

3 討論

本研究參考已報(bào)道的兩種牛胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)體系CTFR[8]和EPSCM[9]，分別建立了CTFR-BESCs和EPSCM-BESCs兩種牛胚胎干細(xì)胞系，通過在培養(yǎng)液中添加不同濃度的剪接體抑制劑PlaB，評(píng)估PlaB對CTFR-BESCs和EPSCM-BESCs細(xì)胞中剪接體、多能標(biāo)記基因、全能標(biāo)記基因、胚胎細(xì)胞譜系基因表達(dá)的影響，以及比較PlaB對CTFR-BESCs和EPSCM-BESCs細(xì)胞活力的影響。

3.1 PlaB對牛胚胎干細(xì)胞中剪接體表達(dá)的影響

真核生物細(xì)胞中，mRNA在細(xì)胞核中被轉(zhuǎn)錄合成為前體mRNA（pre-mRNA），再由剪接體完成選擇性剪接，去除內(nèi)含子。在pre-mRNA剪接過程中，剪接體根據(jù)所依賴的底物完成復(fù)合物組裝、催化活化和活性部位重塑，表現(xiàn)出特殊組分和結(jié)構(gòu)動(dòng)力學(xué)，以達(dá)到既能準(zhǔn)確識(shí)別又能靈活選擇pre-mRNA中的反應(yīng)性剪接位點(diǎn)[17-18]。有研究發(fā)現(xiàn)，選擇性剪接是早期胚胎發(fā)育的關(guān)鍵調(diào)控機(jī)制，如U5核心組分EFTUD2在整個(gè)胚胎發(fā)育過程中都有表達(dá)[19]，EFTUD2突變導(dǎo)致小鼠著床前阻滯[20]。然而，剪接體在牛胚胎干細(xì)胞中的作用缺少研究報(bào)道。本研究中，在培養(yǎng)基中添加了不同濃度的SF3B1抑制劑PlaB，發(fā)現(xiàn)PlaB不僅下調(diào)EPSCM-BESCs和CTFR-BESCs中的mRNA水平，還下調(diào)的mRNA表達(dá)水平，且的表達(dá)模式與相似。雖然PlaB下調(diào)了EPSCM- BESCs和CTFR-BESCs中的、表達(dá)，但卻劑量依賴性地上調(diào)了和的mRNA表達(dá)。此外，PlaB顯著下調(diào)CTFR-BESCs中的mRNA表達(dá)。

A—C. 不同濃度PlaB對BESCs多能標(biāo)記因子mRNA表達(dá)的影響；D. 不同濃度PlaB對EPSCM-BESCs多能標(biāo)記因子蛋白表達(dá)的影響；E. 多能標(biāo)記因子蛋白表達(dá)量化結(jié)果

圖7 PlaB對BESCs全能標(biāo)記基因mRNA表達(dá)的影響

圖8 PlaB對BESCs胚胎細(xì)胞譜系基因mRNA表達(dá)的影響

除了SF3Bs亞單元，本研究還檢測了剪接體的其他功能基因的表達(dá)。LSMs蛋白是剪接體U6 snRNP的核心組成部分[21]。LSM4與LSM2、LSM3、LSM8直接參與U6 snRNA的3' 端識(shí)別，參與成熟U6 snRNP復(fù)合物的組裝[22]。在本研究中，PlaB濃度為0.5—1.5 nmol·L-1時(shí)，bEPSCM-BESCs和CTFR-BESCs中的mRNA表達(dá)均顯著下調(diào)。編碼一個(gè)GTP酶，是剪接體U5 snRNP 組成部分的核心模塊。的GDP/GTP狀態(tài)和磷酸化狀態(tài)都有助于剪接體的剪接和拆卸。本研究結(jié)果表明，PlaB的濃度為1—1.5 nmol·L-1時(shí)顯著下調(diào)bEPSCM-BESCs的mRNA表達(dá)水平。PlaB濃度為0.5—1.5 nmol·L-1時(shí)，顯著下調(diào)CTFR-BESCs的mRNA表達(dá)水平；而PlaB濃度為0.5—1.5 nmol·L-1時(shí)，對bEPSCM-BESCs和CTFR-BESCs中的和的mRNA表達(dá)均無顯著影響。以上結(jié)果表明，相同培養(yǎng)體系下，PlaB對SF3B亞基和剪接體關(guān)鍵組分的mRNA表達(dá)影響并不一致。而不同培養(yǎng)體系下，PlaB對剪接體各組分關(guān)鍵基因mRNA表達(dá)的影響也不盡相同。

A—D. CCK8檢測不同處理組的BESCs細(xì)胞增殖情況；E. EDU檢測不同濃度PlaB處理CTFR-BESCs和EPSCM-BESCs 72 h后BESCs的細(xì)胞增殖情況

3.2 PlaB對牛胚胎干細(xì)胞多能性標(biāo)記基因和胚胎細(xì)胞譜系基因表達(dá)的影響

胚胎干細(xì)胞具有多能潛能和自我更新能力，能夠發(fā)育為不同胚層。這些多能性的維持取決于轉(zhuǎn)錄因子、和的表達(dá)水平。，又被命名為或，是第一個(gè)被鑒定為多能性調(diào)控因子的轉(zhuǎn)錄因子[23]。在建立的胚胎干細(xì)胞中，誘導(dǎo)缺失導(dǎo)致自我更新喪失和分化。也是ES細(xì)胞自我更新所必需的。在ES細(xì)胞中的失活導(dǎo)致滋養(yǎng)層形成，及表達(dá)缺失。的過表達(dá)使ES細(xì)胞易于分化。表達(dá)水平的升高可以在不依賴LIF的情況下維持小鼠胚胎干細(xì)胞的自我更新，并使人類胚胎干細(xì)胞無需飼養(yǎng)層細(xì)胞也能生長[24]。此外，已經(jīng)被證明OCT4、SOX2和NANOG形成一個(gè)核心三聯(lián)體，存在相互交叉調(diào)節(jié)，通過自我維持的正反饋來維持多能性狀態(tài)。在小鼠ESCs培養(yǎng)中添加2.5 nmol·L-1PlaB顯著降低小鼠ESCs多能因子的表達(dá)，導(dǎo)致表達(dá)缺失[13]。然而，在本研究中，PlaB濃度為0.5—1.5 nmol·L-1范圍內(nèi)均以劑量依賴性上調(diào)CTFR-BESCs和EPSCM-BESCs中多能因子、及的mRNA表達(dá)水平和蛋白水平。這一結(jié)果的不一致，一方面可能與小鼠ESCs中使用的濃度不同有關(guān)，另一方面也可能是牛ESCs轉(zhuǎn)錄后的剪接調(diào)控有別于小鼠ESCs。添加PlaB上調(diào)BESCs中多能因子表達(dá)的作用機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。

在本研究中，檢測了胚胎細(xì)胞譜系基因的mRNA表達(dá)變化，發(fā)現(xiàn)CTFR-BESCs中添加PlaB均上調(diào)胚胎細(xì)胞譜系基因的表達(dá)，而EPSCM-BESCs中添加PlaB顯著抑制、、等胚胎細(xì)胞譜系基因的表達(dá)。這一差異可能與不同培養(yǎng)體系下BESCs的多能性狀態(tài)差異有關(guān)。這一結(jié)果提示，相比于CTFR，在EPSCM培養(yǎng)體系添加PlaB更有助于抑制BESCs的分化，該結(jié)果為后續(xù)深入優(yōu)化BESCs培養(yǎng)體系提供了參考依據(jù)。

3.3 PlaB對牛胚胎干細(xì)胞全能標(biāo)記因子表達(dá)及細(xì)胞活力的影響

全能性細(xì)胞具有最高的發(fā)育潛力，通常指哺乳動(dòng)物體內(nèi)的受精卵、2細(xì)胞和4細(xì)胞的卵裂球[25]。一直以來，分離和培養(yǎng)能夠產(chǎn)生整個(gè)胚胎的全能性干細(xì)胞是一項(xiàng)非常具有挑戰(zhàn)性的工作。在小鼠ESCs培養(yǎng)中添加2.5 nmol·L-1PlaB顯著上調(diào)小鼠ESCs全能因子、及的mRNA表達(dá)[15]。與其一致的是，在本研究中，PlaB濃度為0.5—1.5 nmol·L-1范圍內(nèi)，PlaB以劑量依賴性上調(diào)CTFR-BESCs和EPSCM-BESCs中、及的mRNA表達(dá)水平；但不同的是，和的mRNA表達(dá)水平下調(diào)。在本研究中，隨著PlaB劑量增加和處理時(shí)間延長，CTFR-BESCs和EPSCM-BESCs細(xì)胞活力均呈現(xiàn)下降趨勢，且PlaB處理時(shí)間延長，CTFR- BESCs和EPSCM-BESCs細(xì)胞活力下降顯著。這一結(jié)果提示，PlaB在時(shí)間、劑量和給藥時(shí)間表上對兩種牛胚胎干細(xì)胞系均有細(xì)胞毒性作用，但CTFR-BESCs比EPSCM-BESCs更敏感。有研究表明，突變導(dǎo)致的mRNA表達(dá)上調(diào)[26]。在本研究中，添加PlaB后，的表達(dá)下降而的mRNA表達(dá)上調(diào)，這與上述研究結(jié)果一致。MDM2靶向結(jié)合腫瘤抑制因子p53，抑制p53活性，參與細(xì)胞周期調(diào)節(jié)、凋亡、分化和基因組穩(wěn)定性調(diào)節(jié)[27-28]。近期的研究表明，小鼠的缺失導(dǎo)致胚胎致死[29]。BTG2是p53的下游因子，作為腫瘤抑制因子，BTG2過表達(dá)導(dǎo)致細(xì)胞生長抑制[30]。與以上研究一致，在本研究中，PlaB導(dǎo)致BESCs中、表達(dá)上調(diào)，而促增殖因子和下調(diào)可能是影響細(xì)胞活力的原因之一。

4 結(jié)論

提高多能干細(xì)胞發(fā)育潛能有助于提高早期胚胎發(fā)育的能力，并有助于更有效地生產(chǎn)用于研究和器官移植的嵌合動(dòng)物。在本研究中，添加PlaB能有效抑制和的mRNA表達(dá)，并影響剪接體其他組分關(guān)鍵基因的mRNA表達(dá)，顯著上調(diào)多能標(biāo)記基因表達(dá)和部分全能標(biāo)記基因表達(dá)，下調(diào)促增殖因子表達(dá)，此外，CTFR-BESCs中添加PlaB均上調(diào)胚胎細(xì)胞譜系基因的表達(dá)，而EPSCM-BESCs中添加PlaB顯著抑制、、等胚胎細(xì)胞譜系基因的表達(dá)。這一結(jié)果提示，相比于CTFR，在EPSCM培養(yǎng)體系添加PlaB更有助于抑制BESCs的分化，然而，由于PlaB影響B(tài)ESCs的細(xì)胞活力，因此，仍需進(jìn)一步研究以優(yōu)化培養(yǎng)體系。

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Effects of Pladienolide B on Expression of Pluripotency Related Genes and Cell Viability of Bovine Embryonic Stem Cells

ZHAO Fang1, DING Qiang1, XIA ShuWen1, GAO YunDong2, LAN GuoCheng3, LIN ZhiPing4, WANG HuiLi, ZHONG JiFeng

1Institute of Animal Science, Jiangsu Academy of Agricultural Sciences/Jiangsu Province Engineering Research Center for Precision Animal Breeding/Key Laboratory of Crop and Animal Integrated Farming, Ministry of Agriculture and Rural Affairs, Nanjing 210014;2Shandong OX Livestock Breeding Co., Ltd, Jinan 250100;3Li Ka Shing Faculty of Medicine, The University of Hong Kong, Hong Kong 999077;4Jiangsu Youyuan Dairy Industry Research Institute Co. Ltd, Nanjing 211100

【Background】 Due to high pluripotency of bovine embryonic stem cells (BESCs), they have important application values in cattle breed conservation, breed selection, and regulation mechanism study of livestock embryo development. However, the studies on the maintenance of pluripotency and differentiation of BESCs are limited, and the regulative mechanism remains unclear.【Objective】The aim of this study was to investigate the effects of different concentrations of Pladienolide B (PlaB) on the expression of pluripotent markers, totipotent markers and embryonic cell-lineage genes as well as the cell viability of BESCs,so as to provide the reference and theoretical basis for improving the developmental potency of BESCs.【Method】Immunofluorescence was used to detect the expression of pluripotent markers of bovine BESCs, and real-time fluorescence quantitative PCR (RT-qPCR) was used to detect the effects of different concentrations of PlaB on the expression of spliceosome, totipotent markers and embryonic cell-lineage genes of BESCs. RT-qPCR and Western Blot were used to detect the effects of different concentrations of PlaB on both mRNA and protein expression of pluripotent markers of BESCs. CCK8 and EDU staining was used to detect the effects of different concentrations of PlaB on the proliferation of BESCs. 【Result】RT-qPCR results showed that the mRNA expression levels ofandnmol·L-1to 1.5 nmol·L-1PlaB; when the PlaB concentration was 1.5 nmol·L-1, the mRNA expressions ofandnmol·L-1to 1.5 nmol·L-1, the mRNA expression levels ofandnmol·L-1to 1.5 nmol·L-1, the mRNA expression of spliceosomeboth in EPSCM-BESCs and CTFR-BESCs were significantly down-regulated. The concentration from 0.5 nmol·L-1to 1.5 nmol·L-1PlaB significantly down-regulated the expression levels ofmRNA in CTFR-BESCs; the mRNA expression ofmRNA was significantly down-regulated in BEPSCM-BESCs with 1 nmol·L-1and 1.5 nmol·L-1PlaB while PlaB concentration from 0.5 to 1.5 nmol·L-1, both the mRNA expression and protein levels of the pluripotent markers,andin CTFR-BESCs and EPSCM-BESCs were up-regulated in a dose-dependent manner. By the concentration range from 0.5 to 1.5 nmol·L-1, PlaB dose-dependently up-regulated the mRNA levels of totipotent markers such as,andandwere down-regulated. The mRNA expression of embryonic cell lineage genes in the CTFR-BESCs were up-regulated while the PlaB was added. The addition of PlaB in EPSCM-BESCs significantly reduced the expression of,,and other embryonic cell lineage genes, but had no significant effect on. The cell viability of CTFR-BESCs and EPSCM-BESCs showed a downward trend with increasing of PlaB dose and treatment time, while CTFR-BESCs was more sensitive than EPSCM-BESCs. 【Conclusion】PlaB significantly up-regulated the expression of pluripotent markers and partial totipotent markers in CTFR-BESCs and EPSCM-BESCs, and the expression of gene lineages and cell viability in EPSCM-BESCs were decreased. The effective concentration and effects on gene expression of PlaB in the two types BESCs were not completely consistent. Due to the inhibiting effect of PlaB on cell viability of BESCs, the further studies were needed to optimize the culture system.

bovine embryonic stem cells; pladienolide B; spliceosome; pluripotency related genes; cell viability

2022-01-20；

2022-09-07

國家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃（2021YFD1200404）、江蘇省自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（BK20221433）、江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院探索性顛覆性創(chuàng)新計(jì)劃項(xiàng)目（ZX（21）1214）、江蘇省農(nóng)業(yè)科技自主創(chuàng)新資金（CX（19）2037）

趙芳，E-mail：zanzi006@163.com。通信作者王慧利，E-mail：wanghuili318@163.com。通信作者仲躋峰，E-mail：zhongjifeng64@sina.cn

10.3864/j.issn.0578-1752.2023.11.012

（責(zé)任編輯 林鑒非）