高效GFPuv熒光篩選基因編輯載體的改造及其在馬鈴薯遺傳轉化中的應用

杜靜雅，陳凱園，普金，周會英，祝光濤，張春芝，杜慧

高效GFPuv熒光篩選基因編輯載體的改造及其在馬鈴薯遺傳轉化中的應用

杜靜雅1,2，陳凱園2，普金2，周會英3，祝光濤3，張春芝2，杜慧

1河南大學生命科學學院，河南開封 475004；2中國農業科學院農業基因組研究所，廣東深圳 518000；3云南師范大學馬鈴薯科學研究院，昆明 650500

【目的】轉基因技術的發展離不開篩選標記的完善與創新，其中的可視化篩選標記在轉基因中的應用越來越廣泛。近年來，經過突變獲得的增強型黃綠熒光蛋白（an enhanced Yellow Green Fluorescent like Protein(eYGFP) under ultraviolet (UV)，eYGFPuv（GFPuv））在365 nm紫外光線下能夠發出強烈且穩定的綠色熒光，便于觀察。構建GFPuv熒光篩選的基因編輯載體，并在馬鈴薯遺傳轉化中進行應用驗證，為GFPuv熒光篩選在馬鈴薯轉化中廣泛應用提供技術支持，同時為后期利用基因組編輯技術創制馬鈴薯雄性不育系奠定基礎。【方法】利用同源重組技術將GFPuv表達框架和基因編輯元件Cas9_sgRNA依次與pCAMBIA2300載體連接，并進行農桿菌介導的煙草瞬時轉化試驗；通過發根農桿菌Ar qual和MSU440轉化馬鈴薯莖段，在便攜紫外燈下觀察，并統計熒光根；利用改造載體構建了6個馬鈴薯花藥發育保守基因的編輯載體，通過發根農桿菌體系轉化2種馬鈴薯材料，驗證轉化效率和編輯效率；利用改造載體對馬鈴薯進行遺傳轉化。【結果】成功構建了GFPuv熒光篩選的基因編輯載體pCAMBIA2300MGFPuv-sgRNACas，瞬時轉化煙草證實GFPuv表達框架能正常表達；2種發根農桿菌的轉化均篩選到綠色熒光的毛狀根，加入卡那霉素（kanamycin，Kan）顯著提高陽性熒光根的比例，2種菌的轉化效率差異不大，但MSU440的發根形成速度更快；6個馬鈴薯花藥發育保守基因的編輯載體在2種馬鈴薯材料中的轉化效率和編輯效率是一致的，但不同靶位點的編輯效率差異較大；改造載體遺傳轉化馬鈴薯證實GFPuv熒光可用于馬鈴薯愈傷組織和再生苗的篩選。【結論】發根農桿菌遺傳轉化體系是基因編輯效率驗證的重要途徑，GFPuv熒光可用于馬鈴薯轉化的篩選。

馬鈴薯；GFPuv；基因組編輯；毛狀根；遺傳轉化

0 引言

【研究意義】隨著轉基因技術的快速發展和完善，人們已成功培育出許多植物新品種，并取得了巨大的經濟和社會效益。這些植物新品種通常經過農桿菌介導法或基因槍轉化法進行目標性狀的改良而獲得。然而，與生物體自身存在的正常細胞相比，遺傳轉化獲得的轉化細胞在生物組織中通常占比較小，競爭力也較弱。因此，必須借助合適的標記將轉化細胞篩選出來，最終獲得陽性轉化株系。【前人研究進展】目前，使用的篩選標記有很多，主要分為抗生素抗性基因篩選[1]、除草劑抗性基因篩選[2]和可視化的報告基因篩選等。其中，可視化報告基因讓看不見摸不著的遺傳轉化變得清晰可見，并且大大減少了轉基因植株篩選的工作量，可以在低成本的前提下顯著提高遺傳轉化的篩選效率。常見的可視化報告基因有β-葡萄糖苷酸酶（β-glucuronidase，GUS）基因[3-4]、熒光素酶（luciferase，LUC）基因[5]、紅色熒光蛋白（the red fluorescent protein identified insp.，DsRed）基因[6]和綠色熒光蛋白（green fluorescent protein，GFP）基因[7]等。其中，和報告基因需要借助化學試劑進行顯色觀察，對植物組織損害是不可逆的，很難在組織培養過程中進行觀察篩選；而DsRed和GFP可以借助熒光顯微鏡進行觀察，不會破壞植物樣品，但所需的熒光顯微鏡價格比較昂貴，且難以在整體植株水平上進行觀察。2017年，日本科學家將源自的類黃色GFP蛋白（yellow green fluorescent like protein，YGFP）進行突變，鑒定到一種在365 nm紫外光下具有很強熒光的eYGFPuv（下文簡稱GFPuv），該蛋白比YGFP的熒光強度增加24倍[8]。隨后，該團隊將GFPuv遺傳轉化矮牽牛，獲得了具有強烈、穩定綠色熒光的轉基因植株，該植株在紫外光下裸眼即可觀察，不需要高靈敏度成像設備或特殊成像條件；同時，轉基因植株經紫外光照射而不受損傷，發出的熒光也不會衰減[9]。因此，認為GFPuv用作轉基因的可視化標記，將會比GFP有更好的前景。馬鈴薯營養全面，種植周期短、產量高，同時適應性強，是世界第三大糧食作物。目前，大多數栽培馬鈴薯是同源四倍體，基因組高度復雜，育種周期長，同時以塊莖進行繁殖，存在繁殖系數低、易攜帶病蟲害等問題[10]。為了徹底解決馬鈴薯生產中的這些問題，國內外科學家開展了以種子進行繁殖的二倍體馬鈴薯育種工作，并取得了突破性的進展[11-13]。然而，馬鈴薯雜交制種需要耗費大量的人力物力，同時還存在去雄不完全造成種子混雜的問題。如果能夠選育出馬鈴薯雄性不育系，將徹底解決雜交制種的去雄問題，降低種子生產成本。目前，馬鈴薯育性相關研究報道還較少，擬南芥、水稻和玉米中的研究較多[14-15]。它們花藥發育的遺傳調控網絡也比較明晰，具有類似的花藥發育時期，其中一些關鍵調控基因在不同物種也非常保守[16]。因此，可以借鑒這些物種的研究結果，開展馬鈴薯育性相關的研究。【本研究切入點】雖然已經有不少四倍體和二倍體馬鈴薯材料建立了成熟的轉基因體系[17-20]，但在轉基因篩選中還經常存在嵌合體，增加了后期檢測的工作量，尤其是基因編輯株系的檢測。實驗室前期使用的pKSE402基因編輯載體采用GFP進行陽性株系篩選，但GFP熒光在馬鈴薯陽性株系的地上部分中很難觀察到熒光，只有部分根中能觀察到微弱的熒光，對轉基因株系的篩選效果較差。【擬解決的關鍵問題】本研究使用pCAMBIA2300作為載體骨架改造了一個高效GFPuv熒光篩選的基因編輯載體；同時，選取一些花藥發育的保守基因，通過序列比對找到馬鈴薯中的同源基因，分別設計它們的靶位點，利用改造的編輯載體在馬鈴薯發根體系中驗證基因組編輯的效率；最后將改造的編輯載體遺傳轉化馬鈴薯，驗證GFPuv在馬鈴薯轉基因中的篩選效果，為GFPuv熒光篩選在馬鈴薯轉化中廣泛應用提供技術支持，同時為后期利用基因組編輯技術創制馬鈴薯雄性不育系奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

所用二倍體馬鈴薯材料PG6359和二倍體馬鈴薯自交系A056的無菌苗由中國農業科學院農業基因組研究所雜交馬鈴薯育種課題組保存；載體改造所用的框架載體pCAMBIA2300同樣由本課題組保存，pKSE402和pCBC_DT1T2由中國農業大學陳其軍老師提供，GFPuv表達框架由金斯瑞生物科技股份有限公司合成后連入pUC57載體；感受態細胞DH5α、GV3101、Ar qual和MSU440購買自上海唯地生物技術有限公司。

1.2 載體改造與構建

1.2.1 GFPuv熒光篩選基因編輯載體的構建 首先，以原始載體pCAMBIA2300為模板，使用引物CZ1擴增載體全長序列（表1），進一步使用諾唯贊ClonExpress Ⅱ One Step Cloning Kit克隆試劑盒（C112-01）進行重組連接，通過挑取單克隆和一代測序獲得Ⅰ酶切位點突變的載體pCAMBIA2300M。其次，利用Ⅺ對pCAMBIA2300M載體進行單酶切，然后使用引物CZ2從pUC57載體上擴增合成的GFPuv表達框架35Sp-GFPuv-HSPT878，進一步使用ClonExpressⅡOne Step Cloning Kit克隆試劑盒進行重組連接，并通過對單克隆進行測序獲得pCAMBIA2300MGFPuv。最后，以pKSE402載體為模板，利用引物CZ3擴增Cas9表達框和sgRNA表達框，同時使用HⅠ和Ⅰ對pCAMBIA2300MGFPuv進行雙酶切，最后利用ClonExpressⅡOne Step Cloning Kit克隆試劑盒進行重組連接，獲得pCAMBIA2300MGFPuv-sgRNACas載體。

表1 載體構建引物名稱和序列

小寫加粗的堿基是同源重組接頭序列，下劃線的堿基是靶位點或其互補序列

The bases in bold and lowercase are homologous recombination splice sequences, and the underlined bases are target sites or their complementary sequences

1.2.2 雄性不育系列基因編輯載體的構建 根據Jiang等[16]研究報告，選擇擬南芥、水稻和玉米花藥發育中的保守基因、、、和，以它們的氨基酸序列進行同源比對，在馬鈴薯基因組中找到其對應的同源基因、、、、和（其中，在馬鈴薯中找到2個相似度比較高的基因，依次編號為和）。利用CRISPRdirect在線分析網站（https://crispr.dbcls.jp/）分別對這6個基因進行sgRNA設計，以DM6.1為參考基因組，每個基因設計2個靶點；將設計好的第一個靶點替換DT1F（5′- tcgaagtagtgattgGTTTTAGAGCTAGAAATAGC-3′）中的N，將第二個靶點反向互補替換DT2R（5′-ttctagctctaaaacCAATCTCTTAGTCGACTCTAC-3′）中的N，具體的引物序列見表1。分別使用上述設計的重組引物StAMSCZ、StDYT1CZ、StMS1aCZ、StMS1bCZ、StMYB80CZ和StTDF1CZ，以pCBC- DT1T2中間載體為模板進行片段擴增；同時，使用Ⅰ酶切pCAMBIA2300MGFPuv-sgRNACas基因編輯載體，最后利用ClonExpressⅡOne Step Cloning Kit克隆試劑盒進行將上述擴增片段重組到編輯載體中，構建6個馬鈴薯雄性不育保守基因的雙靶編輯載體。

1.3 煙草瞬時轉化

將上述構建好的pCAMBIA2300MGFPuv-sgRNACas載體熱激轉化農桿菌GV3101，挑取單克隆至5 ml含有卡那霉素（kanamycin，Kan）和利福平（rifampicin，Rif）的LB液體培養基中，28 ℃ 220 r/min過夜培養。當OD600達到0.6—0.8時，4 000 r/min離心10 min收集菌體，用瞬時轉化液（1/2 MS溶液含10 mmol·L-1MES，200 μmol·L-1AS）重懸菌體，使最終OD600值為0.5，室溫放置3 h。使用去除針頭的1 ml注射器通過指壓法在本氏煙草葉片的背面注射上述菌液。暗培養36 h后，在365 nm便攜式紫外燈下檢測煙草葉片的GFPuv熒光信號。

1.4 馬鈴薯毛狀根轉化

首先將構建好的載體轉化發根農桿菌MSU440或Ar qual，提取單克隆于含有Kan的LB液體培養基進行培養，并進行甘油保菌，于-80 ℃保存。在進行遺傳轉化前，取出菌株進行劃線活化，然后挑取部分菌落于含有Kan的LB液體培養基中進行過夜培養；當OD600達到0.6—0.8時，離心收集菌體，再用MS30液體培養基稀釋至OD600為0.5，加入AS至終濃度為40 mg·L-1。選取培養4—5周的馬鈴薯無菌苗，切出適量0.5—1 cm的莖段，用侵染液常溫侵染10 min；侵染完成之后在無菌濾紙上晾干莖段，將莖段轉移至鋪有無菌濾紙的MS30固體培養基上，25 ℃暗培養48 h。將暗培養結束的莖段轉到含相應抗性和200 mg·L-1特美汀（Timentin，TMT）的MS30培養基上進行生根培養，每個培養皿擺放約20個莖段。培養20 d后，可以觀察到大量毛狀根長出，統計每皿放置的莖段數和毛狀根數目，同時，將培養皿放置在紫外燈下觀察統計熒光根的數目，并取一些熒光根放置在離心管中用于后續檢測。

1.5 馬鈴薯遺傳轉化

參考葉明旺等[19]二倍體馬鈴薯遺傳轉化方法，取4周苗齡的PG6359無菌苗，切取不帶腋芽的莖段，擺放于A1預培養基，光照培養48 h。將上述pCAMBIA2300MGFPuv-sgRNACas轉化GV3101的菌株進行活化和搖菌，侵染液制備參考上述毛狀根遺傳轉化步驟，將預培養結束后的莖段置于侵染液中10—15 min，期間不斷搖晃；去除侵染液并用無菌濾紙吸干莖段表面的菌液，將莖段轉至鋪了一張無菌濾紙的A2共培養基，25 ℃暗培養48 h。暗培養結束后的莖段置于分化培養基（shoot inducing medium 2，SIM2）上繼續培養，每兩周更換一次SIM2培養基，當愈傷組織分化出芽時，將芽剪下移至生根培養基（root inducing medium，RIM）中。

1.6 馬鈴薯熒光根和陽性株系的分子鑒定

在紫外燈下挑出的熒光根單獨放在1.5 ml EP管中，采用TPS（提取液包含Tris-HCl、Potassium Chloride（KCl）和EDTA 3種組分）法提取基因組DNA。為了進一步確定T-DNA是否插入到馬鈴薯基因組上，使用Cas-sgRNA區域的特異引物U626-IDF1（5′-TGTCCCAGGATTAGAATGATTAGGC-3′）和Cas9-35S-R（5′-GCTCCACCATGTTGACCTGC-3′）進行PCR，反應體系為6.0 μL 2×Rapid Taq Master Mix、1.0 μL 10 μmol·L-1引物、2 μL基因組DNA和3 μL ddH2O。反應條件為94 ℃ 5 min；94 ℃ 15 s，58 ℃ 20 s，72 ℃ 1 min，35個循環；72 ℃ 5 min，16 ℃ 5 min。PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳后拍照。

根據每個基因的靶點位置在兩端設計靶位點檢測引物（表2）。PCR體系和程序如上所述，取5 μL進行瓊脂糖凝膠電泳檢測。根據電泳結果，選出沒有大片段的缺失的樣品，將對應的靶點擴增產物稀釋200倍，參考Hi-TOM測序流程設計每個靶基因對應的Hi-TOM測序引物（表2）[21]，進行二次擴增，PCR體系和程序同上，同樣取5 μL進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，剩余樣品每個取5 μL，每6個樣品混合成1管，每個靶基因編輯的2種材料PG6359和A056分別混6管。將混合好的樣品裝在96孔PCR板，送交中國農業科學院水稻研究所進行Hi-TOM測序，每個樣品的測序深度是2 000×，根據參考序列分析每個樣品的突變類型，并將所有變異類型的比例合并，計算出每個靶點在不同材料中的平均突變率。

表2 靶點檢測引物

小寫加粗的堿基是Hi-TOM測序的通用接頭引物

The bases in bold and lowercase are the universal connector primer of Hi-TOM sequencing

通過生根和熒光篩選，獲得的轉基因株系同樣采用TPS法提取基因組DNA，使用GFPuv-F（5′-GAG TTGGTTGGAGGTGGAGTTGG-3′）和GFPuv-R（5′- GAGTCTCTTCAACCCTTCTATGTG-3′）進行PCR，具體PCR體系和程序同上述發根檢測。

2 結果

2.1 GFPuv熒光篩選的基因編輯載體改造

為了構建一個可以通過GFPuv熒光進行轉基因篩選的基因編輯載體，選擇pCAMBIA2300為骨架載體（圖1-A）。通過PCR擴增和無縫克隆獲得Ⅰ酶切位點突變的載體pCAMBIA2300M（圖1-B）。利用無縫克隆技術將GFPuv表達框架35Sp-GFPuv- HSPT878與pCAMBIA2300M載體連接，獲得載體pCAMBIA2300MGFPuv（圖1-C）。最后，同時擴增pKSE402載體的Cas9表達框和sgRNA表達框，使用無縫克隆技術與pCAMBIA2300MGFPuv載體連接，獲得可用于GFPuv熒光篩選的基因編輯載體pCAMBIA2300MGFPuv-sgRNACas（圖1-D）。為了確認GFPuv表達框是否可以正常使用，將pCAMBIA2300MGFPuv-sgRNACas載體轉化農桿菌GV3101，通過瞬時注射轉化本氏煙草葉片，可以在紫外光下清晰地觀察到熒光（圖1-E—F）。因此，認為所構載體pCAMBIA2300MGFPuv-sgRNACas的GFPuv表達框能正常表達，可用于植物遺傳轉化的熒光篩選。

2.2 不同發根農桿菌發根效率的比較

為了確認所構建載體是否可以正常侵染馬鈴薯，采用試驗周期較短的發根農桿菌轉化體系進行驗證。Butler等[22]在進行馬鈴薯發根再生研究時發現不同發根農桿菌的轉化效率存在較大差異。因此，將空載體pCAMBIA2300MGFPuv-sgRNACas分別轉化實驗室常用的2種發根農桿菌Ar qual和MSU440進行發根轉化效率的比較。同時，為了確定Kan篩選是否會提高轉化效率，將2種發根農桿菌侵染過的A056莖段分別轉移至加入50 mg·L-1Kan和不加Kan的MS30培養基進行光照培養，每種處理120個左右的莖段，分別放置在6個培養皿上。MSU440菌株侵染的莖段于7 d左右在愈傷組織處產生毛狀根，Ar qual菌株在12 d開始有毛狀根出現，20 d左右2個菌株產生的毛狀根可以布滿整個培養皿（圖2-A），在黑暗和熒光燈下可以看到部分毛狀根發出綠色熒光（圖2-B）。統計發現，在同種類型培養基上，不同菌株侵染的莖段所產生熒光根的數目沒有明顯差異（圖2-C），并且不同菌株產生的熒光根占總根數的比例也無差異（圖2-D），但加入Kan可以顯著提高每個莖段產生熒光根的數目和熒光根在毛狀根中的比例。因此，認為MSU440和Ar qual誘導馬鈴薯產生毛狀根的效率差異不明顯，但加入Kan篩選可以顯著提高陽性熒光根產生的比率。此外，MSU440誘導毛狀根產生更快一些，因此，后續將使用MSU440進行下一步研究。

2.3 GFPuv熒光篩選編輯載體在馬鈴薯毛狀根中編輯效率的驗證

為了驗證所構載體pCAMBIA2300MGFPuv- sgRNACas在不同材料中的轉化效率和編輯效率，利用馬鈴薯毛狀根轉化體系對馬鈴薯中6個花藥發育相關基因、、、、和進行編輯。每個基因設計2個靶點，分別構建它們的雙靶編輯載體pCAMBIA2300MGFPuv- sgRNACas-StAMS、pCAMBIA2300MGFPuv-sgRNACas- StDYT1、pCAMBIA2300MGFPuv-sgRNACas-StMS1a、pCAMBIA2300MGFPuv-sgRNACas-StMS1b、pCAMBIA2300MGFPuv-sgRNACas-StMYB80和pCAMBIA2300MGFPuv-sgRNACas-StTDF1；將這些載體分別轉化發根農桿菌MSU440，并轉化純合二倍體自交系A056和雜合二倍體材料PG6359，每個基因分別轉化2種材料各100個左右的莖段，放置在含50 mg·L-1Kan的MS30培養基上進行光照培養，20 d后進行毛狀根的觀察統計（圖3-A）。除了，其余5個編輯載體轉化A056和PG6359產生熒光根的效率基本一致；同時發現所有6個編輯載體在2種材料產生的毛狀根中熒光根的占比也無明顯差異（圖3-B）。表明相同GFPuv熒光篩選編輯載體在2種類型材料中的轉化效率差異不大。

A：pCAMBIA2300原始載體示意圖；B：pCAMBIA2300M是pCAMBIA2300突變BsaⅠ酶切位點后的載體示意圖；C：pCAMBIA2300MGFPuv是pCAMBIA2300M加入GFPuv表達框架示意圖；D：pCAMBIA2300MGFPuv-sgRNACas是pCAMBIA2300MGFPuv加上Cas9和sgRNA的示意圖；E和F是瞬時轉化的煙草植株，其中，E是明場下照片，F是黑暗條件在便攜紫外燈下的照片，比例尺是1 cm

A和B是馬鈴薯莖段產生毛狀根的照片，A是明場下照片，B是黑暗條件在便攜紫外燈下的照片，比例尺是1 cm；MSU440和Ar qual在不加和加入50 mg·L-1 Kan條件下，每個莖段產生熒光根的數目（C）和熒光根占產生的總毛狀根的比例（D）；試驗重復7次，誤差線代表生物學重復之間的標準差，誤差線頂部的小寫字母代表圖基多重比較所得的顯著差異（P＜0.05）

為了確認這些編輯載體在毛狀根中的編輯效率，分別從每個載體轉化的2種材料中隨機選取48條熒光根提取基因組DNA。首先使用載體Cas9-sgRNA區域的特異引物進行擴增，發現所有熒光根均能擴出條帶，表明紫外燈下篩選出來的熒光根均為陽性。進一步使用每個靶基因對應的靶點檢測引物擴增靶向區域，電泳結果顯示，部分熒光根出現大片段缺失，但每個靶基因的大片段缺失的數目并不相同（圖4和表3）。初步表明，每個靶基因的2個靶點均可進行編輯，但編輯效率存在差異。最后，挑選出沒有大片段缺失株系，使用包含Hi-TOM接頭的靶點擴增引物進行二次擴增，并進行混合測序和突變分析。結果顯示，大部分靶點均可以發生編輯，并且存在多種變異類型，但大部分變異是缺失突變（deletion），缺失長度為1—45 bp，插入突變的長度主要是1 bp（圖5）。統計每個靶點的平均突變率發現，不同靶點的突變率差異較大，但相同靶點在A056和PG6359中的突變率差異較小（表4）。因此可以說，突變效率主要受靶點選擇的影響，受不同遺傳背景的影響相對較小。

2.4 GFPuv熒光篩選載體在馬鈴薯遺傳轉化篩選中的應用

在馬鈴薯毛狀根轉化體系中，通過GFPuv熒光蛋白篩選能夠高效準確地鑒定出陽性根。為了進一步確定GFPuv是否可以在馬鈴薯常規轉基因中用于篩選陽性愈傷和陽性苗，將構建的GFPuv熒光篩選載體pCAMBIA2300MGFPuv-sgRNACas遺傳轉化二倍體材料PG6359。分化培養1個月左右的莖段可以看到較大的愈傷組織（圖6-A），在紫外燈下看到部分愈傷組織有綠色熒光（圖6-B）。經過分化和生根培養，獲得2株轉基因株系，PCR檢測發現均為陽性株系（圖6-C），在紫外燈下可以看到轉基因苗發出綠色熒光（圖6-D—E和圖6-G—H），而非轉基因株系在紫外燈下是紅色的（圖6-F和圖6-I）。進一步經過PCR鑒定證實這些熒光苗均是轉基因陽性株系。表明GFPuv熒光蛋白可以在馬鈴薯遺傳轉化的分化和生根階段進行陽性愈傷和陽性苗的篩選。

6個馬鈴薯花藥發育相關基因StAMS、StDYT1、StMS1a、StMS1b、StMYB80和StTDF1對應的編輯載體轉化A056和PG6359，每個莖段產生熒光根的數目（A）和熒光根占產生的總毛狀根的比例（B）。試驗重復5次，誤差線代表生物學重復之間的標準差；ns代表T檢驗無差異，**代表T檢驗所得的極顯著差異（P＜0.01）

紅色框代表純合大片段缺失株系，白色框代表雜合大片段缺失株系

表3 熒光根的基因編輯位點PCR鑒定的統計分析

圖5 StMS1a的一個Hi-TOM測序結果展示

A、B：分化階段的馬鈴薯莖段；C：轉基因的PCR鑒定，其中1、2是陽性株系，質粒是轉基因用的pCAMBIA2300MGFPuv-sgRNACas載體，對照是非轉基因株系；D、G：轉基因陽性株系1；E、H：轉基因陽性株系2；F、I：非轉基因對照。A和D—F是明場下照片，B和G—I是黑暗條件在便攜紫外燈下的照片，比例尺是1 cm

3 討論

3.1 毛狀根轉化體系是植物基因編輯靶點驗證和遺傳轉化的重要途徑

本研究在馬鈴薯毛狀根轉化體系中，使用GFPuv熒光蛋白篩選的基因編輯載體對馬鈴薯6個花藥發育相關基因、、、、和進行編輯，結果顯示，相同靶點在不同馬鈴薯材料中的編輯效率差異不明顯，但不同靶點的編輯效率差異較大。因此，認為馬鈴薯材料的差異對基因編輯效率不會造成影響，而基因編輯成功的關鍵是靶位點的選擇。然而，靶位點通常是利用網站進行預測選擇，但預測靶點的具體編輯效率需要通過遺傳轉化才能獲悉。對于遺傳轉化周期長、轉化效率低的物種，編輯效率更加需要驗證，但通過遺傳轉化驗證是不現實的。毛狀根轉化體系操作簡單、周期較短，通常20 d左右就可以產生大量的毛狀根，目前，已經有很多植物建立了毛狀根轉化體系，并且用于基因編輯的靶點驗證[23]，因此，毛狀根轉化體系將是植物基因編輯靶點驗證的重要途徑。此外，有研究者在馬鈴薯中通過毛狀根再生獲得了基因編輯的植株，這一結果為馬鈴薯提供了新的遺傳轉化途徑[22]。與此同時，朱健康團隊在非無菌條件下切割植物根莖交界處，使用發根農桿菌侵染傷口，獲得陽性根后再培養產生轉化植株，利用該轉化體系在一些很難或不可能轉化的植物（橡膠草、小冠花、甘薯、臭椿、遼東楤木和重瓣臭茉莉）上獲得了轉化植株，然而，這個毛狀根再生體系目前僅在部分具有根吸吮能力的植物上進行了驗證，未來通過操縱植物的根吮吸能力將會用于更多物種的遺傳轉化和基因編輯[24]。

3.2 GFPuv熒光在植物遺傳轉化的輔助篩選中具有諸多優點

轉基因技術已經成為植物功能研究的基本手段，同時也是作物遺傳改良的重要途徑。轉基因技術的發展離不開篩選標記的更新迭代，其中的可視化報告基因讓轉基因篩選更加高效便捷。GFP作為可視化報告基因，已經在動植物及微生物檢測基因轉化效率中被廣泛應用，同時也用于亞細胞定位、轉基因表達分析等分子生物學研究[25]。GFP熒光可以在不破壞轉化細胞狀態的情況下進行觀察，因此，被廣泛用于植物遺傳轉化效率評估和轉化細胞篩選。然而，在遺傳轉化中GFP篩選存在許多問題，一些轉基因材料的熒光僅能被觀察到幾天，一些物種的葉綠色素自發熒光、色素積累會影響GFP的觀察，同時較老葉片中GFP熒光會發生淬滅[26]。中國農業科學院農業基因組研究所雜交馬鈴薯育種課題組用包含GFP篩選標記的pKSE402基因編輯載體轉化馬鈴薯，僅在發根中能觀測到不是特別明顯的熒光，獲得的陽性株系觀察不到熒光。此外，有學者利用GFP作為篩選工具，在馬鈴薯基因組中檢測基因編輯效率，所獲得的陽性株系僅能在葉片背面觀察到微弱的熒光[27]。然而，本研究經過改造獲得一個包含GFPuv熒光標記的基因編輯載體，該載體在馬鈴薯毛狀根轉化體系中可以清晰地觀察到綠色熒光根，同時轉化馬鈴薯莖段可以觀察到綠色熒光愈傷組織，綠色熒光愈傷再生獲得的陽性株系在紫外燈下可以觀察到整株水平的穩定熒光。推測可能是馬鈴薯的組織結構不會影響GFPuv熒光的觀察，因此認為GFPuv熒光是馬鈴薯遺傳轉化中比較好用的可視化標記。此外，本研究所用含GFPuv的載體瞬時轉化煙草時，同樣可以觀察到強烈的熒光信號，該結果與Yuan等[28]結果一致。他們將GFPuv蛋白在2種草本植物（擬南芥和煙草）和2種木本植物（楊樹和柑橘）中進行瞬時和穩定轉化，所獲轉化株系均能觀察到明亮的熒光；同時轉基因植株在完整植株水平下的可視化也非常穩定，但GFPuv的表達不會影響植株的正常生長發育[28]。普通GFP與GFPuv的發射光波長均是510 nm左右，普通GFP的激發光波長通常是500 nm左右。然而，GFPuv的激發光波長是398 nm，在365 nm的便攜紫外手電筒下就可以被觀察到，所需的觀測設備價廉易獲取[8-9, 28]。基于這些特性，GFPuv在遺傳轉化的輔助篩選中的應用將會更加廣泛。

4 結論

GFPuv熒光是一種新型的可視化篩選標記，可用于馬鈴薯的發根轉化和常規轉基因的篩選，同時發現發根農桿菌遺傳轉化體系是基因編輯靶點效率驗證的重要途徑。

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The Modification of Gene Editing Vector for Efficient GFPuv Fluorescence Screening and Its Application in Potato Genetic Transformation

Du Jingya1,2, Chen Kaiyuan2, Pu Jin2, Zhou Huiying3, Zhu Guangtao3, Zhang Chunzhi2, Du Hui

1College of Life Sciences, Henan University, Kaifeng 475004, Henan;2Agricultural Genomics Institute, Chinese Academy of AgriculturalSciences, Shenzhen 518000, Guangdong;3Joint Academy of Potato Sciences, Yunnan Normal University, Kunming 650500

【Objective】The improvement and innovation of screening markers contributes to the development of transgenic technology, among which the visual screening markers are widely modified for better effect. Recent studies revealed that an enhanced Yellow Green Fluorescent like Protein (eYGFPuv (GFPuv)) obtained by mutation can emit strong and stable green fluorescence under 365 nm UV light irradiation and be easily observed. Constructing the gene editing vector with GFPuv fluorescence screening marker and carrying out experiment application and verifications in potato genetic transformation will provide technical support for the screening of positive transgenic plants in potato transformation, and lay the foundation for using genome editing technology to create potato male sterile lines in the future. 【Method】By using homologous recombination, the GFPuv expression framework and gene editing element Cas9_sgRNA were successively recombined into pCAMBIA2300 vector, and then with this new designed vector the-mediated transient expression assay was conducted in tobacco plants. Six editing vectors with potato anther development conservative genes were constructed using this modified vector. Thestrains Ar qual and MSU440 harbouring these vectors were transformed into the potato stem segments respectively, and then the-induced hairy roots with green fluorescence were observed and counted under the portable UV lamp. The transformation efficiency and editing efficiency of these vectors were analyzed using hairy root transformation system in two different potato genotypes. In the end, the modified vectors were applied to produce transformed potato plants with modifications on target genes. 【Result】A novel gene editing vector pCAMBIA2300MGFPuv-sgRNACas harbouring a GFPuv fluorescence marker was successfully constructed, and the transient transformation in tobacco plants confirmed that the GFPuv expression framework was expressed successfully. The hairy roots with green fluorescence were screened after the transformation with two kinds of, and an additional supplement of kanamycin (Kan) significantly increased the proportion of positive fluorescent roots. Although the transformation rates of the two strains were not significantly different, the hairy roots of MSU440 formed faster. Furthermore, the transformation rates and editing rates of editing vectors for six potato anther development conservative genes in two different potato genotypes were the same, but the editing rates of six target sites differed significantly. Potato genetic transformation using the modified vector confirmed that GFPuv fluorescence could be used for the screening of transgenic callus and plants in potato. 【Conclusion】The hairy root transformation system mediated byis an essential approach to verifying the efficiency of gene editing, and GFPuv fluorescence can be used in the screening of transgenic plants in potato transformation.

potato; GFPuv; genome editing; hairy root; genetic transformation

2023-02-07；

2023-04-07

國家重點研發計劃政府間國際科技創新合作專項（2019YFE0120500）、中國博士后科學基金面上項目（2021M700168）、云南自然科學研究計劃杰出青年項目（202001AV070003）、中央引導地方科技發展資金（23ZYQJ304）

杜靜雅，E-mail：DuJingyaa@outlook.com。通信作者杜慧，E-mail：duhui01@caas.cn

10.3864/j.issn.0578-1752.2023.11.015

（責任編輯 李莉）